CN111019999B - 一种微生物荧光染色液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物荧光染色液及其应用。所述微生物荧光染色液包括凝集素、荧光素、核酸染料、缓冲溶液、抗淬灭剂、抑菌剂和水；可应用于微生物染色，其利用凝集素对糖蛋白的特异性识别和核酸染料对核酸的特异性染色，使得真菌呈现蓝色、绿色或者红色，细菌呈现红色，结合形态学实现对阴道分泌物样本、宫颈脱落细胞样本、皮肤样本以及痰液样本中微生物的检测，且可将检测结果可视化，更为直接、合理的对微生物种类进行判断。

Description

一种微生物荧光染色液及其应用

技术领域

本发明属于微生物标记及染色领域，具体涉及一种微生物荧光染色液及其应用。

背景技术

微生物在自然界广泛存在，对人体的保护发挥着极其重要的作用。人的体表以及与外界相连的腔道，如口腔、呼吸道、肠道、泌尿生殖道，皮肤组织等都存在着不同种类和数量的微生物。它们与人体环境共同构成了微生态系统，并保持着动态平衡，一旦平衡被打破，可能会引起相关疾病。因此，微生物的检测对于人体保护以及疾病的预防、诊断和治疗具有极其重要的意义。

传统的微生物检测技术有培养鉴定法：将患处采集的样本接种至适应其生长的培养基上，在相应的需氧和厌氧环境下进行恒温培养，从初步的培养基上分离纯化不同的微生物后进一步根据生化及形态学鉴定微生物种类。但此种培养法一般培养周期较长且微生物可能生长不好，以致不能成功培养，且所需条件复杂，需要全套的微生物培养以及鉴定设备及独立空间，且对培养操作人员技术要求较高。

后续发展的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法虽然对于菌种的鉴定上具有极高的准确性，但是该法的检测对象一般为纯菌落，所以该法依然依赖于微生物的培养和纯化，且仪器昂贵，极大限制了推广和临床应用。

实时荧光定量PCR也是研究中经常采用的一项检测技术，可以在较低模板浓度下实现对微生物的准确定量分析。但是该方法仅适用于已知DNA序列的微生物，对序列未知的微生物无法检测。而且该检测仪器较昂贵且操作复杂、费时，对技术人员要求较高。

除以上鉴定方法外，微生物染色技术在微生物检测过程中也发挥着越来越重要的作用。传统的染色技术有革兰氏染色，该方法在由4个染色步骤组成，但是脱色步骤容易过度脱色，造成结果的假阴性。

另外现有真菌荧光染色液是一种含有荧光素和抑制背景荧光着色试剂的复合溶液。如果待测标本中含有真菌，经过特殊荧光素标联的重组几丁质酶可以高亲和力将与非特异真菌细胞壁上的β-多糖结合，如几丁质和纤维素等，其染色液成分中添加伊文思蓝作为抑制背景荧光着色试剂。在荧光显微镜下可清楚的观察到看到真菌形态在特定激发光下产生的荧光。但是此染色液仅仅能够针对于真菌进行染色，且添加了具有致癌成分的伊文思蓝试剂，对于人员操作具有一定危害性。况且检测过程中易受环境污染，镜下纤维会有强荧光干扰，对临床工作者诊断具有干扰性。同时，其诊断对于临床，对颜色无区分度，按照荧光强弱及镜下具体形态来具体判断，更多依赖于临床检验医师的经验。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种微生物荧光染色液及其制备方法与染色方法。所述微生物荧光染色液从组成原料安全，能够对微生物进行特定的染色，使得真菌呈现蓝色、绿色或红色，细菌呈现红色，结合形态学实现对导致感染的微生物进行染色，将检测结果可视化，更为直接、合理的对微生物种类进行判断。

本发明的方案是，提供一种微生物荧光染色液，包括凝集素、荧光素、核酸染料、缓冲溶液、抗淬灭剂、抑菌剂和水。

为了便于理解本发明，现对本发明中的相关原理作进一步解释。

凝集素是一种无免疫原性蛋白质，分子量为11000～335000之间，可从植物或动物中提取，具有凝集红细胞的特性。凝集素能特异地与糖蛋白中的糖基反应，而糖蛋白广泛分布在细胞衣、细胞表面、细胞内各种亚细胞膜囊的游离面以及上皮细胞之间，在生命活动中具有重要功能。同时凝集素具有多价结合能力.能与多种标记物结合。可作为组织化学的特异性探针，在光镜或电镜水平显示其结合部位。从而广泛用于糖蛋白的性质、分布以及正常细胞更新过程中糖蛋白变化的研究。凝集素可作为组织化学的特异性探针广泛用于光镜的石蜡切片和冰冻切片、电镜树脂包埋超薄切片及冰冻超薄切片等标本的观察。为使结合在细胞膜上单糖的凝集素呈现可视性。

核酸染料属于核酸分子嵌入剂，通常用于分子遗传学、DNA和染色质结构分析等研究中。红色荧光核酸染料是极易渗透细胞膜与胞内DNA嵌合的小分子，它具有平面共轭大环结构，是典型的DNA分子插入试剂，菲啶环插入到DNA分子的碱基对之间，与DNA嵌合形成稳定的复合物，并影响DNA的复制，破坏正常的遗传生理现象。

故以此来对微生物进行荧光标记。

优选地，所述凝集素为刀豆素A、麦胚素、花生凝集素、大豆凝集素、西非单叶豆凝集素或荆豆凝集素中的一种；所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、镧系元素、藻红蛋白或罗丹明123中的一种；所述核酸染料为多甲藻叶绿素蛋白、碘化丙啶、溴化乙啶、吖啶橙和DAPI中的一种；所述缓冲溶液为乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中的一种；所述抗淬灭剂为1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷、N-丙基没食子酸盐、丙三醇、对苯二胺或抗坏血酸中的一种或几种的组合；所述抑菌剂为硫柳汞、叠氮钠、Proclin 300或庆大霉素中的一种或几种的组合。

优选地，所述凝集素为麦胚素，浓度为0.05～5g/L。

优选地，所述荧光素为异硫氰酸荧光素，浓度为0.05～1g/L。

优选地，所述核酸染料为碘化丙啶，浓度为0.01～50mg/L。

优选地，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，其中磷酸二氢钠的浓度为0.1～50g/L，磷酸氢二钠的浓度为0.1～200g/L。

优选地，所述抗淬灭剂为丙三醇，浓度为0.05～50ml/L。

优选地，所述抑菌剂为Proclin 300，浓度为0.1～10g/L。

优选地，每升所述微生物荧光染色液中的各组分含量为：麦胚素0.05～5g/L、异硫氰酸荧光素0.05～1g/L、碘化丙啶0.01～50mg/L、磷酸二氢钠0.1～50g/L、磷酸氢二钠0.1～200g/L、丙三醇0.05～50ml/L、Proclin 300 0.1～10g/L以及余量的水。

基于相同的技术构思，本发明还提供一种所述微生物荧光染色液在检测阴道分泌物样本、宫颈脱落细胞样本、皮肤样本以及痰液样本中的应用。

基于相同的技术构思，本发明的再提供一种采用所述微生物荧光染色液进行染色的方法，包括如下步骤：

(i)制片：取载玻片进行加热至58～62℃，并将待测的含有微生物的样本稀释液移至载玻片中间区域并进行固定，制片完成；

(ii)染色：将微生物荧光染色液与样本稀释液进行覆盖并染色30s～30min，孵育温度为25～37℃；

(iii)封片：取盖玻片直接加盖染色完成的载玻片，吸取多余液体后放置纯水中清洗，用以甘油进行封片；

(iv)镜检：取已封片的样片于荧光显微镜下以400～600nm的波段进行观测，查看微生物菌群的形态及荧光强度。

其中，含有微生物的样本稀释液为阴道分泌物样本、宫颈脱落细胞样本、皮肤样本或痰液样本。

本发明的有益效果为：

本发明所述的微生物荧光染色液，利用凝集素对糖蛋白的特异性识别和核酸染料对核酸的特异性染色，通过凝集素标记荧光素，并与核酸染料按科学、合理的比例与抑菌剂和抗淬灭剂进行混合，实现对导致感染的微生物进行染色，将检测结果可视化，更为直接、合理的对微生物种类进行判断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1、2、3和4均是样本被本发明所述微生物荧光染色液染色后，于荧光显微镜下所拍摄的照片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种微生物荧光染色液的制备方法，具体为：

向烧杯中加入500ml的纯化水，并按表1配方浓度加入麦胚素、异硫氰酸荧光素、碘化丙啶、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、丙三醇和Proclin 300，最后用纯化水定容至1L，即得微生物荧光染色液。

表1实施例1中微生物荧光染色液配方组成

实施例2、实施例3

实施例2、3提供一种微生物荧光染色液的制备方法，与实施例1的区别在于，原料的浓度不同，具体配方如表2所示。

表2实施例2、3中微生物荧光染色液配方组成

组成物质	实施例2浓度	实施例3浓度
			麦胚素	5g/L	2.5g/L
异硫氰酸荧光素	1g/L	0.5g/L
			碘化丙啶	50mg/L	25mg/L
磷酸二氢钠	50g/L	25g/L
			磷酸氢二钠	200g/L	100g/L
丙三醇	50ml/L	25ml/L
			Proclin 300	10g/L	5g/L
纯化水	定容至1L	定容至1L

实施例4～实施例8

实施例4～实施例8提供一种微生物荧光染色液的制备方法，与实施例3的区别在于，原料组成不同，但相同类型的组分其浓度是相通的，具体配方如表3所示。

表3实施例4～8中微生物荧光染色液配方组成

实施例9

本实施例提供一种微生物荧光染色液进行染色的方法，包括如下步骤：

(i)制片：取多聚赖氨酸载玻片进行加热至58℃，并用移液器吸取5μl阴道分泌物样本稀释液至载玻片中间区域并进行固定，制片完成；

(ii)染色：采用移液器将50μl微生物荧光染色液与样本稀释液进行覆盖并染色30s，再于25℃条件下孵育；

(iii)封片：取盖玻片直接加盖染色完成的载玻片，吸取多余液体后放置纯水中清洗，用以甘油进行封片；

(iv)镜检：取已封片的样片置于400～600nm波段的荧光显微镜下进行观测，查看微生物菌群的形态及荧光强度。

实施例10～实施例12

实施例10、11和12提供微生物荧光染色液进行染色的方法，与实施例9的区别在于载玻片的种类、载玻片的加热温度、样本稀释液来源、染色时间和孵育温度不同，其他操作均相同，具体如表4所示。

表4实施例10～12中相关操作细节

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种微生物荧光染色液，其特征在于，包括凝集素、荧光素、核酸染料、缓冲溶液、抗淬灭剂、抑菌剂和水；

所述凝集素为刀豆素A、麦胚素、花生凝集素、大豆凝集素、西非单叶豆凝集素或荆豆凝集素中的一种；

所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、镧系元素、藻红蛋白或罗丹明123中的一种；

所述核酸染料为多甲藻叶绿素蛋白、碘化丙啶、溴化乙啶、吖啶橙和DAPI中的一种；

所述缓冲溶液为乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中的一种；

所述抗淬灭剂为1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷、N-丙基没食子酸盐、丙三醇、对苯二胺或抗坏血酸中的一种或几种的组合；

所述抑菌剂为硫柳汞、叠氮钠、Proclin300或庆大霉素中的一种或几种的组合。

2.根据权利要求1所述的微生物荧光染色液，其特征在于，所述凝集素为麦胚素，浓度为0.05～5g/L。

3.根据权利要求1所述的微生物荧光染色液，其特征在于，所述荧光素为异硫氰酸荧光素，浓度为0.05～1g/L。

4.根据权利要求1所述的微生物荧光染色液，其特征在于，所述核酸染料为碘化丙啶，浓度为0.01～50mg/L。

5.根据权利要求1所述的微生物荧光染色液，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，其中磷酸二氢钠的浓度为0.1～50g/L，磷酸氢二钠的浓度为0.1～200g/L。

6.根据权利要求1所述的微生物荧光染色液，其特征在于，所述抗淬灭剂为丙三醇，浓度为0.05～50ml/L。

7.根据权利要求1所述的微生物荧光染色液，其特征在于，所述抑菌剂为Proclin300，浓度为0.1～10g/L。

8.根据权利要求5所述的微生物荧光染色液，其特征在于，每升所述微生物荧光染色液中的各组分含量为：麦胚素0.05～5g/L、异硫氰酸荧光素0.05～1g/L、碘化丙啶0.01～50mg/L、磷酸二氢钠0.1～50g/L、磷酸氢二钠0.1～200g/L、丙三醇0.05～50ml/L、Proclin3000.1～10g/L以及余量的水。

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