CN117413824A - 一种用于tct样本的保存液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于TCT样本的保存液，涉及脱落细胞保存液技术领域，包括缓冲液、核酸酶抑制剂、防腐剂和盐类物质，缓冲液包括质量浓度为1％‑10％乙酸缓冲液、质量浓度为5％‑30％乙酸钠缓冲液、质量浓度为1％‑10％柠檬酸缓冲液；核酸酶抑制剂包括质量浓度为0.1％‑1％EDTA；防腐剂包括质量浓度为0.5％‑5％Biocare GPL；盐类物质包括质量浓度为0.1％‑2％氯化钠。本发明液配置方法简单，成本可控，既可用于HPV检测，也可用于巴氏染色，同时也可兼顾后续可能的免疫组化染色。该脱落细胞保存液可以长时间稳定保存宫颈脱落细胞及其核酸，提高HPV检测率，降低假阴性，具有非常高的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于脱落细胞保存液技术领域，具体涉及一种用于TCT样本的保存液。
背景技术
宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，位居女性恶性肿瘤第二位，严重危害女性生命健康。目前宫颈癌的筛查包括宫颈细胞学检测及人类乳头状瘤病毒(HPV)检测。
全球范围的研究结果显示,将HPV用作检测宫颈癌的指标可提高诊断准确率，保证患者得到最及时的治疗。在临床上根据HPV不同亚型的致病力大小将HPV分为高危型、中危型和低危型三大类。
液基细胞学技术是将细胞收集于保存液中以维持细胞形态，然后通过自动化检测系统技术制备细胞涂片并进行细胞学检测的过程，液基细胞学技术具有代表性的便是TCT(ThinPrep Cytology Test)，该技术提高了宫颈异常细胞的检出率，能够检测出更多的癌前病变，已被广泛应用于宫颈癌筛查。
无论是对于HPV核酸检测还是细胞学检测，宫颈脱落细胞的保存都至关重要，否则会影响后续检查的结果。国内外许多厂家已经研发出多种宫颈细胞保存液以便于保存细胞，保证细胞的DNA以及HPV DNA的完整性。但市场上的我们所熟知的保存液能够很好地保存细胞结构，但对于HPV核酸的保存存在一定不足，或可很好的保存核酸，但对细胞结构的保存效果不佳。
如中国专利CN114467914B公开一种细胞保存液及其制备方法和应用：一种细胞保存液，其中甲醇、乙醇为固定剂，可以快速对细胞进行固定，能够有效地保留细胞的形态结构，有助于核酸的稳定性保存，以便更好地检测细胞。EDTA·2Na为抗凝剂，能够有效防止细胞堆积，便于细胞分散。KH2PO4和NaOH构成本发明细胞保存液的缓冲体系，该发明采用特定的缓冲体系KH2PO4-NaOH缓冲液，能够保持细胞保存液的pH值稳定，以便维持细胞形态，KCl或NaCl为渗透压维持剂，能够调节细胞保存液内Na+、K+浓度以调节溶液的渗透压，从而有效维持细胞形态。Tween20、N-乙酰-L-半胱氨酸为粘液溶解剂，减少粘液对后续核酸检测的影响。但该发明无法保证样本中DNA的保存效果，以醇为固定剂，对细胞形态和靶标蛋白的保护并非最优，故后续样本的免疫组化染色有时候需要抗原修复，增加了工作量。
如中国专利CN116286673A公开一种人乳头瘤病毒的保存剂、用于检测HPV病毒的引物组和试剂盒及检测方法：提供了一种适用于宫颈脱落细胞核酸检测用保存剂，包括渗透压维持剂、核酸抑制剂、抗氧化剂及细胞膜保护剂；所述核酸酶抑制剂为DETA，所述细胞膜保护剂为海藻糖，所述抗氧化剂为维生素C，渗透压维持剂为NaCl。该发明对核酸和细胞形态的保存均效果较差。
如中国专利CN114052006A公开一种适用液基细胞学和核酸检测的细胞保存液：一种适用液基细胞学和核酸检测的细胞保存液，原料如下：磷酸盐缓冲液、乙醇、甲醇、异丙醇、柠檬烯、乙酰半胱氨酸、二硫苏糖醇、巯基乙醇和双蒸水。利用该保存液对细胞保存后，能够保证细胞有良好的完整性，细胞形态不退变、失真，细胞不成团结块，并且还能维持核酸的稳定性不会出现降解情况，进而使得细胞可以同时兼容TCT和核酸检测，为临床患者提供了极大的便利。但该发明无法保证样本中DNA的最佳效果，同时该保护剂对细胞形态和靶标蛋白的保护并非最优，故后续样本的免疫组化染色有时候需要抗原修复，增加了工作量。
如中国专利CN115176798A公开一种液基细胞保存液及其配制方法和应用：该发明公开了一种液基细胞保存液，又称为脱落细胞保存液，包括pH缓冲液、渗透压维持剂、固定剂、抑菌剂、粘液消化剂、核酸保护剂及红细胞溶解剂；固定剂用于维持细胞的形态。其中pH缓冲液为PIPES缓冲液；渗透压维持剂为葡萄糖溶液，固定剂为甲醇，抑菌剂为Proclin300，粘液消化剂为DTT和EDTA的组合，核酸保护剂为TCEP，红细胞溶解剂Triton X-100。但该发明对和样本靶标蛋白的保护并非最优，故后续样本的免疫组化染色有时候需要抗原修复，增加了工作量。
因此，我们提出一种适用液基细胞学和核酸检测的细胞保存液。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在对于HPV核酸的保存存在一定不足，或可很好的保存核酸，但对细胞结构的保存效果不佳的缺点，而提出的一种用于TCT样本的保存液。该用于TCT样本的保存液既可用于HPV检测，也可用于巴氏染色，同时也可兼顾后续可能的免疫组化染色。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种用于TCT样本的保存液，既可用于HPV检测，也可用于巴氏染色，同时也可兼顾后续可能的免疫组化染色，所述脱落细胞保存液包括：缓冲液、核酸酶抑制剂、防腐剂、盐类物质。
优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液中的一种或几种的混合。
优选的，所述缓冲液为乙酸缓冲液与柠檬酸缓冲液的混合。
进一步优选的，所述缓冲液为乙酸、乙酸钠、柠檬酸三纳的混合物，质量浓度为：乙酸1％-10％、乙酸钠5％-30％、柠檬酸三纳1％-10％。
进一步优选的，所述缓冲液的PH范围为7-8。
优选的，所述核酸酶抑制剂为焦磷酸二乙酯、异硫氰酸胍、SDS、尿素、硅藻土、EDTA中的一种。
进一步优选的，所述核酸酶抑制剂为EDTA，质量浓度为：乙酸0.1％-1％。
优选的，所述防腐剂为醇类、醛类、叠氮化物，包括甲醇、乙醇、甲醛、多聚甲醛、叠氮化钠、Biocare GPL中的一种。
进一步优选的，所述防腐剂为Biocare GPL，质量浓度为：0.5％-5％。
优选的，所述盐类物质为氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾中的一种。
进一步优选的，所述盐类物质为氯化钠，质量浓度为：0.1％-2％。
与现有技术相比，采用本发明提出的一种用于TCT样本的保存液，有益效果在于：本发明液配置方法简单，成本可控，既可用于HPV检测，也可用于巴氏染色，同时也可兼顾后续可能的免疫组化染色。该脱落细胞保存液可以长时间稳定保存宫颈脱落细胞及其核酸，提高HPV检测率，降低假阴性，具有非常高的实用价值。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明关于实施例5中的P16染色图；
图2是本发明关于实施例6中的TCT染色图；
图3是本发明关于实施例7中的HPV检测图；
图4是本发明关于实施例8中的P16竞品染色图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
现结合说明书附图，详细说明本发明的结构特点。
实施例1
一种用于TCT样本的保存液，包括缓冲液、核酸酶抑制剂、防腐剂和盐类物质。其中：
缓冲液包括质量浓度为1％乙酸缓冲液、质量浓度为5％乙酸钠缓冲液、质量浓度为1％柠檬酸缓冲液；
核酸酶抑制剂包括质量浓度为0.1％EDTA；
防腐剂包括质量浓度为0.5％Biocare GPL；
盐类物质包括质量浓度为0.1％氯化钠。
用于TCT样本的保存液的制备，包括如下步骤：
步骤1：分析天平称取计算50.0g的乙酸钠三水合物、10.0g的柠檬酸三纳、1.0g的氯化钠，1.0g的核酸酶抑制剂EDTANa.3H2O、5.0g的防腐剂Biocare GPL，在1L超纯水中溶解，混匀；
步骤2：量筒移取10mL的冰乙酸到缓冲液上述溶液中，将溶液混匀；
步骤3：调节PH为8,保存于2-8℃的环境中。
实施例2
一种用于TCT样本的保存液，包括缓冲液、核酸酶抑制剂、防腐剂和盐类物质。其中：
缓冲液包括质量浓度为3.5％乙酸缓冲液、质量浓度为24.9％乙酸钠缓冲液、质量浓度为1.419％柠檬酸缓冲液；
核酸酶抑制剂包括质量浓度为0.116％EDTA；
防腐剂包括质量浓度为3.0％Biocare GPL；
盐类物质包括质量浓度为0.292％氯化钠。
用于TCT样本的保存液的制备，包括如下步骤：
步骤1：分析天平称取计算249g的乙酸钠三水合物、14.19g的柠檬酸三纳、2.92g的氯化钠，1.16g的核酸酶抑制剂EDTANa.3H2O、30g的防腐剂Biocare GPL，在1L超纯水中溶解，混匀；
步骤2：量筒移取35mL的冰乙酸到缓冲液上述溶液中，将溶液混匀；
步骤3：调节PH为8,保存于2-8℃的环境中。
实施例3
一种用于TCT样本的保存液，包括缓冲液、核酸酶抑制剂、防腐剂和盐类物质。其中：
缓冲液包括质量浓度为10％乙酸缓冲液、质量浓度为30％乙酸钠缓冲液、质量浓度为10％柠檬酸缓冲液；
核酸酶抑制剂包括质量浓度为1％EDTA；
防腐剂包括质量浓度为5％Biocare GPL；
盐类物质包括质量浓度为2％氯化钠。
用于TCT样本的保存液的制备，包括如下步骤：
步骤1：分析天平称取计算300g的乙酸钠三水合物、100g的柠檬酸三纳、20g的氯化钠，10g的核酸酶抑制剂EDTANa.3H2O、50g的防腐剂Biocare GPL，在1L超纯水中溶解，混匀；
步骤2：量筒移取100mL的冰乙酸到缓冲液上述溶液中，将溶液混匀；
步骤3：调节PH为8,保存于2-8℃的环境中。
实施例4
样本保存：
取宫颈脱落样本，置于实施例2配置的保存液中，于室温保存1周。
实施例5
P16免疫组化染色：
1、取实施例4保存一周的样本，参照液基细胞制片方法，使用制片机标准制片。
2、用组化笔圈好样本，置于湿盒中，用TBS清洗2次，每次lmin。
3、加过氧化氢酶阻断剂100ul，室温辉育5min，TBS洁洗3次，每次1min。
4、加P16抗体试剂100ul，室温孵育1h，TBS清洗3次，每次2min。5、如AP标记相应的二抗100ul，室温孵育25min，TBS清洗3次，每次Imin。
6、加FAST-RED显色试剂至样本上室温显色6min，显色完成后，置于自米水中缓慢冲洗2min，终止显色。
7、加苏木素100ul，染20-30秒，白米水中缓慢冲洗1min，TBS清洗1次，流水冲洗干净。
8、用掉玻片上水份，保持混润，滴加试剂8 2-3滴水溶性封片剂封片，然后加盖玻片，免产生气泡。
9、显微镜下观察。
实施例6
巴氏染色：
1、取实施例4保存一周的样本，参照液基细胞制片方法，使用制片机标准制片。
2、细胞涂片用95％乙醇-冰乙酸固定液固定10～15min。
3、95％的乙醇浸泡1min，80％的乙醇浸泡1min，70％的乙醇浸泡1min。
4、蒸馏水或自来水浸泡或冲洗1min。
5、苏木素染液染色5～10min，自来水冲洗2min。
6、1％的盐酸乙醇分化液分化约4～5s或0.5％盐酸水溶液分化10s，自来水冲洗2min。
7、蓝化液中蓝化2min，自来水冲洗2min。
8、70％的乙醇脱水2min，80％的乙醇脱水2min，95％的乙醇(Ⅰ)、(Ⅱ)脱水各2min。
9、橘黄G6染液染色2min。
10、95％的乙醇(Ⅰ)、(Ⅱ)冲洗各2min。
11、EA36染色液染色3～5min。
12、95％的乙醇(Ⅰ)、(Ⅱ)脱水各1min，无水乙醇(Ⅰ)、(Ⅱ)脱水各1min。
13、二甲苯透明、中性树脂封片。
实施例7
HPV测试：
1、取实施例4保存一周的样本，磁珠法提取样本核酸。
2、购买人乳头状瘤病毒(HPV)检测试剂盒(PCR荧光法)，将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻。
3、按照说明书的操作说明，设置对照，对样本进行HPV-16的检测。
实施例8
P16免疫组化染色：
竞品试剂保存样本1周，同实施例5操作。
经过实施例1-8，可知本发明的脱落细胞保存液，液配置方法简单，成本可控，柠檬酸三纳、ETDA、防腐剂Biocare GPL的配合使用，避免了醇类对蛋白的影响，同时可保护核酸避免被降解。样本既可用于HPV检测，也可用于巴氏染色，同时也可兼顾后续可能的免疫组化染色。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于TCT样本的保存液，其特征在于，包括缓冲液、核酸酶抑制剂、防腐剂和盐类物质。
2.根据权利要求1所述的一种用于TCT样本的保存液，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液中的一种或几种的混合。
3.根据权利要求1所述的一种用于TCT样本的保存液，其特征在于，所述缓冲液为乙酸缓冲液与柠檬酸缓冲液的混合。
4.根据权利要求1所述的一种用于TCT样本的保存液，其特征在于，所述核酸酶抑制剂为焦磷酸二乙酯、异硫氰酸胍、SDS、尿素、硅藻土、EDTA中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种用于TCT样本的保存液，其特征在于，所述防腐剂为甲醇、乙醇、甲醛、多聚甲醛、叠氮化钠、Biocare GPL中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种用于TCT样本的保存液，其特征在于，所述盐类物质为氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾中的一种。
7.一种根据权利要求1-6所述的用于TCT样本的保存液，其特征在于，所述缓冲液包括质量浓度为1％-10％乙酸缓冲液、质量浓度为5％-30％乙酸钠缓冲液、质量浓度为1％-10％柠檬酸缓冲液；
所述核酸酶抑制剂包括质量浓度为0.1％-1％EDTA；
所述防腐剂包括质量浓度为0.5％-5％Biocare GPL；
所述盐类物质包括质量浓度为0.1％-2％氯化钠。
8.根据权利要求7所述的用于TCT样本的保存液，其特征在于，所述缓冲液的PH值为7-8。
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| CN202311410034.3A CN117413824A (zh) | 2023-10-27 | 2023-10-27 | 一种用于tct样本的保存液 |
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