CN110982870B - 一种微生物多重荧光染色液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微生物多重荧光染色液，包括荧光染色剂、缓冲溶液、抗淬灭剂、抑菌剂和水。将其滴加到微生物样本上即可在紫外光下进行显微镜检。这一操作简单便捷，大大降低了操作人员的工作强度，可实现大量样本的快速检测。并且灵敏度和准确率高，适用范围广泛。

Description

一种微生物多重荧光染色液及其应用

技术领域

本发明涉及微生物荧光染色技术领域，具体涉及一种微生物多重荧光染色液，以及该荧光染色液的应用。

背景技术

微生物在自然界广泛存在，对人体的保护发挥着极其重要的作用。人的体表以及与外界相连的腔道，如口腔、呼吸道、肠道、泌尿生殖道等都存在着不同种类和数量的微生物。它们与人体环境共同构成了微生态系统，并保持着动态平衡，一旦平衡被打破，可能会引起相关疾病。因此，微生物的检测对于人体保护以及疾病的预防、诊断和治疗具有极其重要的意义。

传统的微生物检测技术有培养鉴定法，是将患处采集的样本接种至适应其生长的培养基上，在相应的需氧和/或厌氧环境下进行恒温培养，从初步的培养基上分离纯化不同的微生物后进一步根据生化及形态学鉴定微生物种类。但此种培养法一般培养周期较长，且微生物可能生长状况不好，因此不能培养成活，且所需条件复杂，需要全套的微生物培养，相应的鉴定设备及独立空间。且对培养操作人员技术要求较高。后续发展的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法虽然在菌种的鉴定上具有极高的准确性，但是该方法的检测对象一般为纯菌落，所以该法依然依赖于微生物的培养和纯化，且仪器昂贵，极大限制了推广和临床应用。

实时荧光定量PCR也是研究中经常采用的一项检测技术，可以在较低模板浓度下实现对微生物的准确定量分析。但是该方法仅适用于已知DNA序列的微生物，对序列未知的微生物无法检测。而且该检测仪器较昂贵且操作复杂、费时，对技术人员要求较高。

除以上鉴定方法外，微生物染色技术在微生物检测过程中也发挥着越来越重要的作用。传统的染色技术有革兰氏染色法，该方法由4个染色步骤组成，但脱色步骤容易过度脱色，造成结果的假阴性。另外还有常见的真菌荧光染色液，该染色液仅能对样本中的真菌进行染色，而同样重要的细菌却无法检出。因此需要一种能够快速检测多种微生物的染色检测方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种微生物多重荧光染色液，以解决现有检测技术存在的问题。本发明具有操作流程简单，检测速度快，以及病原微生物染色后容易观测识别的优点。

本发明的第二目的在于提供该微生物多重荧光染色液的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明涉及一种微生物多重荧光染色液，包括荧光染色剂、缓冲溶液、抗淬灭剂、抑菌剂和水。

优选地，所述荧光染色剂选自荧光增白剂、异硫氰酸荧光素(FITC)、Sybr GreenI、Sybr GreenⅡ、吡啰红G、溴化乙啶、碘化丙啶(PI)、藻红素、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)中的至少一种。

优选地，所述荧光染色剂为荧光增白剂染色剂、异硫氰酸荧光素(FITC)和多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)的组合物。

优选地，所述多重荧光染色液中，所述荧光增白剂的浓度为0.01～500mg/L(W/V)；异硫氰酸荧光素(FITC)的浓度为0.01～50mg/L(W/V)；多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)的浓度为0.001～5mg/L(W/V)。

优选地，所述缓冲溶液选自乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液。

优选地，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，含有的缓冲盐为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，其中磷酸二氢钠的浓度为0.1～50g/L(W/V)，磷酸氢二钠的浓度为0.1～200g/L(W/V)。

优选地，所述抗淬灭剂选自1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷、N-丙基没食子酸盐、丙三醇、对苯二胺、抗坏血酸中的至少一种，更优选为丙三醇。

优选地，所述抗淬灭剂的浓度为0.05～50ml/L(V/V)。

优选地，所述抑菌剂选自硫柳汞、叠氮钠、Proclin 300、庆大霉素中的至少一种，优选为Proclin 300。

优选地，所述的抑菌剂浓度为0.1～10g/L(W/V)。

优选地，所述微生物多重荧光染色液中各组分的含量如下：

本发明还涉及所述微生物多重荧光染色液的应用，其适用于阴道分泌物样本、宫颈脱落细胞样本、皮肤类样本、痰液类样本的微生物检测。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种微生物多重荧光染色液，将其滴加到微生物样本上即可在紫外光下进行显微镜检。这一操作简单便捷，大大降低了操作人员的工作强度，可实现大量样本的快速检测。并且灵敏度和准确率高，适用范围广泛。

附图说明

图1为实验例1中，采用微生物多重荧光染色液1对外阴阴道假丝酵母菌感染样本染色效果照片。

图2为实验例1中，采用微生物多重荧光染色液2对外阴阴道假丝酵母菌感染样本染色效果照片。

图3为实验例2中，采用微生物多重荧光染色液1对毛囊炎临床样本染色效果照片。

图4为实验例2中，采用微生物多重荧光染色液2对毛囊炎临床样本染色效果照片。

图5为实验例3中，采用微生物多重荧光染色液1对痤疮临床样本染色效果照片。

图6为实验例3中，采用微生物多重荧光染色液2对痤疮临床样本染色效果照片。

图7为实验例4中，采用微生物多重荧光染色液1对几种微生物混合菌悬液样本染色效果照片。

图8为实验例4中，采用微生物多重荧光染色液2对几种微生物混合菌悬液样本染色效果照片。

图9为实验例5中，采用微生物多重荧光染色液1对玫瑰色毛癣菌样本染色效果照片。

图10为实验例5中，采用微生物多重荧光染色液1对絮状表皮毛癣菌样本样本染色效果照片。

图11为实验例5中，采用微生物多重荧光染色液2对玫瑰色毛癣菌样本染色效果照片。

图12为实验例5中，采用微生物多重荧光染色液2对絮状表皮毛癣菌样本样本染色效果照片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

本发明实施例涉及一种微生物多重荧光染色液，包括荧光染色剂、缓冲溶液、抗淬灭剂、抑菌剂和水。

本发明提供的微生物多重荧光染色液中，荧光染色剂可选择对真菌细胞壁特殊成分及细菌表面成分结合染色的荧光染料，通过荧光染色剂对不同微生物进行染色。在本发明的一个实施例中，荧光染色剂选自荧光增白剂、异硫氰酸荧光素(FITC)、Sybr Green I、Sybr GreenⅡ、吡啰红G、溴化乙啶、碘化丙啶(PI)、藻红素、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)中的至少一种。

其中，荧光增白剂可与人体各类组织或样本(包括皮屑、甲屑、毛发、尿液、体液以及阴道分泌物等)中可能存在的细胞壁β-多糖类物质特异性的结合，从而标记荧光进行检测。各种丝状真菌及酵母菌均可以被荧光染色，包括念珠菌属、毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子菌属、组织胞浆菌属、曲霉属等。

异硫氰酸荧光素为黄色粉末，能与各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中仍有强烈绿色荧光，加酸后析出沉淀，荧光消失，微溶于丙酮、乙醚和石油醚。

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，是高灵敏的DNA荧光染料。SYBR Green I一般用来染双链DNA，染色过程中嵌入DNA螺旋的小沟内；SYBR GreenII一般用来染单链DNA和RNA。

吡罗红G，又名派洛宁G，吡罗红使RNA呈现红色，常用于检测细胞中RNA的分布。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。

溴化乙啶(ethidium bromide，EB)是最常用的嵌入性荧光染料，活细胞或固定细胞均能从极稀溶液中摄取EB染料，DNA螺旋暂时弯曲允许EB荧光染料嵌入大分子疏水中心的碱基对之间。

碘化丙啶是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。

藻红素(phycoerythrin)存在于藻类〔红藻、蓝藻、隐(甲)藻〕的色素蛋白，开环的四吡咯藻红素作为色素部分与蛋白质共价键结合。其辅基是吡咯环所组成的链，分子中不含金属，与蛋白质结合在一起。

多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)是从横裂甲纲门sp.中分离出来的。PerCP属于活体荧光成像蛋白标记染料，它们能产生更亮、耐光性更好的荧光，相对短波长的青蓝素染料而言，活体荧光成像蛋白标记染料是青蓝素染料卓越的替代品。

在本发明的一个优选实施例中，荧光染色剂为荧光增白剂染色剂、异硫氰酸荧光素(FITC)和多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)的组合物。选择上述三种荧光染色剂的组合，是因为部分样本中同时存在真菌和细菌，不同的荧光染色剂对不同的真菌和细菌有不同的结合，可以通过这些结合的差异以及形态来区分真菌和细菌。本发明中荧光增白剂优选荧光增白剂28，异硫氰酸荧光素优选异硫氰酸荧光素异构体I。

在本发明的一个实施例中，多重荧光染色液中，荧光增白剂的浓度为0.01～500mg/L(W/V)；异硫氰酸荧光素(FITC)的浓度为0.01～50mg/L(W/V)；多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)的浓度为0.001～5mg/L(W/V)。上述浓度范围是根据微生物(包括真菌和细菌)的种类和含量进行选择。

本发明的染色液缓冲试剂可选用本领域常规使用的缓冲溶液，例如乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液。

在本发明的一个实施例中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，含有的缓冲盐为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，其中磷酸二氢钠的浓度为0.1～50g/L(W/V)，磷酸氢二钠的浓度为0.1～200g/L(W/V)。缓冲溶液中缓冲盐的浓度根据需要调节的pH值范围确定。

抗淬灭剂的主要作用是延长荧光染色剂的淬灭时间，以及起到保湿封片的作用。在本发明的一个实施例中，抗淬灭剂选自1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷、N-丙基没食子酸盐、丙三醇、对苯二胺、抗坏血酸中的至少一种，更优选为丙三醇。抗淬灭剂的浓度根据荧光素的浓度确定，优选抗淬灭剂的浓度为0.05～50ml/L(V/V)。

抑菌剂的主要作用是抑制细菌生长。在本发明的一个实施例中，抑菌剂选自硫柳汞、叠氮钠、Proclin 300、庆大霉素中的至少一种，更优选为Proclin 300。PC-300抑菌剂是一种高效的、专用于体外诊断试剂的抑菌剂，包含用于各种试剂、质控品、校准品、缓冲液和层析中的流动相。PC-300抑菌剂能抑制细菌、真菌、酵母菌生长。本发明中优选抑菌剂的浓度为0.1～10g/L(W/V)。

在本发明的一个优选实施例中，微生物多重荧光染色液中各组分的含量如下：

该微生物多重荧光染色液可采用本领域通用的方法制备得到。具体为向纯化水中加入配方量的缓冲盐搅拌溶解，然后依次加入配方量的荧光增白剂、异硫氰酸荧光素和多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物混合均匀，再依次加入配方量的抗淬灭剂和抑菌剂。所有试剂加入完毕后，将混合溶液持续搅拌至完全溶解，最后定容得到该微生物多重荧光染色液。

本发明实施例还涉及微生物多重荧光染色液的应用，其适用于阴道分泌物样本、宫颈脱落细胞样本、皮肤类样本、痰液类样本的微生物检测。

实施例1

微生物多重荧光染色液1，其配方组成如表1所示。

表1

该微生物多重荧光染色液的制备方法如下：

向烧杯中加入500ml纯化水，分别加入精密分析天平称取配方量的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠搅拌溶解。溶解后依次加入配方量的荧光增白剂、异硫氰酸荧光素和多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物，混合均匀。然后依次加入配方量的丙三醇和Proclin 300。所有试剂加入完毕后，将混合溶液持续搅拌至完全溶解，将溶液倒入容量瓶后清洗烧杯并回收清洗液3次，用纯化水定容至1L。

实施例2

微生物多重荧光染色液2，其配方组成如表2所示。

表2

该微生物多重荧光染色液的制备方法同实施例1。

实验例1阴道分泌物临床样本的染色

选取确诊的外阴阴道假丝酵母菌病样本，将样本拭子涂抹在两份载玻片上，得到两份样本。将上述微生物多重荧光染色液1和微生物多重荧光染色液2分别直接滴加到两份样本上，盖上盖玻片，使用吸水纸吸去多余染色液。选择波长为350-400nm的紫外光作为激发光，置于生物(荧光)显微镜物镜下，进行直接镜检。染色后可见明显的病原微生物，为白色假丝酵母菌。微生物多重荧光染色液1和微生物多重荧光染色液2对于阴道分泌物样本染色效果分别如图1和图2所示，图中较小的椭圆形串珠区域为白色念珠菌菌丝形态。

实验例2毛囊炎临床样本的染色

选取毛囊炎内容物稀释到适量生理盐水中，直接吸取样本液涂抹在两份载玻片上，得到两份样本。加热固定后，向两份样本分别滴加微生物多重荧光染色液1和微生物多重荧光染色液2，盖上盖玻片，使用吸水纸吸去多余染色液。选择波长为350-400nm的紫外光作为激发光，置于生物(荧光)显微镜物镜下，进行直接镜检。染色后可见明显的病原微生物，真菌和细菌表现出不同的颜色和形态。微生物多重荧光染色液1和微生物多重荧光染色液2对于毛囊炎临床样本染色效果分别如图3和图4所示，其中较大的长棒状微生物为真菌，较细的点状微生物为细菌。

实验例3痤疮临床样本的染色

利用粉刺针刺破痤疮，按压取得痤疮深层内容物稀释到适量生理盐水中，直接吸取样本液涂抹在两份载玻片上，得到两份样本。加热固定后，向两份样本分别滴加微生物多重荧光染色液1和微生物多重荧光染色液2，盖上盖玻片，使用吸水纸吸去多余染色液。选择波长为350-400nm的紫外光作为激发光，置于生物(荧光)显微镜物镜下，进行直接镜检。染色后可见明显的病原微生物，真菌和细菌表现出不同的颜色和形态。微生物多重荧光染色液1和微生物多重荧光染色液2对于痤疮临床样本染色效果分别如图5和图6所示。

实验例4几种微生物混合菌悬液染色

选取金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、糠秕马拉色菌、球形马拉色菌作为染色目标物，在超净工作台内用接种环挑取上述几种菌混合到生理盐水中制成混合菌悬液，直接吸取菌悬液涂抹在两份载玻片上，得到两份样本。加热固定后，向两份样本分别滴加微生物多重荧光染色液1和微生物多重荧光染色液2，盖上盖玻片，使用吸水纸吸去多余染色液。选择波长为350-400nm的紫外光作为激发光，置于生物(荧光)显微镜物镜下，进行直接镜检。染色后可明显分辨上述几种微生物。微生物多重荧光染色液1和微生物多重荧光染色液2对于上述几种微生物混合菌悬液样本染色效果分别如图7和图8所示，其中较大的紫色荧光区域为糠秕马拉色菌和球形马拉色菌，绿色荧光区域为金黄色葡萄球菌，红色荧光区域为表皮葡萄球菌，红色荧光杆状区域为痤疮丙酸杆菌。

实验例5两种皮肤癣菌染色

选取玫瑰色毛癣菌、絮状表皮毛癣菌作为染色目标物，在超净工作台内分别用接种环挑取上述两种菌混合到生理盐水中制成菌悬液，直接吸取菌悬液涂抹在载玻片上，每种菌制备两份样本，得到四份样本。加热固定后，将微生物多重荧光染色液1分别滴加于玫瑰色毛癣菌和絮状表皮毛癣菌的样本上，将微生物多重荧光染色液2分别滴加于玫瑰色毛癣菌和絮状表皮毛癣菌的样本上。盖上盖玻片，使用吸水纸吸去多余染色液。选择波长为350-400nm的紫外光作为激发光，置于生物(荧光)显微镜物镜下，进行直接镜检。微生物多重荧光染色液1对于玫瑰色毛癣菌、絮状表皮毛癣菌样本染色效果分别如图9和图10所示。微生物多重荧光染色液2对于玫瑰色毛癣菌、絮状表皮毛癣菌样本染色效果分别如图11和图12所示，其中红色丝状区域为玫瑰色毛癣菌，绿色丝状区域为絮状表皮毛癣菌。

实验例6 60例毛囊炎样本微生物检出结果对比

选取60例具有毛囊炎特征的样本进行检测，对比革兰氏染色、真菌荧光染色和微生物多重荧光染色液1的结果。样本中的细菌和真菌检出情况如表3所示，表中1、2行是检出细菌或真菌的样本数。可以得出微生物多重荧光染色液在样本的细菌和真菌检测方面较传统的检测方法具有明显的优势。

表3

	革兰氏染色液	真菌荧光染色液	微生物多重荧光染色液
				细菌	34	0	48
真菌	21	33	39
				细菌检出率	56.7％	0％	80％
真菌检出率	35％	55％	65％

除去微生物多重荧光染色液2中的荧光增白剂染色剂、异硫氰酸荧光素(FITC)或多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)，对相同的毛囊炎样本进行检测，样本中的细菌和真菌检出情况如表4所示，说明如果除去三种荧光染色剂中的一种，检出率会有所下降，因此三种荧光染色剂必须使用。

表4

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种微生物多重荧光染色液，其特征在于，包括荧光染色剂、缓冲溶液、抗淬灭剂、抑菌剂和水；

所述荧光染色剂为荧光增白剂28、异硫氰酸荧光素和多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物的组合物；

所述缓冲溶液选自乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液；

所述抗淬灭剂选自1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷、N-丙基没食子酸盐、丙三醇、对苯二胺、抗坏血酸中的至少一种；

所述抑菌剂选自硫柳汞、叠氮钠、Proclin 300、庆大霉素中的至少一种；

所述多重荧光染色液中，所述荧光增白剂28的浓度为0.1～1mg/L；异硫氰酸荧光素的浓度为2～5mg/L；多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物的浓度为1～3mg/L。

2.根据权利要求1所述的微生物多重荧光染色液，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，含有的缓冲盐为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，其中磷酸二氢钠的浓度为0.1～50g/L，磷酸氢二钠的浓度为0.1～200g/L。

3.根据权利要求1所述的微生物多重荧光染色液，其特征在于：所述抗淬灭剂为丙三醇；和/或，所述抗淬灭剂的浓度为0.05～50ml/L。

4.根据权利要求1所述的微生物多重荧光染色液，其特征在于：所述抑菌剂为Proclin300；和/或，所述的抑菌剂浓度为0.1～10g/L。

5.根据权利要求1至4任一项所述的微生物多重荧光染色液，其特征在于，所述微生物多重荧光染色液中各组分的含量如下：

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