CN87101986A - 真菌检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测动物或人体组织和体液中真菌和藻菌的方法，含适用于本方法的荧光增白剂的制剂，和实施该方法的试验箱。被检测的组织切片或体液样品用荧光增白剂处理，并用荧光显微镜观察。本发明可以对真菌感染作出快速可靠的诊断。

Description

本发明涉及动物和人体组织及体液中真菌和藻菌的检测方法，含适用于该法的萤光增白剂的制剂，和实施该方法的试验箱。
准确诊断动物和人体感染的原因，在选择合适的治疗方法时至关重要。对于可靠的诊断来说，最好的方法是从临床标本中分离出感染的病原细菌，并进行形态学鉴定。不过，由于分离复杂，加上鉴定又常常不确切，这样一种理想情形很少能实现。即使是真菌感染的试验性诊断，也需要对组织标本或体液进行全面检查，例如使用一系列选择性地识别某些真菌抗原的不同抗体的血清学试验。
现在，对快速和可靠的诊断已有了广泛和迫切的要求，以便能够取代复杂而又费时的血清学试验，或者至少使它们局限在下述情况，即必须提供引起感染的真菌的属的准确信息。例如手述过程中对一些组织物的检查，用于分析真菌引起的排出物的妇科化验标本的检查，在可疑性皮真菌病例中皮科化验标本的检查，儿科化验标本物料和来自新生儿及粘膜上患有一般感染和可疑性霉菌病的虚弱儿童的其它待检物质的检查，例如儿童中白血病性贫血和其它肿瘤疾患中念珠菌引起的口腔和咽粘膜及食管和气管粘膜鹅口疮的检查。快速诊断对内科、肿瘤科，外科临床中检查来自可疑性高几率的真菌感染病人的组织物质也是重要的，例如，在识别爱兹病人的病例中，特别是识别食管炎和支气管炎型的念珠菌病;在用细胞抑制剂治疗肿瘤疾患的病例和使用抗菌素和/或免疫抑制剂治疗的病例的检查中;以及在可疑性霉菌病例特别是念珠菌病;在粘膜鹅口疮;在老年医学中，当检查抵抗力低下引起的皮肤和/或粘膜扩散性霉菌病的病人时，和藻菌引起可疑性的皮肤及器官感染的病例，例如Protothecosis，也是重要的。
在家蓄和爱蓄的治疗中，真菌病的诊断也是重要的，例如在研究牛乳腺炎和狗、观赏鸟类、稀有珍贵动物的真菌病时。在实验动物中，例如用人工诱发的真菌感染的小鼠和大鼠以试验潜在的抗真菌治疗剂时，简单而又可靠的鉴定真菌的方法也是重要的。
本发明现在提供了这样一个对真菌感染的快速而又可靠的诊断。本发明涉及到检测真菌和藻类的方法，该法的特征在于，动物或人体组织或体液用至少含有四个磺基的二苯乙烯萤光增白剂或其盐处理，并用萤光显微镜检查。
萤光增白剂是无色或轻度有色的有机化合物，吸收紫外光，例如吸收波长为340nm至400nm的紫外光，并以可见光例如波长为400nm至440nm的可见光的形式再次释放吸收的能量。好的萤光增白剂可用高的量子产额来鉴识。萤光增白剂属于，例如二苯乙烯类、香豆素类和喹诺酮类化合物、1，3-二苯基-2-吡唑啉类、萘二甲酰亚胺类，或苯并恶唑基化合物，或其它芳香杂环取代的芳香化合物或乙烯化合物，而且总是具有共轭的电子体系。
本发明中的萤光增白剂属于取代的二苯乙烯类，并含有至少四个，例如四至六个磺基。这些磺基为萤光增白剂带来了好的水溶度。至少含有四个磺基的该萤光增白剂及其盐的制备方法是已知的，并在例如综述和专著中比如“Fluorescent    Whitening    Agents”（editors    R.Anliker    and    G.Muller，Georg    Thieme    Verlag，Stuttgart    1975）中已有描述。
含至少四个磺基的二苯乙烯萤光增白剂的例子是通式（Ⅰ）和（Ⅱ）的化合物：
Figure 87101986_IMG5
在（Ⅰ）中R1代表至少含有一个磺基的芳香的或芳香杂环取代基，例如取代的苯基、吡啶基或三唑基，例如磺基取代的4-苯基-1，2，3-三唑-2-基;或代表被至少含有一个磺基的芳基或芳香杂环基取代的氨基，例如取代的三嗪基氨基，比如至少含一个磺基的2，4-二取代的1，3，5-三嗪基-6-氨基;而且两个R1基可以相同或不同;
在通式（Ⅱ）中，A代表磺基取代的1，4-亚苯基或4，4′-联亚苯基;R2代表磺基、羟基、低级烷氧基，例如甲氧基，羟基-低级烷氧基，例如2-羟基乙氧基、囟素，例如氯、氰基、羧基、低级的烷氧羰基，例如甲氧羰基或乙氧基羰基，或者氨基甲酰基，或具有R1的含义，而且R2可以相同或不同，另外也可以出现多次。
低级烷基或低级烷氧基中的低级烷基具有1至7个碳原子，最好具有1至4个碳原子，例如为甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基。苯基、吡啶基、三唑基或三嗪基上的取代基最好是，例如后面提到的R的基团。
盐最好是水溶性盐，例如碱金属盐。象钠盐或钾盐，但也包括铵盐。
本发明的方法中较好的萤光增白剂的通式是：
Figure 87101986_IMG7
在（Ⅲ）中，R3代表羟基、低级烷氧基、例如甲氧基，羟基-低级烷氧基，例如2-羟基乙氧基，低级烷氧基-低级烷氧基，例如2-甲氧基乙氧基，低级烷基氨基，例如甲氨基，低级的二烷基氨基，例如二甲氨基，羟基-低级烷基氨基，例如2-羟基乙氨基或2-羟基丙氨基，低级的烷基羟基-低级烷基-氨基，例如甲基-2-羟基乙基-氨基，二（羟基-低级烷基）氨基，例如二（2-羟基乙基）氨基或二（2-羟基丙基）氨基，低级烷氧基-低级烷基氨基，例如2-甲氧基乙基氨基，低级烷基-低级烷氧基-低级烷基-氨基，例如甲基-2-甲氧基乙基-氨基，二（低级烷氧基-低级烷基）氨基，例如二（2-甲氧基乙基）氨基，吗啉代或苯环上磺基任意取代的苯基氨基，2-，3-，或4-磺基苯基氨基或2，5-二磺基苯基氨基;R4代表磺基，例如2-，3-，或4-磺基;R5代表氢、磺基例如4-或5-磺基或并环的苯环，例如2，3-，3，4-或5，6-苯并，而且两个R3基、两个R4基和两个R5基各自可以相同或不同。以及由它们衍生的水溶性盐，例如碱金属盐，象钠盐和钾盐。
在本发明的方法中最好的通式（Ⅲ）的二苯乙烯萤光增白剂是：（Ⅲ）中的R3代表羟基-低级烷基氨基，例如2-羟基乙基氨基，二（羟基-低级烷基）氨基，例如二（2-羟基乙基）-氨基，或磺基取代的苯氨基，例如3-磺基苯氨基;R4代表磺基，例如2-，3-，或4-磺基，R5代表氢、磺基，例如5-磺基，或者并环的苯环，例如2，3-苯并，以及它的水易溶的盐，例如钠盐。
本发明特别涉及使用通式Ⅲ的化合物的方法，其中，R3代表二-（2-羟基乙基）氨基或3-磺基苯基氨基，R4代表3-磺基，R5代表氢，和它的水溶性盐，最好是钠盐。
特别好的二苯乙烯萤光增白剂称之为diaethanol，其系统命名为4，4′-双[2-二（2-羟基乙基）氨基-4-（3-磺基苯基氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸的钠盐。该化合物能按照例如美国专利3，406，118中叙述的方法制备。
能通过本法染色以便检测真菌和藻类的动物或人体组织，可以来源于机体的任何器官和部分，例如，以冷冻干燥组织标本或埋入石腊中的脱水组织的组织切片形式或以印片标本或拭子标本的形式进行检查。通过本法可以检测存在真菌和藻菌的体液是血液、痰，支气管分泌物、淋巴液、脑脊髓液，和其它穿刺液、汗、泪液、眼内液，尿或粪便。
此方法检测人体组织或体液中真菌和藻类是特别好的。
组织切片，或用一些其它方法制备的标本，例如拭子，印片标本或从体液中分离的固体组分用含0.05%至5%，最好是0.1%至2%的萤光增白剂的水溶液处理，例如在水中、在盐溶液中，例如缓冲生理盐水中，或在组织固定液中，例如在10%甲醛水溶液或醇性水溶液中，在室温或稍高的温度下，例如高达50℃下处理数分钟，例如2至30分钟。如果适宜，过量的萤光增白剂可用水洗除或用盐溶液，例如缓冲生理盐水洗除。如果需要，被检查的标本然后可用一种适于组织切片或细胞成分染色的常用染料复染，例如用亚甲兰、甲苯胺兰、品红、甲基紫或类似物，但最好是用伊凡斯兰复染，以便加强对比度。
如此处理过的标本在显微镜下用反射可见兰色光或紫外光（反射照明光），最好在340nm至450nm的范围内，观察。如果观察到真菌或藻菌的特征结构的绿色的萤光，立即表明这类病原细菌的存在。在绝大多的数情形下，是可以从染色的真菌组成的形态学推测该真菌的属和种。如果需要，在显微镜下见到的图象还可用常用的可购得的光敏胶片进行拍照。
本发明描述的方法，以简单省时的操作和高度的可靠性为特征，并明显地比其它的诊断真菌感染的方法优越。与常规的染色方法相比，例如习惯使用的果莫里六五甲基四胺-银染色法或周期性的酸-西夫硷染色法比较，本发明中的方法具有选择性地使真菌染色的优点，萤光染色物在未染色的背景下能很好地突出出来，而且不足2小时即能给出可靠的结果，而常规染色方法需要24小时或更长的时间。本发明的方法明显优于用Blankophor
Figure 87101986_IMG8
BA或cakofluor white
Figure 87101986_IMG9
M2 R new的染色法，后两者均为仅含2个磺基的三嗪基氨基二苯乙烯萤光增白剂，并已推荐用于动物及人体组织染色，因为按照本发明，所有真菌和藻菌均可被选择性地染色，而刚提到的萤光增白剂对一些真菌并不染色，或染色差，而且染色的真菌在组织中不易识别。
为了实施该方法，所有需要的全是容易得到的试剂和简单的萤光显微镜，后者在微生物或医学实验室中通常是可以得到的。
使用较好的水溶性萤光增白剂，diaethanol，在所有霉菌病例，例如皮肤的Lobo's霉菌病，肺酵母病，脾毛孢子菌病，肾念珠菌病、肺组织胞浆菌病，肝腹放线菌病，肾曲霉病以及adiaspiromycosis、球孢菌病，隐球酶母病，鼻孢子虫病是线菌菌病，
及许多其它病例中都观察到了正性萤光。同样也可使分离的或培养的真菌染色，例如属于Eumycota属的一些代表菌，例如接合菌、内孢霉、子襄菌、或半知菌类（不完全真菌），特别是芽酵母属（dermatidis），白假丝酵母、烟曲霉、申克侧孢、须发癣菌、Trichophyton    guinckeanum、狗小孢霉、光滑球拟酵母，和其它菌，以及藻菌类例如Prototheca，可是，奇怪的是，在细菌和寄生虫的情形中未观察到染色;特别是下面的细菌是不染色的：葡萄球菌、例如金黄色葡萄球菌K1326，链球菌，例如粪链，例如大肠杆菌K1322，伪单孢菌，例如伪单孢菌K1407，和分枝细菌，例如Mycobact    smegmatis。值得注的是，一些不属于真菌的重要的致病菌，例如肺孢子虫，肠兰伯氏鞭毛虫，杜氏利什曼虫，leish.chagasi和婴儿利什曼虫也不被染色
本发明亦包括适用于进行该方法的萤光增白剂的制剂。这类制剂是，例如前面谈到的至少含四个磺基的二苯乙烯萤光增白剂的水溶液，以及固体混合物，例如粉状或颗粒状混合物。
按照本发明，水溶液含例如0.05%至5%，最好是0.1%至2%，例如1%二苯乙烯萤光增白剂;如果需要，还可以含其它的化合物，例如盐类，象氯化钠、氯化钾、硫酸钠，磷酸二氢钠或钾、磷酸氢二钠或二钾;或其它的缓冲物质，例如N-2-羟基乙基哌嗪-N-2-乙磺酸、3-吗啉代丙磺酸、N-三（羟甲基）甲基甘氨酸、或三（羟甲基）氨基甲烷;以及它们的碱金属盐，例如钠盐类，和/或酸加成盐类，例如各自的盐酸化物，变性的和/或溶解的有机溶剂，例如甲醇或乙醇;和固定化合物，例如甲醛;而且如果需要，也可含稀释剂，例如脲;湿润剂，例如脂肪或芳香磺酸盐;或钙离子的络合剂，例如乙二胺四乙酸钠，水溶液中二苯乙烯萤光增白剂的浓度亦可高于5%，例如高至20%。这类溶液在按本发明的方法使用前必须稀释。
按照本发明的固体混合物是二苯乙烯萤光增白剂和前面提到的盐;例如氯化钠、氯化钾和/或缓冲盐，比如磷酸二氢钠及磷酸氢二钠，或与有机固体缓冲化合物，例如与三（羟甲基）氨基甲烷及相应的盐酸化物形成的混合物。这些混合物在用于本发明的方法前，必须能溶于水中。
较好的制剂是前面提到的较好的二苯乙烯萤光增白剂的水溶液，例如4，4′-双[2-二（2-羟基乙基）氨基-4-（3-磺基苯氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯基乙烯-2，2′-二磺酸，称为diaethanol的水溶液。特别好的是含有0.1%至2%，例如1%的较好的萤光增白剂的这种蒸馏水溶液或磷酸盐缓冲水溶液。
本发明中的制剂是根据溶解、混合、研磨、制粒和/或冷冻干燥等方法制得的。
本发明也涉及实施本发明方法的试验箱。该试验箱包含，例如具有至少四个磺基的二苯乙烯萤光增白剂，或前面讲到的本发明的一种剂型，用于复染的染料或染色液。缓冲化合物或缓冲溶液，以及辅助装置，例如吸量管、显微镜用的载玻片及盖玻片，实施本发明的方法的说明书，用于比较的标本等等。
本发明的试验箱也可包括血清测试液，例如多克隆或单克隆抗体溶液以进一步确正，在使用二苯乙烯萤光增白剂染色法首先初步鉴别真菌的属。这类直接对抗各种真菌属的标记抗原并专一地结合到相应的真菌上去的多克隆或单克隆抗体是已知的，或能按照已知的方法制备。最好是使用萤光标记抗体，例如用若丹明-或萤光-异硫氰酸盐标记的抗体，以便使得抗原/抗体反应在萤光显微镜下容易看见。试验箱也可包含能专一地与某些细菌或某些原虫起反应的抗体溶液。最好使用这些萤光标记抗体，其萤光颜色能与本发明的二苯乙烯萤光增白剂的萤光颜色相区别，例如使用若丹明-异硫氰酸盐标记的抗体，以便能在一次操作中分别筛出真菌、细菌或原虫。
下面的实施例仅解释本发明，但决不限制本发明的范围。
实施例1：组织切片中真菌的染色
组织片，例如活检物，按常法埋入小块的石蜡中，使石蜡硬化，用切片机切割该小块成3至4μm厚的薄片。将石蜡切片置于载玻片上，在水浴中拉伸并干燥，用二甲苯洗3次，然后用乙醇、乙醇/水混合物、水、最后用磷酸盐酸缓冲盐水（PBS）洗，以洗掉石蜡。亦有可能不用石蜡切片，而用大约10μm厚的深度冷冻的组织物的组织切片，并用PBS调制它们。
该组织切片用1%的diaethanol的PBS溶液，于pH7.0饱和。10至30分钟后，切片用PBS冲洗，然后用0.2%伊凡斯兰的PBS溶液处理，半分钟后再用PBS冲洗。将水中的切片置于载玻片上，盖上，并用嵌漆封住。该组织切片在Olympus    BHTU显微镜下于表面萤光下观察。真菌的细胞壁和胞浆染上绿色或黄绿色萤光，而背景呈棕色，从而产生良好的对比度。用Leica-小型照像机，采用柯达彩色胶卷ASA400进行显微照像。
实施例2：肉汤培养物或体液标本的染色
将被检物铺于载玻片上，空气干燥，用火加热固定并用甲醇复盖1分钟。该载玻片用一层0.1%的diaethanol水溶液复盖。5分钟后，倾掉染色液，载玻片用水冲洗，空气干燥。该标本用盖玻片盖上，并在放大40倍的Dialux-20显微镜下用反射紫外光（反射照明光）观察，该紫外光通过H2滤光片（波长390至490nm）。当用萤光增白剂染色的样品在干燥前用0.2%伊凡斯兰的水溶液处理半分钟，并用水洗后，可改善对比度。
实施例3：作为真菌染色剂的萤光增白剂的检查
白色念珠菌    K1133，Aspergillus    fumigatus    K76及狗小芽孢菌K240在Mycophil琼脂中培养，混悬到生理盐水中作一系列测试，并且与等量的摘除的小鼠肾的悬浮液混合。每次滴1滴该混合物于载玻片上，空气干燥，在火焰上方返回三次，以便固定，用甲醇复盖1分钟，并用蒸馏水洗。该固定的真菌样品用1%待测的萤光增白剂水溶液复盖5分钟，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗，用0.2%的伊凡斯兰的PBS溶液复盖半分钟，用PBS洗，用盖玻片盖上。该样品用放大40倍的Dialux-20显微镜在反射紫外光（反射照明，390至490nm）下观察。
相对于背景器官细胞染色的真菌萤光强度，可按任一标度比较。每种真菌都进行了2-3个实验，并计算平均值。得到下述结果：
极好的染色效果：
使用4，4′-双[2-二（2-羟基乙基）氨基-4-（3-磺基苯氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐（diaethanol），和
4，4′-双[2，4-二（3-磺基苯氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐。
好的染色效果：
使用4，4′-双[2-二（2-羟基乙基）氨基-4-（4-磺基-1-萘氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐。
4，4′-双[2-二（2-羟基乙基）氨基-4-（2，5-二磺基苯氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐，
4，4′-双[2-（2-羟基乙基）氨基-4-（3-磺基苯氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐，
和4，4′-双[2-二（2-羟基乙基）氨基-4-（4-磺基苯氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐。
中等染色效果：
使用4-[2-二（2-羟基乙基）氨基-4-甲氧基-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-4′-[2-二（2-羟基乙基）氨基-4-（2-磺基乙氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐，
4，4′-双[2-吗啉代-4（2，5-二磺基苯氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐
4，4′-双[2-二（2-羟基丙基）氨基-4-（3-磺基苯氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐，
和4，4′-双[2-二（2-羟基丙基）氨基-4-（4-磺基苯氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐。
仅含两个磺基，或用羧基或铵基取代磺基的二苯乙烯萤光增白剂及不含2，4-二取代的1，3，5-三嗪基-6-氨基的二苯乙烯萤光增白剂，染色差或根本不染色。
实施例4：在磷酸盐缓冲盐水中的diaethanol溶液
10g    4，4′-双[2-二（2-羟基乙基）氨基-4-（3-磺基苯氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-二磺酸钠盐（diaethanol，不含氯化钠），0.2g氯化钾，8.0g氯化钠，1，44g含两分子结晶水的磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，溶于1升蒸馏水中。
相同的溶液亦可用含13%氯化钠和5%至10%水的diaethanol粗品制备，但diaethanol的用量要作相应的调整。
实施例5：试验箱
用于真菌染色的大剂量的试验箱包含：
含250毫升1%diaethanol磷酸盐缓冲盐水溶液的螺旋帽玻璃瓶。
含250毫升0.2%伊凡斯兰磷酸盐缓冲盐水溶液的螺旋帽玻璃瓶。
进行染色方法的说明书。
实施例6：试验箱
用于真菌染色的小剂量试验箱包含：
20个铝泊包衣的聚乙烯撕裂式包装袋，每袋含1ml1%    diaethanol的磷酸盐缓冲溶液。
20个铝泊包衣的聚乙烯撕裂式包装袋，每袋含1ml0.2%伊凡斯兰的磷酸盐缓冲溶液。
实施染色方法的说明书。

Claims (21)

1、检测真菌和藻菌的方法，其特征为动物或人体组织或体液用至少含四个磺基的二苯乙烯萤光增白剂或其盐处理，并用萤光显微镜检查。
2、按权利要求1的方法，其特征是以含四至六个磺基的二苯乙烯萤光增白剂或其盐进行染色处理。
3、按权利要求1的方法，其特征是以通式（Ⅰ）的萤光增白剂进行染色处理。在（Ⅰ）中，R′代表至少含有一个磺基的芳香或芳香杂环取代
Figure 87101986_IMG1
基或代表被至少含一个磺基的芳香或芳香杂环取代的氨基，且两个R′基可以相同或不同;或以通式（Ⅱ）的萤光增白剂进行染色处理，在（Ⅱ）中，
Figure 87101986_IMG2
A代表磺基取代的1，4-亚苯基或4，4-联亚苯基，R2代表磺基、羟基、低级的烷氧基，羟基-低级烷氧基，囟素、氰基、羧基、低级的烷氧羰基，或氨基甲酰基或具有R1的含义，R2基可以相同或不同，另外，可出现多次，或以它们的盐进行染色。
4、按照权利要求1的方法，其特征在于用通式（Ⅲ）的萤光增白剂进行染色。在通式（Ⅲ）中，
Figure 87101986_IMG3
R3代表羟基、低级烷氧基，羟基-低级烷氧基，低级烷氧基-低级烷氧基，低级烷氧基氨基，二-低级烷氧基氨基，羟基-低级烷氧基-氨基，低级烷基-羟基-低级烷基-氨基，二（羟基-低级烷基）氨基，低级烷氧基-低级烷基氨基，低级烷基-低级烷氧基-低级烷基-氨基，二（低级烷氧基-低级烷基）氨基，吗啉代或苯环上磺基任意取代的苯基氨基，R4代表磺基，R5代表氢，磺基或并环的苯环，而且两个R3基，两个R4基及两个R5基各自可以相同或不同。或使用它们的水溶性盐进行染色。
5、按照权利要求1的方法，其特征在于，使用通式（Ⅲ）的化合物进行染色，在（Ⅲ）中，R3代表羟基-低级烷基氨基，二（羟基-低级烷基）氨基，或磺苯基氨基，R4代表磺基，R5代表氢，磺基或并环的苯环。或用它们的水溶性盐进行染色。
6、按照权利要求1的方法，其特征在于使用通式（Ⅲ）的化合物进行染色，在（Ⅲ）中，R3代表二（2-羟基乙基）氨基，或3-磺苯基氨基，R4代表3-磺基，R5代表氢。或用它们的水溶性盐进行染色。
7、按照权利要求1的方法，其特征在于用4，4′-双[2-二（羟基乙基）氨基-4-（3-磺苯基氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐进行染色处理。
8、按照权利要求1至7中之任一方法对人体组织或体液中的真菌和藻菌进行染色。
9、用以检测真菌和藻菌的方法中使用的制剂，它含有至少有四个磺基的二苯乙烯萤光增白剂或其盐和载体。
10、按照权利要求9的水溶液型的制剂。
11、按照权利要求9的水溶液型的制剂，它含有0.05%至5%之间的二苯乙烯萤光增白剂及其盐，有机缓冲剂，有机溶剂和/或固定剂。
12、按照权利要求9、10或11含通式（Ⅲ）的萤光增白剂的制剂，在通式（Ⅲ）中，R3代表羟基低级烷氧基，羟基-低级烷氧基，低级烷氧
Figure 87101986_IMG4
基-低级烷氧基，低级烷基氨基，二-低级烷基氨基，羟基-低级烷基-氨基，低级烷基-羟基-低级烷基-氨基，二（羟基-低级烷基）氨基，低级烷氧基-低级烷基氨基，低级烷基-低级烷氧基-低级烷基-氨基，二（低级烷氧基-低级烷基）氨基，吗啉代或苯环上磺基任意取代的苯基氨基，R4代表磺基，R5代表氢，磺基或并环的苯环，而且两个R3基，两个R4基和两个R5基各自可以相同或不同。或它们的水溶性盐。
13、按照权利要求9、10或11的制剂，它含通式（Ⅲ）的化合物，在通式（Ⅲ）中R3代表羟基-低级烷基氨基，二（羟基-低级烷基）氨基，或磺苯基氨基，R4代表磺基，R5代表氢、磺基或并环的苯环，或其水溶性盐。
14、按照权利要求9、10或11的制剂，它含通式（Ⅲ）的化合物，在通式（Ⅲ）中，R3代表二（2-羟基乙基）氨基或3-磺基苯基氨基，R4代表3-磺基，R5代表氢，或其水溶性盐。
15、按照权利要求9、10或11的制剂，它含4，4′-双[2-二（2-羟基乙基）氨基-4-（3-磺苯氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐。
16、按真菌和藻菌检测方法使用的制剂的制备方法，其特征在于至少含四个磺基的二苯乙烯萤光增白剂或其盐与载体混合。
17、按照检测动物和人体组织或体液中真菌和藻菌方法使用的试验箱，它含有至少四个磺基的二苯乙烯萤光增白剂或其盐。
18、按照权利要求17的试验箱，该箱含至少有四个磺基的二苯乙烯萤光增白剂，或其盐，以及染料和/或血清测试液和/或实施该方法的说明书。
19、按照权利要求17或18的试验箱，该箱含有以象权利要求9至15中任一要求的制剂形式的二苯基乙烯萤光增白剂。
20、按权利要求17，18或19的试验箱，该箱含4，4′-双[2-二（2-羟基乙基）氨基-4-（3-磺基苯基氨基）-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸钠盐。
21、在用以检测动物或人体组织或体液中真菌和藻菌的方法中，使用含至少四个磺基的二苯乙烯萤光增白剂或其盐的用法。
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