CN108866149B - 一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂、其应用以及真菌检测试剂盒 - Google Patents

一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂、其应用以及真菌检测试剂盒 Download PDF

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CN108866149B CN201710331241.8A CN201710331241A CN108866149B CN 108866149 B CN108866149 B CN 108866149B CN 201710331241 A CN201710331241 A CN 201710331241A CN 108866149 B CN108866149 B CN 108866149B
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Abstract

本发明涉及一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂、其应用以及真菌检测试剂盒，所述荧光染色试剂的结构如式Ⅰ所示：其中，X为‑SO3 ‑、卤原子或H，Y为‑NHCN2CH2OH、‑NHC2H5OH、‑N(OCH2CH3)2、‑N(CH2CH2OH)2或H，R为‑NHCN2CH2OH、‑N(OCH2CH3)2、‑NHC2H5OH、‑N(CH2CH2OH)2、‑N(OH)CH2CH3或H，Z为‑SO3 ‑或H，A为‑SO3 ‑或H，E为‑SO3 ‑或H。所述的荧光染色试剂可在真菌检测试剂盒中应用。所述试剂盒包括所述的荧光染色试剂和碱液。本发明中的荧光染色试剂与真菌结合能力强，着色清晰，不易淬灭，且不使用背景染料也能够非常清晰的显示真菌细胞。而且这些荧光染色试剂可制成试剂盒，具有极其重要的临床应用价值。
Figure DDA0001292593360000011

Description

一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂、其应用以及真菌检 测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学生物等领域，具体涉及一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂、其应用以及真菌检测试剂盒。
背景技术
真菌的检测，在医学、动物学、植物学等领域应用广泛，尤其是针对人体真菌感染性疾病、真菌导致的动植物病虫害等，目前常用的检测方法有，真菌氢氧化钾(KOH)湿片法、革兰氏染色法、真菌培养、PCR、1,3-β-D葡聚糖、半乳甘露聚糖、甘露聚糖、隐球菌荚膜抗原等抗原检查法、荧光检测法等。
荧光检测法是一种应用很多年的检测方法，可以快速有效的提高真菌的诊断水平。但受限于荧光显微镜和荧光试剂的问题，临床上并未大规模推广。目前常用的荧光试剂为Calcofluor White(CFW)，其能与真菌结合，在紫外光的激发下发生荧光，CFW一般需要联合Evans blue(EB，一种复染剂)一起使用，EB能减少背景中组织和细胞的荧光，令真菌染色更为突出。
而且CFW特异性结合能力较差，淬灭时间较快，且需要紫外(UV)或近紫外(nearUV)光来激发，有时受限制于荧光显微镜或应用比较昂贵的共聚焦显微镜才能激发。同时，CFW也能使背景组织发出较亮的荧光，会影响真菌与背景的判断。
除了CFW这种荧光染料，还有一些研究应用FM4-64和Filipin两种荧光染剂对阿萨希毛孢子菌(T.asahii)进行特异的荧光染色，或者双苯咪唑Hoechst 33258(Bisbenzimide)等荧光染料。
此外，临床对皮肤碎屑，口腔分泌物标本，阴道分泌物的标本，痰标本，肺泡灌洗液标本，尿液，脑脊液等体液标本的检测方法最常用的是KOH湿片法直接镜检或真菌培养法，极个别研究型实验室还可以进行PCR(polymerase chain reaction)和PAS(periodicacid-Schiff)染色。也扩大了临床真菌检测的手段。而面对KOH阳性率低，镜下真菌不好识别，需要高技术的技师来操作等限制，而真菌培养耗时长，容易污染，PCR和PAS耗时长，需要较高的实验室条件，且无法普及，基本未在临床推广等实际问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂、其应用以及真菌检测试剂盒，以解决现有技术中提到的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂，所述荧光染色试剂的结构为如式Ⅰ所示：
Figure BDA0001292593340000021
其中，X为-SO3 -(磺酸根离子)、卤原子或H，Y为-NHCN2CH2OH、-N(OCH2CH3)2、-N(CH2CH2OH)2、-NHC2H5OH、H或吗啉
Figure BDA0001292593340000022
R为-NHCN2CH2OH、-N(OCH2CH3)2、-N(CH2CH2OH)2、-N(OH)CH2CH3、-NHC2H5OH、H或吗啉
Figure BDA0001292593340000023
Z为-SO3 -(磺酸根离子)或H，A为-SO3 -或H，E为-SO3 -或H。
进一步地，所述荧光染色试剂为：式Ⅰ中所述X为-H，Y为-NHCN2CH2OH，R为-NHCN2CH2OH或-N(OH)CH2CH3，Z为H，A为H，E为H。
进一步地，所述荧光染色试剂为：式Ⅰ中所述X为H，Y为-N(OCH2CH3)2，R为-N(OCH2CH3)2，Z为H，A为H，E为H。
进一步地，所述荧光染色试剂为：式Ⅰ中所述X为-SO3 -(磺酸根离子)，Y为-NHCN2CH2OH或-N(OCH2CH3)2，R为-NHCN2CH2OH或-N(OCH2CH3)2，Z为-SO3 -(磺酸根离子)，A为H，E为H。
进一步地，所述荧光染色试剂为：式Ⅰ中所述X为Cl，Y为-NHC2H5OH，R为-NHC2H5OH，Z为H，A为H，E为H。
进一步地，所述荧光染色试剂为：式Ⅰ中所述X为-SO3 -，Y为
Figure BDA0001292593340000031
吗啉，R为
Figure BDA0001292593340000032
吗啉，Z为-SO3 -，A为-SO3 -，E为-SO3 -。
一种所述的荧光染色试剂在真菌检测试剂盒中的应用。
一种真菌检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的荧光染色试剂和碱液。
进一步地，所述荧光染色试剂的浓度为0.1～1％(g/mL)，所述碱液为10％(g/mL)的KOH。
进一步地，所述真菌检测试剂盒所能检测的临床标本至少包括皮肤碎屑、口腔分泌物、阴道分泌物、痰、肺泡灌洗液、尿液以及脑脊液中的真菌。
进一步地，所述真菌检测试剂盒所能检测的真菌种类至少包括皮肤癣菌、念珠菌属、孢子丝菌病、镰刀菌、曲霉属以及瓶霉属，还可包括真菌感染造成的动植物病虫害中所涉及到的真菌。
进一步地，所述试剂盒还包括背景染料，如EB等。
本发明至少具有以下有益效果：
①本发明扩大了应用于真菌检测中的荧光染色试剂的种类，例如，将应用于染布料或纸浆或洗涤用的荧光增白剂85、荧光增白剂87、荧光增白剂113、荧光增白剂353等应用于医学领域的临床上，其与真菌的特异性结合能力强，着色非常清晰，并且不易淬灭，更重要的是，其对背景细胞的结合能力弱，即染色能力差，使得不使用背景染料也能够非常清晰的显示真菌细胞，而很多背景染料毒性较大，价格也不便宜，因此，本发明可避免使用有毒有害的背景染料且降低成本。
而且这些荧光染色试剂资源丰富，获取容易，无毒无害，大大的增加了真菌检测中对于荧光试剂的选择。
②本发明中的荧光染色试剂可制成试剂盒，提供了新的诊断方法，并提高了临床真菌的诊断效率和阳性率，大大缩短检测时间，操作简单，容易鉴别，可对临床上的皮肤碎屑、口腔分泌物标本、阴道分泌物的标本、痰标本、肺泡灌洗液标本、尿液、脑脊液等体液标本中的真菌进行快速检测，且效果好；由于本发明可选择应用非常广泛、资源丰富、获取容易的荧光增白剂，可大大降低试剂盒成本。
③适宜量的氢氧化钾的加入提高了真菌的检出率，尤其是医学上浅部和深部的真菌感染；本发明可保证荧光染料可以与真菌紧密结合，且不与角质细胞或上皮细胞等结合或二者可以明显区分，而且KOH可以溶解角质层，本发明中的荧光增白剂85、荧光增白剂87、荧光增白剂113、荧光增白剂353、荧光增白剂31等等荧光染色试剂与碱性溶液之间不发生相互作用，使其更好的与真菌细胞发生特异性结合。
本发明具有极其重要的临床应用价值。
附图说明
通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：
图1为本发明实施例中所述的荧光增白剂85染色后的红色毛癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图2为本发明实施例中所述的荧光增白剂85染色后的须癣毛癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图3为本发明实施例中所述的荧光增白剂85染色后的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图4为本发明实施例中所述的荧光增白剂85染色后的孢子丝菌病在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图5为本发明实施例中所述的荧光增白剂85染色后的黄曲霉在荧光显微镜下的示意图(X10)；
图6为本发明实施例中所述的荧光增白剂85染色后的疣状瓶霉在荧光显微镜下的示意图(X20)；
图7为本发明实施例中所述的荧光增白剂85染色后的念珠菌性阴道炎标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图8为本发明实施例中所述的荧光增白剂85染色后的临床甲癣标本中的皮肤癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图9为本发明实施例中所述的荧光增白剂85染色后的临床花斑癣标本中的糠秕孢子菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图10为本发明实施例中所述的荧光增白剂85染色后的肺泡灌洗液标本中的曲霉在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图11为本发明实施例中所述的荧光增白剂85染色后的尿液标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图12为本发明实施例中所述的0.1％荧光增白剂85染色后的痰标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图13为本发明实施例中所述的荧光增白剂87染色后的红色毛癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图14为本发明实施例中所述的荧光增白剂87染色后的须癣毛癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图15为本发明实施例中所述的荧光增白剂87染色后的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图16为本发明实施例中所述的荧光增白剂87染色后的孢子丝菌病在荧光显微镜下的示意图(X20)；
图17为本发明实施例中所述的荧光增白剂87染色后的黄曲霉在荧光显微镜下的示意图(X10)；
图18为本发明实施例中所述的荧光增白剂87染色后的疣状瓶霉在荧光显微镜下的示意图(X20)；
图19为本发明实施例中所述的荧光增白剂87染色后的念珠菌性阴道炎标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图20为本发明实施例中所述的荧光增白剂87染色后的临床甲癣标本中的皮肤癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图21为本发明实施例中所述的荧光增白剂87染色后的临床花斑癣标本中的糠秕孢子菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图22为本发明实施例中所述的荧光增白剂87染色后的肺泡灌洗液标本中的曲霉在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图23为本发明实施例中所述的荧光增白剂87染色后的尿液标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图24为本发明实施例中所述的0.1％荧光增白剂87染色后的痰标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图25为本发明实施例中所述的荧光增白剂113染色后的红色毛癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图26为本发明实施例中所述的荧光增白剂113染色后的须癣毛癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图27为本发明实施例中所述的荧光增白剂113染色后的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图28为本发明实施例中所述的荧光增白剂113染色后的孢子丝菌病在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图29为本发明实施例中所述的荧光增白剂113染色后的黄曲霉在荧光显微镜下的示意图(X10)；
图30为本发明实施例中所述的荧光增白剂113染色后的疣状瓶霉在荧光显微镜下的示意图(X20)；
图31为本发明实施例中所述的荧光增白剂113染色后的念珠菌性阴道炎标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图32为本发明实施例中所述的荧光增白剂113染色后的临床甲癣标本中的皮肤癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图33为本发明实施例中所述的荧光增白剂113染色后的临床花斑癣标本中的糠秕孢子菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图34为本发明实施例中所述的荧光增白剂113染色后的肺泡灌洗液标本中的曲霉在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图35为本发明实施例中所述的荧光增白剂113染色后的尿液标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图36为本发明实施例中所述的0.1％荧光增白剂113染色后的痰标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图37为本发明实施例中所述的荧光增白剂31染色后的红色毛癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图38为本发明实施例中所述的荧光增白剂31染色后的须癣毛癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图39为本发明实施例中所述的荧光增白剂31染色后的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图40为本发明实施例中所述的荧光增白剂31染色后的孢子丝菌病在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图41为本发明实施例中所述的荧光增白剂31染色后的黄曲霉在荧光显微镜下的示意图(X10)；
图42为本发明实施例中所述的荧光增白剂31染色后的疣状瓶霉在荧光显微镜下的示意图(X20)；
图43为本发明实施例中所述的荧光增白剂31染色后的念珠菌性阴道炎标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图44为本发明实施例中所述的荧光增白剂31染色后的临床甲癣标本中的皮肤癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图45为本发明实施例中所述的荧光增白剂31染色后的临床花斑癣标本中的糠秕孢子菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图46为本发明实施例中所述的荧光增白剂31染色后的尿液标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图47为本发明实施例中所述的0.1％荧光增白剂31染色后的痰标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图48为本发明实施例中所述的荧光增白剂353染色后的红色毛癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图49为本发明实施例中所述的荧光增白剂353染色后的须癣毛癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图50为本发明实施例中所述的荧光增白剂353染色后的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图51为本发明实施例中所述的荧光增白剂353染色后的孢子丝菌病在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图52为本发明实施例中所述的荧光增白剂353染色后的黄曲霉在荧光显微镜下的示意图(X10)；
图53为本发明实施例中所述的荧光增白剂353染色后的念珠菌性阴道炎标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图54为本发明实施例中所述的荧光增白剂353染色后的临床甲癣标本中的皮肤癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图55为本发明实施例中所述的荧光增白剂353染色后的临床花斑癣标本在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图56为本发明实施例中所述的荧光增白剂353染色后的临床股癣标本中的皮肤癣菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图57为本发明实施例中所述的0.1％荧光增白剂353染色后的尿液标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)；
图58为本发明实施例中所述的0.1％荧光增白剂353染色后的痰标本中的念珠菌在荧光显微镜下的示意图(X40)。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通方法人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂，所述荧光染色试剂的结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0001292593340000091
其中，X为-SO3 -(磺酸根离子)、卤原子或H，Y为-NHCN2CH2OH、-N(OCH2CH3)2、-N(CH2CH2OH)2、-NHC2H5OH、H或吗啉
Figure BDA0001292593340000101
R为-NHCN2CH2OH、-N(OCH2CH3)2、-N(CH2CH2OH)2、-N(OH)CH2CH3、-NHC2H5OH、H或吗啉
Figure BDA0001292593340000102
Z为-SO3 -(磺酸根离子)或H，A为-SO3 -或H，E为-SO3 -或H。
上述通式化合物均能够与真菌发生结合，其可应用于真菌检测中，更重要的是，本申请人通过研究从上述通式中筛选出了几种效果更佳显著、且获取容易的的荧光染色试剂，具体参见以下实施例。
实施例1
一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂，所述荧光染色试剂的结构为：式Ⅰ中的X为-H，Y为-NHCN2CH2OH，R为-NHCN2CH2OH，Z为H，具体结构如下，其为荧光增白剂85，CAS号为12224-06-5。
Figure BDA0001292593340000103
现有技术中，该荧光增白剂85应用于纺织业或造纸业中，本发明将其应用于真菌检测领域，能够特异性结合皮肤癣菌、念珠菌属、孢子丝菌病、镰刀菌、曲霉属以及瓶霉属等多种真菌。
本实施例中的荧光增白剂85能够制成真菌检测的试剂盒，可有效提高检测效率，缩短检测时间，降低检测难度。
实施例2
一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂，所述荧光染色试剂的结构为：式Ⅰ中的X为-H，Y为-N(OCH2CH3)2，R为-N(OCH2CH3)2，Z为H，具体结构如下，其为荧光增白剂113，CAS号为12768-92-2。
Figure BDA0001292593340000111
现有技术中，该荧光增白剂113应用于纺织业或造纸业中，本发明将其应用于真菌检测领域，能够特异性结合皮肤癣菌、念珠菌属、孢子丝菌病、镰刀菌、曲霉属以及瓶霉属等多种真菌。
本实施例中的荧光增白剂113能够制成真菌检测的试剂盒，可有效提高检测效率，缩短检测时间，降低检测难度。
实施例3
一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂，所述荧光染色试剂的结构为：式Ⅰ中的X为-SO3 -(磺酸根离子)，Y为-N(CN2CH2OH)2，R为-N(CN2CH2OH)2，Z为-SO3 -(磺酸根离子)，具体结构如下，其为荧光增白剂87，CAS号为12768-91-1。
Figure BDA0001292593340000121
现有技术中，该荧光增白剂87应用于纺织业或造纸业中，本发明将其应用于真菌检测领域，能够特异性结合皮肤癣菌、念珠菌属、孢子丝菌病、镰刀菌、曲霉属以及瓶霉属等多种真菌。
本实施例中的荧光增白剂87能够制成真菌检测的试剂盒，可有效提高检测效率，缩短检测时间，降低检测难度。
实施例4
一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂，所述荧光染色试剂的结构为：式Ⅰ中的X为Cl，Y为-NHC2H5OH，R为-NHC2H5OH，Z为H，A为H，E为H，具体结构如下，其为荧光增白剂31。
Figure BDA0001292593340000131
现有技术中，该荧光增白剂31应用于纺织业中用于棉、涤棉混纺织物的增白、纸张以及洗涤剂等的增白，本发明将其应用于真菌检测领域，能够特异性结合皮肤癣菌、念珠菌属、孢子丝菌病、镰刀菌、曲霉属以及瓶霉属等多种真菌。
本实施例中的荧光增白剂31能够制成真菌检测的试剂盒，可有效提高检测效率，缩短检测时间，降低检测难度。
实施例5
一种用于真菌检测的新型荧光染色试剂，所述荧光染色试剂的结构为：式Ⅰ中的X为-SO3 -，Y为
Figure BDA0001292593340000132
(吗啉)，R为
Figure BDA0001292593340000133
(吗啉)，Z为-SO3 -，A为-SO3 -，E为-SO3 -，具体结构如下，其为荧光增白剂353(即MST-H)，CAS号为55585-28-9。
Figure BDA0001292593340000134
现有技术中，该荧光增白剂MST-H应用于纺织业或造纸业中，本发明将其应用于真菌检测领域，能够特异性结合皮肤癣菌、念珠菌属、孢子丝菌病、镰刀菌、曲霉属以及瓶霉属等多种真菌。
本实施例中的荧光增白剂MST-H能够制成真菌检测的试剂盒，可有效提高检测效率，缩短检测时间，降低检测难度。
实施例6
采用荧光增白剂85进行真菌检测的方法(染纯菌)：S1：将0.1g荧光增白剂85溶解到100ml灭菌蒸馏水中配制成0.1％的浓度；
S2：分别将红色毛癣菌、须癣毛癣菌、念珠菌、孢子丝菌、黄曲霉和疣状瓶霉培养后，挑出少许，放置在载玻片上，滴一滴步骤S1中所配制的0.1％荧光增白剂85，盖上盖玻片，放到荧光显微镜下观察。
如图1～6所示，镜下结果显示，荧光增白剂85可以很好的结合在菌丝、分子孢子等结构上，对黄曲霉分生孢子头和疣状瓶霉瓶梗处的分生孢子染色不佳，考虑可能与这些孢子头或分生孢子为立体结构有关，内部孢子不太容易着色。
实施例7
一种真菌检测试剂盒，所述试剂盒包括荧光增白剂85和缓冲液。所述缓冲液为KOH。
采用该试剂盒进行真菌检测的方法为：
S1：将1g荧光增白剂85溶解到100ml灭菌蒸馏水中配制成1％的浓度；
S2：将10g KOH溶解于100ml灭菌蒸馏水中配制成10％的KOH；
S3：然后取步骤S1中所配制的1ml 1％的荧光增白剂，再加入9ml步骤S2中所配制的KOH溶液配制成荧光增白剂85的KOH溶液，最终所配制的碱性荧光增白剂溶液中的KOH浓度为9％。
S4：分别取医学临床上的皮肤碎屑标本、口腔分泌物标本、阴道分泌物的标本、痰标本、肺泡灌洗液标本和尿液脑脊液等体液标本，放置在载玻片上，滴一滴步骤S3中所配制的荧光增白剂85的KOH溶液，盖上盖玻片，酒精灯溶解数秒，放到荧光显微镜下观察。
荧光增白剂85不与碱性溶液发生新的化学反应，且可以特异性结合上述标本中的真菌，形成蓝色或蓝绿色荧光，而对背景中的细胞(比如，角质形成细胞、上皮细胞等)结合非常微弱，在荧光显微镜下观察，可以非常清晰准确的识别真菌，并且不易淬灭，着色非常清晰，尤其是对皮肤癣菌、念珠菌、糠秕孢子菌、曲霉等，即使不使用背景染料，依然能够极其清晰的区分菌体和背景细胞，参见附图7～12。也因此，荧光增白剂85可以制成本发明所述的试剂盒，用于对不同部位的体液或皮屑标本进行真菌检测，提高临床的检测效率和准确性。
本实施例步骤S1中的荧光增白剂85浓度可以为0.01～1％中的任何值。
实施例8
采用荧光增白剂87进行真菌检测的方法(染纯菌)：S1：将0.1g荧光增白剂87溶解到100ml灭菌蒸馏水中配制成0.1％的浓度；
S2：分别将红色毛癣菌、须癣毛癣菌、念珠菌、孢子丝菌、黄曲霉和疣状瓶霉培养后，挑出少许，放置在载玻片上，滴一滴步骤S1中所配制的0.1％荧光增白剂87，盖上盖玻片，放到荧光显微镜下观察。
如图13～18所示，镜下结果显示，荧光增白剂87可以很好的结合在菌丝、分子孢子等结构上，对黄曲霉分生孢子头和疣状瓶霉瓶梗处的分生孢子染色不佳，考虑可能与这些孢子头或分生孢子为立体结构有关，内部孢子不太容易着色。
实施例9
一种真菌检测试剂盒，所述试剂盒包括荧光增白剂87和缓冲液。所述缓冲液为KOH。
采用该试剂盒进行真菌检测的方法与实施例7中的方法一致，这里不再重复限定。
荧光增白剂87不与碱性溶液发生新的化学反应，且可以特异性结合上述标本中的真菌，形成蓝色或蓝绿色荧光，而对背景中的细胞(比如，角质形成细胞、上皮细胞等)结合非常微弱，在荧光显微镜下观察，可以非常清晰准确的识别真菌，并且不易淬灭，着色非常清晰，尤其是对皮肤癣菌、念珠菌、糠秕孢子菌、曲霉等，即使不使用背景染料，依然能够极其清晰的区分菌体和背景细胞，参见附图19～24。也因此，荧光增白剂87可以制成本发明所述的试剂盒，用于对不同部位的体液或皮屑标本进行真菌检测，提高临床的检测效率和准确性。
本实施例中的荧光增白剂87浓度也可以配制为0.1～1％中的任何值。
实施例10
采用荧光增白剂113进行真菌检测的方法(染纯菌)：S1：将0.1g荧光增白剂113溶解到100ml灭菌蒸馏水中配制成0.1％的浓度；
S2：分别将红色毛癣菌、须癣毛癣菌、念珠菌、孢子丝菌、黄曲霉和疣状瓶霉培养后，挑出少许，放置在载玻片上，滴一滴步骤S1中所配制的0.1％荧光增白剂113，盖上盖玻片，放到荧光显微镜下观察。
如图25～30所示，镜下结果显示，荧光增白剂113可以很好的结合在菌丝、分子孢子等结构上，对黄曲霉分生孢子头和疣状瓶霉瓶梗处的分生孢子染色不佳，考虑可能与这些孢子头或分生孢子为立体结构有关，内部孢子不太容易着色。
实施例11
一种真菌检测试剂盒，所述试剂盒包括荧光增白剂113和缓冲液。所述缓冲液为KOH。
采用该试剂盒进行真菌检测的方法与实施例7中的方法一致，这里不再重复限定。
荧光增白剂113不与碱性溶液发生新的化学反应，且可以特异性结合上述标本中的真菌，形成蓝色或蓝绿色荧光，而对背景中的细胞(比如，角质形成细胞、上皮细胞等)结合非常微弱，在荧光显微镜下观察，可以非常清晰准确的识别真菌，并且不易淬灭，着色非常清晰，尤其是对皮肤癣菌、念珠菌、糠秕孢子菌、曲霉等，即使不使用背景染料，依然能够极其清晰的区分菌体和背景细胞，如图31～36所示。也因此，荧光增白剂113可以制成本发明所述的试剂盒，用于对不同部位的体液或皮屑标本进行真菌检测，提高临床的检测效率和准确性。
本实施例中的荧光增白剂113浓度也可以配制为0.01～1％中的任何值。
实施例12
采用荧光增白剂31进行真菌检测的方法(染纯菌)：S1：将0.1g荧光增白剂31溶解到100ml灭菌蒸馏水中配制成0.1％的浓度；
S2：分别将红色毛癣菌、须癣毛癣菌、念珠菌、孢子丝菌、黄曲霉和疣状瓶霉培养后，挑出少许，放置在载玻片上，滴一滴步骤S1中所配制的0.1％荧光增白剂31，盖上盖玻片，放到荧光显微镜下观察。
如图37～42所示，镜下结果显示，荧光增白剂31可以很好的结合在菌丝、分子孢子等结构上，对黄曲霉分生孢子头和疣状瓶霉瓶梗处的分生孢子染色不佳，考虑可能与这些孢子头或分生孢子为立体结构有关，内部孢子不太容易着色。
实施例13
一种真菌检测试剂盒，所述试剂盒包括荧光增白剂31和缓冲液。所述缓冲液为KOH。
采用该试剂盒进行真菌检测的方法与实施例7中的方法一致，这里不再重复限定。
荧光增白剂31不与碱性溶液发生新的化学反应，且可以特异性结合上述标本中的真菌，形成蓝色或蓝绿色荧光，而对背景中的细胞(比如，角质形成细胞、上皮细胞等)结合非常微弱，在荧光显微镜下观察，可以非常清晰准确的识别真菌，并且不易淬灭，着色非常清晰，尤其是对皮肤癣菌、念珠菌、糠秕孢子菌、曲霉等，即使不使用背景染料，依然能够极其清晰的区分菌体和背景细胞，如图43～47所示。也因此，荧光增白剂31可以制成本发明所述的试剂盒，用于对不同部位的体液或皮屑标本进行真菌检测，提高临床的检测效率和准确性。
本实施例中的荧光增白剂31浓度也可以配制为0.01～1％中的任何值。
实施例14
采用荧光增白剂353进行真菌检测的方法(染纯菌)：S1：将0.1g荧光增白剂353溶解到100ml灭菌蒸馏水中配制成0.1％的浓度；
S2：分别将红色毛癣菌、须癣毛癣菌、念珠菌、孢子丝菌和黄曲霉培养后，挑出少许，放置在载玻片上，滴一滴步骤S1中所配制的0.1％荧光增白剂353，盖上盖玻片，放到荧光显微镜下观察。
如图48～52所示，镜下结果显示，荧光增白剂353可以很好的结合在菌丝、分子孢子等结构上，对黄曲霉分生孢子头的染色不佳，考虑可能与这些孢子头或分生孢子为立体结构有关，内部孢子不太容易着色。
实施例15
一种真菌检测试剂盒，所述试剂盒包括荧光增白剂353和缓冲液。所述缓冲液为KOH。
采用该试剂盒进行真菌检测的方法与实施例7中的方法一致，这里不再重复限定。
荧光增白剂353不与碱性溶液发生新的化学反应，且可以特异性结合上述标本中的真菌，形成蓝色或蓝绿色荧光，而对背景中的细胞(比如，角质形成细胞、上皮细胞等)结合非常微弱，在荧光显微镜下观察，可以非常清晰准确的识别真菌，并且不易淬灭，着色非常清晰，尤其是对念珠菌、皮肤癣菌、花斑癣等，即使不使用背景染料，依然能够极其清晰的区分菌体和背景细胞，如图53～58所示。也因此，荧光增白剂353可以制成本发明所述的试剂盒，用于对不同部位的体液或皮屑标本进行真菌检测，提高临床的检测效率和准确性。
本实施例中的荧光增白剂353浓度也可以配制为0.01～1％中的任何值。
本申请人还验证了临床标本检测时，荧光增白剂的上限和下限浓度，经验证，本发明实施例中的荧光染色试剂，如实施例6～9中的各个荧光增白剂的上限浓度均为1％，超出1％，则背景一片蓝色，无法区分真菌和背景的细胞。本发明实施例中荧光增白剂85和荧光增白剂113的下限浓度为0.01％，其他荧光染色试剂的下限浓度为0.1％。低于该下限浓度则真菌和背景细胞均染色很淡，有时不容易区分。
具体实施时，本发明中的试剂盒还可包括背景染料，即采用背景染料来增加与真菌的色差，使其能够更清晰的显示。然而，本申请中的荧光染色试剂均可不用背景染料便可实现非常清晰的显色，这是由于本发明的荧光染色试剂中的基团能够与真菌进行非常好的特异性结合，而与背景的结合极其微弱，因此，扩大了检测真菌的荧光试剂范围。
对于本发明中的几种荧光增白剂可以分别对某种或某几种真菌进行清晰染色的结果，本申请人推测可能是荧光增白剂由于其结构中的某种或某几种取代基的作用或取代基与母核中的结构相互作用使得其能够与真菌细胞上的某些糖类、几丁质等进行特异性结合，且不易淬灭，染色清晰，因此可以协助进行真菌的检测，也可以应用到藻类的检测中。
同时为了提高真菌的检出率，尤其是医学上浅部和深部的真菌感染，荧光染色试剂中还需要添加碱性溶液(比如氢氧化钾等)，但考虑到二者兼容的问题，有时需要适当的调整浓度，即保证荧光染料可以与真菌紧密结合，且不与角质细胞或上皮细胞等结合或二者可以明显区分，又要保证KOH的浓度可以溶解角质层，还要避免碱性溶液与荧光染料之间发生相互作用。从本发明中的荧光染色试剂中，本申请人筛选出了效果显著的目前已有成品的荧光增白剂85，87，31，353，113等，大大扩大了临床真菌检测荧光染色试剂的范围。
上述5种染料或试剂盒，也可以应用在组织病理切片中，为怀疑真菌感染的组织病理诊断提供一种快速、经济、对比更清晰的染色方法进行真菌感染的诊断。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种荧光染色试剂在制备真菌检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述荧光染色试剂的结构如式Ⅰ所示：
Figure FDA0003231658460000011
其中：式Ⅰ中所述X为-H，Y为-NHCH2CH2OH，R为-NHCH2CH2OH，Z为H，A为H，E为H。
2.一种真菌检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由荧光染色试剂和碱液组成；
其中，所述荧光染色试剂的结构如式Ⅰ所示：
Figure FDA0003231658460000012
其中：式Ⅰ中所述X为-H，Y为-NHCH2CH2OH，R为-NHCH2CH2OH，Z为H，A为H，E为H；其中，所述荧光染色试剂的浓度为0.1～1％g/mL，所述碱液为10％g/mL的KOH；
所述真菌检测试剂盒所能检测的临床标本包括皮肤碎屑、口腔分泌物、阴道分泌物、痰、肺泡灌洗液、尿液以及脑脊液中的真菌。
3.根据权利要求2所述的真菌检测试剂盒，其特征在于：所述真菌检测试剂盒所能检测的真菌种类选自皮肤癣菌、念珠菌属、孢子丝菌、镰刀菌、曲霉属以及瓶霉属。
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