CN103884562B - 氯化醋酸as-d萘酚酯酶（as-dnce）染色液 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学体外诊断领域，公开了一种缓冲液组分含有皂素的氯化醋酸AS‑D萘酚酯酶染色试剂盒。采用本发明所述试剂盒染色时含皂素的缓冲液孵育血细胞，使色素能通过皂素在细胞膜上形成的空洞进入血细胞与氯化醋酸AS‑D萘酚酯酶结合显色，然后在洗涤后细胞重新封闭，色素沉淀颗粒被封闭在血细胞内，使氯化醋酸AS‑D萘酚酯酶染色后能够持久不褪色，有利于染色基团的保护。本发明试剂盒具有染色效果持久、不易脱色，且组成简单，使用方便，易做到标准化操作，广泛适用于血细胞内氯化醋酸AS‑D萘酚酯酶染色。
Description
技术领域
本发明属于医学体外诊断领域，具体涉及氯化醋酸AS-D萘酚酯酶的染色试剂盒，尤其涉及一种化学染色法检测血细胞内特异性酯酶氯化醋酸AS-D萘酚酯酶的染色试剂盒。
背景技术
氯化醋酸AS-D萘酚酯酶（naphthol AS-D chloroacetate esterase， AS-DNCE）是一种粒细胞特异性酯酶，通常存在于粒细胞系中。目前对特异性酯酶检测常采用化学染色方法，其检测原理为血细胞内AS-DNCE将氯化醋酸AS-D萘酚水解，产生萘酚AS-D，后者与重氮剂偶联形成有色沉淀物，沉淀物的显色深浅与AS-DNCE活性成正比。
AS-DNCE几乎都存在于粒细胞系中，而单核系细胞进行 AS-DNCE染色多数为阴性，仅少数呈弱阳性。对正常人血细胞进行 AS-DNCE染色，原始粒细胞为阴性反应或阳性反应，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均为阳性反应，酶活性并不随细胞的成熟而增强；嗜酸性粒细胞为阴性反应或弱阳性反应，嗜碱性粒细胞为阳性反应；其他血细胞、单核细胞为阴性反应，个别可呈弱阳性反应；淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞和血小板均呈阴性反应。
对白血病血细胞AS-DNCE化学染色，可以鉴别出粒细胞和单核细胞、淋巴细胞等，在急性粒细胞白血病诊断中可作为粒细胞的标志，对白血病细胞的分型具有重要的诊断价值。对白血病血细胞染色，急性粒细胞白血病时，白血病性原始粒细胞可出现阳性反应；急性单核细胞白血病及急性淋巴细胞白血病时，白血病细胞均呈阴性反应；急性粒-单核细胞白血病时，部分白血病细胞可呈阳性反应，其阳性强度取决于原粒细胞的数量和分化程度，分化程度较好的原粒细胞呈阳性反应，但原始和幼稚单核细胞多数呈阴性反应。
目前，传统使用的AS-DNCE染色方法，染色后的涂片不能长时间保存，必须染色后及时观察，否则色素沉淀颗粒变淡甚至褪色，不利于粒细胞系阳性细胞的观察，从而影响白血病疾病的诊断分型。
发明内容
针对目前现有AS-DNCE染色方法存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种染色效果持久的氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色试剂盒，该试剂盒染色后涂片可以长时间保存。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色试剂盒，包括含皂素的缓冲液。
皂素即皂角苷，又称皂苷，英文名为Saponin，是由皂苷元和糖、糖醛酸或其他有机酸组成的能形成水溶液或胶体溶液并能形成肥皂状泡沫的植物糖苷统称。皂素是一种温和的穿膜剂，它可以在细胞膜上形成孔洞让色素或其他分子自由通过，并且在洗涤去除皂素后细胞膜上的孔洞消失，细胞重新封闭。本发明所述氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色试剂盒缓冲液组分含有皂素，采用本发明所述试剂盒染色时，含皂素的缓冲液孵育血细胞后，使色素能通过皂素在细胞膜上形成的空洞进入血细胞与氯化醋酸AS-D萘酚酯酶结合显色，然后在洗涤后细胞重新封闭，色素沉淀颗粒被封闭在血细胞内，使氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色后能够持久不褪色，有利于染色基团的保护。
按照本发明，上述染色试剂盒中，所述含皂素的缓冲液中皂素工作浓度优选为50mg/L～200mg/L，更优选为90mg/L-100mg/L。在一些实施例中为96.7mg/L。
按照本发明，上述染色试剂盒中，所述含皂素的缓冲液的pH值范围为7.0～8.0。
进一步的，上述染色试剂盒中，所述含皂素的缓冲液中的缓冲液选自醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中的一种。作为优选，缓冲液为磷酸盐缓冲液，更优选为磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液。
进一步的，本发明所述氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色试剂盒还包括固定液、氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液、重氮剂和复染液。
上述试剂盒中，所述固定液优选为含甲醛的缓冲液。其中，所述含甲醛的缓冲液中所述甲醛的体积百分比浓度优选为2%～5%。而所述含甲醛的缓冲液中的缓冲液选自醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中的一种。作为优选，缓冲液为磷酸盐缓冲液，更优选为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。而缓冲液的pH值范围为6.0-8.0。
按照本发明，上述试剂盒中，所述氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺（DMF）。按g/mL计，所述氯化醋酸AS-D 萘酚钠盐溶液中所述氯化醋酸AS-D萘酚钠盐的质量体积百分比浓度为0.5%～1.5%，优选为1%。
上述试剂盒中，所述重氮剂为坚牢红B（Fast Red B Salt）。坚牢红B又称固红B盐，别名标准重氮色盐玫瑰红、B红盐、坚牢红B，英文名为Fast Red B Salt，分子式为C17H13N3O9S2，CAS：49735-71-9。坚牢红B为含重氮的盐，可与萘酚AS-D反应生成红色沉淀，用于氯化醋酸AS-D萘酚酯酶的染色。
上述试剂盒中，所述复染液优选为苏木素染液。在一些实施方案中，所述苏木素染液的制备方法为将苏木素溶解于异丙醇-乙醇（体积比为1:1）的混合液中，并与含有硫酸铝、叠氮钠、冰醋酸的溶液混合均匀，敞口振荡一周后，加入碘酸钠和甘油；其中，所述苏木素染液中所述苏木素的浓度为0.2mg/mL-0.5mg/mL，所述硫酸铝的浓度为 2.0mg/mL-4.0mg/mL，所述碘酸钠的浓度为0.05mg/mL-0.1mg/mL，所述甘油体积百分比浓度为35%-40%。
本发明还提供了使用上述氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色试剂盒进行血细胞染色的方法。
一种氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色法，
将氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液、重氮剂与含皂素的缓冲液混合制得染色孵育液；
固定液固定血细胞涂片后用染色孵育液孵育，复染液复染后观察。
在一些实施方案中，上述试剂盒染色法，具体包括：
步骤1：将氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液、重氮剂与含皂素的缓冲液混合均匀，制得染色孵育液，备用；
步骤2：血细胞涂片用固定液固定30秒，漂洗晾干；
步骤3：干燥后的涂片用染色孵育液在37℃下孵育30分钟，漂洗晾干；
步骤4：干燥后的涂片用复染液复染1～2分钟，漂洗晾干观察。
由于氯化醋酸AS-D萘酚钠在水溶液中久置后会发生水解生成萘酚AS-D，与坚牢红B生成有色沉淀，因此染色孵育液要现配现用。在染色前，将氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液、重氮剂与含皂素的缓冲液混合均匀，制备得到染色孵育液。本发明所述染色孵育液为一次性使用，配置后应在2小时内用完，使用后剩余液体应废弃不可留用。
其中，按照本发明，上述染色法中，步骤1中所述染色孵育液中所述氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液的体积百分比浓度优选为2%-5%；所述含皂素的缓冲液的体积百分比浓度为95%～98%；所述重氮剂的浓度为0.5mg/mL-1.5mg/mL。
在一些实施例中为，所述染色孵育液中所述氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液的体积百分比浓度优选为3.3%；所述含皂素的缓冲液的体积百分比浓度为96.7%；所述重氮剂的浓度为1.0mg/mL。
按照本发明，上述染色法中，步骤2中所述固定液优选事先于4 ℃预冷。固定后漂洗优选用水漂洗，漂洗2～4遍，优选为用水漂洗3 遍。漂洗后的涂片优选自然晾干。
按照本发明，上述染色法中，步骤3中所述孵育具体为将步骤1 所述染色孵育液倒入染缸，将涂片置于染色孵育液中，37℃下放置30 分钟。孵育后漂洗优选为用水漂洗，在一些实施例中具体为孵育后连缸流水冲洗数分钟。漂洗后的涂片优选自然晾干。
按照本发明，上述染色法中，步骤4中所述复染具体为向干燥后的涂片滴加复染液覆盖涂片，复染1～2分钟。复染后漂洗优选用水漂洗，漂洗2～4遍，优选为用水漂洗3遍。漂洗后的涂片优选自然晾干，于显微镜下观察。
与现有技术相比，本发明试剂盒具有如下特点：
1、本发明试剂盒染色效果持久不易脱色。染色效果稳定，不会因为超过观察时间而造成假阴性的结果，大大减少大批量标本检验的情况下的人为误差。
2、本发明试剂盒组成简单，使用方便，易做到标准化操作，避免了因人为操作误差造成的可重复性差。
附图说明
图1示使用本发明试剂盒染色的血涂片血象；
图2示使用本发明试剂盒染色的血涂片24小时后血象；
图3示使用普通染色试剂盒染色的血涂片血象；
图4示使用普通染色试剂盒染色的血涂片24小时后血象。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1:本发明所述试剂盒的组成及制备方法
固定液：取40%甲醛10mL，称量磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.65g，磷酸二氢钠（NaH2PO4）0.4g，加入蒸馏水90mL，pH值为7.3，每瓶 2.5mL分装，密封，置4℃冰箱中保存。
孵育液A（氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液）：称取50mg氯化醋酸 AS-D萘酚钠溶解于5mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，每瓶1mL 分装，密封。
孵育液B（重氮剂-坚牢红B）：称量30mg坚牢红B粉末装于试剂瓶中。
孵育液C（含皂素的缓冲液）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）8.8g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.9g，皂素（Saponin，Sigma购买）0.1g，叠氮钠1g，溶解于蒸馏水1000mL，pH值为7.6，每瓶29mL分装，密封。
复染液：称取苏木素0.05g，溶解于5mL异丙醇和5mL乙醇的混合液中；称取硫酸铝0.5g，叠氮钠0.1g溶解于80mL蒸馏水中，并加入10mL冰醋酸，将苏木素溶液也加入其中混合均匀。将混合试剂敞口振荡一周后，称取碘酸钠0.01g和甘油60mL加入其中，每瓶2.5mL 分装，密封。
实施例2:本发明所述试剂盒的染色方法
1、预制染色孵育液：取实施例1配制的孵育液A、孵育液B与孵育液C各1瓶混合，轻轻摇晃后混匀，即制成染色孵育液；
2、新鲜的骨髓细胞涂片或血液细胞涂片滴加4℃预冷的实施例1 配制的固定液覆盖涂片，30秒后，用水漂洗3遍，自然晾干涂片；
3、将步骤1染色孵育液倒入染缸，将涂片置于染色孵育液中， 37℃下放置30分钟，然后连缸流水冲洗数分钟，自然晾干涂片；
4、向干燥后的涂片滴加实施例1配制的复染液覆盖涂片，1～2分钟后，用水漂洗3遍，自然晾干涂片，于显微镜下观察。
实施例3:正常人血细胞涂片检测
取正常人外周血制作血涂片，按照实施例2的方法使用本发明试剂盒对血涂片进行染色，染色后的血涂片用显微镜油镜观察血象并拍照，如图1。
染色结果判断：阴性结果为胞质无色；阳性结果为胞质内出现红色沉淀：胞质呈淡红色（+），鲜红色沉淀布满胞质（++），深红色沉淀充满胞质（+++）。
染色结果：由图1结果可见正常成熟中性粒细胞为阳性反应，单核细胞为阴性反应。
实施例4:与传统染色方法比较
1、传统AS-DNCE染色液配制及染色方法（血液学检验标准操作程序，2007，P318-319）
试剂配制：
（1）甲醛-丙酮固定液（pH6.6）4℃保存
（2）67mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.6）4℃保存
Na2HP04 8.8g
KH2P04 0.9g
蒸馏水 1000mL
（3）盐酸副品红，4℃保存
副品红 1g
2mol／L盐酸液(8.25mLHCl+41.65mL蒸馏水) 25mL
（4）4％亚硝酸钠，4℃保存，每周新鲜配制。
（5）六偶氮副品红液：使用前等体积盐酸副品红和4％亚硝酸钠液立即混合，反应1min。
（6）氯乙酸AS-D萘酚液
氯乙酸AS-D萘酚 10mg
N,N-二甲基甲酰胺 1.5mL
（7）作用液
67mmol／L磷酸盐酸缓冲液 30mL
氯乙酸AS—D萘酚液 1.5mL
六偶氮副品红液 0.15mL
染色方法
（1）固定：干燥血涂片，用甲醛-甲醇固定液固定30s。
（2）水洗，晾干。
（3）放入作用液，在37℃下放置30min。
（4）水洗，苏木素染液复染1～2min。
（5）水洗，晾干，镜检。
2、染色后稳定性比较方法
本发明试剂盒和传统AS-DNCE染色试剂分别按照各自染色方法对正常人血涂片分别进行染色，染色后的血涂片用显微镜油镜观察血象并拍照，血涂片室温放置24小时后再将同一张涂片进行拍照。本发明试剂盒染色结果如图1和图2，传统方法染色结果如图3和图4。
3、染色方法及结果比较
传统AS-DNCE染色方法配制溶液种类繁多需要较长的操作时间，并且染色后24小时的血涂片阳性细胞胞质内的红色颗粒颜色变淡影响检测结果（如图3、图4）；而使用本发明试剂盒，操作简单，使用方便，并且染色后24小时的血涂片阳性细胞胞质内的红色颗粒颜色没有明显改变（如图1、图2）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色试剂盒，其特征在于，包括染色孵育液，所述染色孵育液由含皂素的缓冲液、氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液和重氮剂组成。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述含皂素的缓冲液中皂素的工作浓度为50 mg/L ~200mg/L。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述含皂素的缓冲液的pH值为7.0~8.0。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，还包括固定液和复染液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述固定液为含甲醛的缓冲液。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述重氮剂为坚牢红B。
8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述复染液为苏木素染液。
9.一种氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色法，其特征在于，
将氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液、重氮剂与含皂素的缓冲液混合制得染色孵育液；
固定液固定血细胞涂片后用染色孵育液孵育，复染液复染后观察。
10.如权利要求9所述的染色法，其特征在于，所述染色孵育液中氯化醋酸AS-D萘酚钠盐溶液的体积百分比浓度为2%-5%；所述含皂素的缓冲液的体积百分比浓度为95%~98%；所述重氮剂的浓度为0.5-1.5mg/mL。
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