CN114441272A - 一种脱落细胞染色液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种脱落细胞染色液及其制备方法，包括用于细胞核染色的苏木素染色液，用于细胞浆染色的EA50染色液与橙黄G染色液，染色效果持久稳固，不易脱色，可长久保存。
Description
技术领域
本发明涉及细胞染色技术领域，具体涉及一种脱落细胞染色液及其制备方法。
背景技术
在生物体体液或分泌物的细胞检测中，通常采用细胞染色技术来区分不同种类、不同形态、不同状态的细胞，用于明场观察检测的常规细胞染色技术中，通常是将待检测样本涂抹在透明载体如载玻片上，等检测样本干燥后，再依次滴入具有不同染色效果的染液及缓冲液，混合均匀完成染色后，再冲洗掉影响观测的染液及缓冲液主体，再等待染色样本干燥后，完成整个染色过程，形成用于明场观测的染色后的样本涂片。
在临床实验中，液基测试白带或子宫颈细胞样本中的有形成分的数量，可以明显提高妇儿科阴道炎症疾病如细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎和非特异性阴道炎等类别的辅助诊断或阴道手术后炎症的预防、癌变细胞的检测率，而判定样本中有形成分的数量是通过对染色后的细胞样本进行计数而得到的，因此脱落细胞染色液对于样本检测十分重要。
公开号为CN201910139521.8的中国专利公开了一种一种液基脱落细胞染色液及其染色方法，该染色液由细胞浆染色液R1和染色液R2组成，所述细胞浆染色液R1由A1溶液、A2溶液和A3溶液混合而成，A1溶液为0.5-1.5g碱性染料溶解于10-20mL无水乙醇得到的混合液；A2溶液为0.1-0.5g灿烂甲酚蓝与80-100mL水配制的混合液；A3溶液为1-3g碘盐与10-15mL水配制得盐溶液；染色液R2为双氧水与生理盐水的混合液，其中双氧水的浓度为3-5%，双氧水与生理盐水的混合体积比为1：3-5。通过科学配比，能有效显示细胞核结构，操作简单快捷，大大节省了细胞染色时间，提高了检测效率，但是使用该染色剂后，染色效果不稳定，在很短的时间内即褪色，无法满足长时间实时观察活细胞的需要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种脱落细胞染色液及其制备方法，染色效果持久稳固，不易脱色，可长久保存。
根据所属领域技术人员普遍的认知水平，苏木色精经氧化后可作为染核的染料，但其与DNA结合力不强，导致染色效果不佳，而亮绿、曙红、橙黄G作为细胞浆染色剂由于发色部分都是阴离子，只能与蛋白质的阳离子结合，在过酸或过碱状态下都易与蛋白质脱离，因此导致现有技术中的染色液染色效果不持久。
本发明人经过艰难地尝试后发现，添加硫酸铝钾作为苏木素染色液的媒剂能使苏木色精转化为苏木精矾，后者具有强大亲和力，与DNA结合牢固，染成较深紫色，不易为醇、水洗脱，可实现细胞核的稳固染色，而添加磷钨酸作为EA50染色液和橙黄G染色液的媒剂，不仅可通过调节pH使细胞浆内染色环境维持所需范围，还增加染料的着色力，使得细胞浆的染色效果更稳固；另一方面，通过添加促染剂、渗透压调节剂提高染色效率，并通过添加防腐剂解决由于添加促染剂而导致的染色液易长菌腐败的问题。
根据本发明的第一方面，提供一种脱落细胞染色液，包括用于细胞核染色的苏木素染色液，用于细胞浆染色的EA50染色液与橙黄G染色液，其中，
所述苏木素染色液包括质量份数如下的组分：
苏木色精 2-5份
硫酸铝钾 17.6-20份
碘酸钠 0.2-0.8份
冰醋酸 2-4份
无水乙醇 25份-35份
蒸馏水 75份-80份，
所述EA50染色液包括质量份数如下的组分：
亮绿 0.3-0.5份
曙红 4-6份
甲醇 25-30份
冰醋酸 2-4份
磷钨酸 2-5份
无水乙醇 75-80份，
所述橙黄G染色液包括质量份数如下的组分：
橙黄G 5-8份
磷钨酸 0.15-0.2份
无水乙醇 80-90份
蒸馏水 5-15份。
本方案的脱落细胞染色液对细胞核和细胞浆进行分色染色，苏木素染色液对细胞核的亲和力大，EA50染色液、EA50染色液对细胞浆中不同老化程度的细胞浆蛋白不仅结合力强，且可实现分色，最终达到染色分明、不易脱色的效果。
其具体机理为：细胞核的主要成分是脱氧核糖核酸，其等电点为pH 1.6-2.0，当pH大于2.0时DNA带负电，能与带正电的染料阳离子结合。苏木色精是染核的染料，氧化后成为氧化苏木素即苏木素红或苏木精，它的等离子点是PH 6.5，当染液的酸碱度调节到PH 2.2-2.9时，苏木色精能析出阳离子，与带负电的DNA结合。因为苏木色精阳离子电荷不强，与DNA结合不牢，所以染色不深。当加入硫酸铝钾媒剂后，即结合成带强正电的大分子带色体——苏木精矾，后者具有强大亲和力，与DNA结合牢固，染成较深紫色，不易为醇、水洗脱，实现细胞核的稳固染色；
细胞浆中的蛋白质等电点约为PH 6.0，在不同的酸碱度中能与不同的染料结合，但在PH小于4时便不能再与染料的阳离子结合；PH大于8时便不再与染料的阴离子结合，亮绿、曙红的发色部分都是阴离子，只能与蛋白质的阳离子结合，因此染色环境不能太酸太碱，需要利用冰醋酸与磷钨酸进行调节，较年轻的细胞如底层鳞状上皮细胞浆中核蛋白体较多，易与亮绿结合而染绿色，成熟的细胞浆中含核蛋白体较少，如成熟红细胞、表层角化鳞状上皮细胞，易与曙红、亮绿结合而染色，很衰老的细胞，如完全角化细胞则可与橙黄G结合染色，以形成不同色系的细胞浆染色状态，另外，磷钨酸在染色过程中，作为媒染剂可增加染料的着色力，使得细胞浆的染色效果更稳固。
优选地，还包括中和液，所述中和液包括柠檬酸和磷酸氢二钠的混合物，本方案中中和液包括一对中性缓冲剂，可中和染色过程后多余的酸或碱，保证染色达到理想效果。
优选地，所述苏木素染色液的pH值为2.7-3.0。
优选地，所述EA50染色液的pH值为5.3-5.5，亮绿、曙红的发色部分为阴离子，只能与蛋白质的阳离子结合，因此染色环境的pH不能太酸也不能太碱。
优选地，苏木素染色液还包括促染剂，所述促染剂为非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂具体可以为吐温-80、曲拉通X-100。
优选地，所述苏木素染色液还包括防腐剂，非离子表面活性剂均是助长微生物生长的良好条件，清洗液放置长时间后容易长菌沉淀，因此添加防腐剂，所述防腐剂包括proclin300防腐剂、bronidox防腐剂的混合物，防腐剂proclin300的浓度为0.5-18g/L，防腐剂bronidox的浓度0.2g-2g/L，本方案使用的是复配型防腐剂，单一使用防腐剂proclin300不能完全起到防腐作用，而复配型防腐剂相较于常用的防腐剂如叠氮钠，成本低且防腐效果好。
优选地，所述EA50染色液还包括渗透压调节剂，所述渗透压调节剂具体可为氯化钠或丙二醇，氯化钠中含有钠离子可提高离子浓度，增高渗透压，而丙二醇具有一定的粘度，可能提高渗透压，有利于EA50染色液深入细胞内进行染色，加快了染色效率。
根据本发明的第二方面，提供一种脱落细胞染色液的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备苏木素染色液
将苏木色精、促染剂溶于无水乙醇得到第一溶液，将硫酸铝溶于蒸馏水得到第二溶液，将所述第一溶液和第二溶液混合，再加入碘酸钠进行氧化反应，待反应结束后加入防腐剂，而后再加入冰醋酸混合，使得pH值调至2.7-3.0，即得所述苏木素染色液；
S2.制备EA50染色液
将曙红、亮绿溶于无水乙醇得到第三溶液，将冰醋酸、磷钨酸、渗透压调节剂溶于甲醇得到第四溶液，将所述第四溶液加入至所述第三溶液中，使得pH值调整至5.3-5.5，即得所述EA50染色液；
S3.制备橙黄G染色液
将所述橙黄G溶于无水乙醇得到第五溶液，将磷钨酸溶于蒸馏水得到第六溶液，将所述第五溶液与第六溶液混合，即得所述橙黄G染色液；
S4.制备中和液
将柠檬酸和磷酸氢二钠溶于蒸馏水中，得到中和液；
S5.分别将苏木素染色液、EA50染色液、橙黄G染色液、中和液独立分装待用。
优选地，所述氧化反应的时间为30-45min，可以避免苏木色精的氧化不足及氧化过度，确保细胞核的着色效果，并通过氧化时间的控制确保在使用过程中不产生氧化膜和结晶体。
本发明的有益效果在于：本方案的脱落细胞染色液与细胞核与细胞浆中的有效成分均结合紧密，染色效果好，对不同状态的细胞具有分色效果，细胞染色后不易脱色，保存时间长，染色效率高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
实施例1
一种脱落细胞染色液，包括用于细胞核染色的苏木素染色液，用于细胞浆染色的EA50染色液与橙黄G染色液，其中，
所述苏木素染色液包括质量份数如下的组分：
苏木色精 2份
硫酸铝钾 17.6份
碘酸钠 0.2份
冰醋酸 2份
无水乙醇 25份
蒸馏水 75份，
所述苏木素染色液的pH值为2.7；
所述EA50染色液包括质量份数如下的组分：
亮绿 0.3份
曙红 4份
甲醇 25份
冰醋酸 2份
磷钨酸 2份
无水乙醇 75份，
所述EA50染色液的pH值为5.3；
所述橙黄G染色液包括质量份数如下的组分：
橙黄G 5份
磷钨酸 0.15份
无水乙醇 80份
蒸馏水 5份。
实施例2
一种脱落细胞染色液，包括用于细胞核染色的苏木素染色液，用于细胞浆染色的EA50染色液与橙黄G染色液，其中，
所述苏木素染色液包括质量份数如下的组分：
苏木色精 5份
硫酸铝钾 20份
碘酸钠 0.8份
冰醋酸 4份
无水乙醇 35份
蒸馏水 80份
吐温-80 3份
防腐剂 1份，
所述苏木素染色液的pH值为3.0；
所述EA50染色液包括质量份数如下的组分：
亮绿 0.5份
曙红 6份
甲醇 30份
冰醋酸 4份
磷钨酸 5份
无水乙醇 80份，
所述EA50染色液的pH值为5.5；
所述橙黄G染色液包括质量份数如下的组分：
橙黄G 8份
磷钨酸 0.2份
无水乙醇 90份
蒸馏水 15份。
实施例3
一种脱落细胞染色液，包括用于细胞核染色的苏木素染色液，用于细胞浆染色的EA50染色液与橙黄G染色液，其中，
所述苏木素染色液包括质量份数如下的组分：
苏木色精 3份
硫酸铝钾 19份
碘酸钠 0.6份
冰醋酸 3份
无水乙醇 30份
蒸馏水 78份
吐温-80 2份
防腐剂 0.5份，
所述苏木素染色液的pH值为3.0；
所述EA50染色液包括质量份数如下的组分：
亮绿 0.4份
曙红 5份
甲醇 28份
冰醋酸 3份
磷钨酸 3份
无水乙醇 78份
渗透压调节剂 2份，
所述EA50染色液的pH值为5.4；
所述橙黄G染色液包括质量份数如下的组分：
橙黄G 6份
磷钨酸 0.18份
无水乙醇 85份
蒸馏水 10份。
实施例4
一种脱落细胞染色液，包括用于细胞核染色的苏木素染色液，用于细胞浆染色的EA50染色液与橙黄G染色液，中和液，其中，
所述苏木素染色液包括质量份数如下的组分：
苏木色精 3份
硫酸铝钾 19份
碘酸钠 0.6份
冰醋酸 3份
无水乙醇 30份
蒸馏水 78份
吐温-80 2份
防腐剂 0.5份，
所述苏木素染色液的pH值为3.0；
所述EA50染色液包括质量份数如下的组分：
亮绿 0.4份
曙红 5份
甲醇 28份
冰醋酸 3份
磷钨酸 3份
无水乙醇 78份
渗透压调节剂 2份，
所述EA50染色液的pH值为5.4；
所述橙黄G染色液包括质量份数如下的组分：
橙黄G 6份
磷钨酸 0.18份
无水乙醇 85份
蒸馏水 10份；
所述中和液包括质量份数如下的组分：
柠檬酸 16.7份
磷酸氢二钠 22.4份
蒸馏水 80份。
实施例5
一种脱落细胞染色液的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备苏木素染色液
将苏木色精、促染剂溶于无水乙醇得到第一溶液，将硫酸铝溶于蒸馏水得到第二溶液，将所述第一溶液和第二溶液混合，再加入碘酸钠进行氧化反应30-45min，待反应结束后加入防腐剂，而后再加入冰醋酸混合，使得pH值调至2.7-3.0，即得所述苏木素染色液；
S2.制备EA50染色液
将曙红、亮绿溶于无水乙醇得到第三溶液，将冰醋酸、磷钨酸、渗透压调节剂溶于甲醇得到第四溶液，将所述第四溶液加入至所述第三溶液中，使得pH值调整至5.3-5.5，即得所述EA50染色液；
S3.制备橙黄G染色液
将所述橙黄G溶于无水乙醇得到第五溶液，将磷钨酸溶于蒸馏水得到第六溶液，将所述第五溶液与第六溶液混合，即得所述橙黄G染色液；
S4.制备中和液
将柠檬酸和磷酸氢二钠溶于蒸馏水中，得到中和液；
S5.分别将苏木素染色液、EA50染色液、橙黄G染色液、中和液独立分装待用，使用时按照顺序依次对细胞进行浸染。
对比例1
一种脱落细胞染色液，其他组分与实施例1相同，所不同的是，苏木素染色液中不包括硫酸铝钾。
对比例2
一种脱落细胞染色液，其他组分与实施例1相同，所不同的是，EA50染色液和橙黄G染色液均不包括磷钨酸。
测试例
使用实施例1-4及对比例1-2对脱落细胞按照巴氏染色法进行染色放置相同时间后，观察褪色情况，并计算细胞达到完全被染色状态所需要的时间，结果如表1所示。
本领域普通技术人员可以理解，以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请权利要求所限定的范围。
Claims (10)
1.一种脱落细胞染色液，其特征在于，包括用于细胞核染色的苏木素染色液，用于细胞浆染色的EA50染色液与橙黄G染色液，其中，
所述苏木素染色液包括质量份数如下的组分：
苏木色精 2-5份
硫酸铝钾 17.6-20份
碘酸钠 0.2-0.8份
冰醋酸 2-4份
无水乙醇 25份-35份
蒸馏水 75份-80份，
所述EA50染色液包括质量份数如下的组分：
亮绿 0.3-0.5份
曙红 4-6份
甲醇 25-30份
冰醋酸 2-4份
磷钨酸 2-5份
无水乙醇 75-80份，
所述橙黄G染色液包括质量份数如下的组分：
橙黄G 5-8份
磷钨酸 0.15-0.2份
无水乙醇 80-90份
蒸馏水 5-15份。
2.根据权利要求1所述的一种脱落细胞染色液，其特征在于，还包括中和液，所述中和液包括柠檬酸和磷酸氢二钠的混合物。
3.根据权利要求1所述的一种脱落细胞染色液，其特征在于，所述苏木素染色液的pH值为2.7-3.0。
4.根据权利要求1所述的一种脱落细胞染色液，其特征在于，所述EA50染色液的pH值为5.3-5.5。
5.根据权利要求1所述的一种脱落细胞染色液，其特征在于，苏木素染色液还包括促染剂。
6.根据权利要求5所述的一种脱落细胞染色液，其特征在于，所述促染剂为非离子表面活性剂。
7.根据权利要求1所述的一种脱落细胞染色液，其特征在于，所述苏木素染色液还包括防腐剂。
8.根据权利要求1所述的一种脱落细胞染色液，其特征在于，所述EA50染色液还包括渗透压调节剂。
9.一种脱落细胞染色液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备苏木素染色液
将苏木色精、促染剂溶于无水乙醇得到第一溶液，将硫酸铝溶于蒸馏水得到第二溶液，将所述第一溶液和第二溶液混合，再加入碘酸钠进行氧化反应，待反应结束后加入防腐剂，而后再加入冰醋酸混合，使得pH值调至2.7-3.0，即得所述苏木素染色液；
S2.制备EA50染色液
将曙红、亮绿溶于无水乙醇得到第三溶液，将冰醋酸、磷钨酸、渗透压调节剂溶于甲醇得到第四溶液，将所述第四溶液加入至所述第三溶液中，使得pH值调整至5.3-5.5，即得所述EA50染色液；
S3.制备橙黄G染色液
将所述橙黄G溶于无水乙醇得到第五溶液，将磷钨酸溶于蒸馏水得到第六溶液，将所述第五溶液与第六溶液混合，即得所述橙黄G染色液；
S4.制备中和液
将柠檬酸和磷酸氢二钠溶于蒸馏水中，得到中和液；
S5.分别将苏木素染色液、EA50染色液、橙黄G染色液、中和液独立分装待用。
10.根据权利要求9所述的一种脱落细胞染色液的制备方法，其特征在于，所述氧化反应的时间为30-45min。
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