CN110988344B - 快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂及其制备方法，包括如下原料制成：盐溶液、特异性抗体、促溶剂、保湿剂、背景染料和荧光素。本发明的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂结合免疫学和荧光标记的原理，能够特异性的检测金黄色葡萄球菌，本发明制备的试剂操作简单，只需将试剂滴染在固定的样本上，染色时间短，一分钟以内即可进行观察，临床使用更加方便，快捷，大大提高了金黄色葡萄球菌的检测效率。

Description

快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂及其制备方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种较为典型的革兰氏阳性球菌，主要分布在空气、土壤以及水分中，在人体、动物的体表中也存在，是一种人兽共患病菌。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。
金黄色葡萄球菌形态为球形，直径0.8μm左右，无芽孢、鞭毛，显微镜下排列成葡萄串状。在培养基中菌落特征表现为圆形凸起、有光泽，菌落表面光滑，直径1-2mm，颜色为无色或者金黄色，无扩展生长特点，血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌对高温有一定的耐受能力，在80℃以上的高温环境下30min才可以将其彻底杀死。
对脓汁、血液、可疑食物、呕吐物及粪便等不同临床样本，金黄色葡萄球菌检测的方法主要采取直接涂片镜检和分离培养鉴定以及免疫学方法。直接涂片镜检：取标本涂片，革兰氏染色后镜检，根据细菌形态，排列和染色性可作出初步诊断。革兰染色容易出现假阳，再加上金黄色葡萄球菌直径比较小，需要在100倍镜下观察，不容易判断。分离培养鉴定：将标本接种于哥伦比亚血平板，37℃培养，挑选透明的溶血圈菌落进行涂片、染色、镜检。根据接种量多少，一般2～4天可见菌落生长。培养法虽然灵敏度高但检测时间长，不但贻误治疗，也大大增加了患者传染给别人的风险。免疫学方法：以酶连免疫吸附实验为主，也有用亲和素-生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但上述实验抗原抗体反应成本较高，反应需要一定的时间，也有一定的局限性。
鉴于以上原因，特提出本发明。
发明内容
为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂及其制备方法，本发明的荧光染色试剂结合免疫学和荧光标记的原理，能够特异性的检测金黄色葡萄球菌，使用方便，一步操作即可完成染色，染色时间短，大大提高了金黄色葡萄球菌的检测效率。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，包括如下原料制成：盐溶液、特异性抗体、促溶剂、保湿剂、背景染料和荧光素。
其中，盐溶液作为抗体的稀释液和配制背景染料的溶液，特异性抗体能与金黄色葡萄球菌表面蛋白SPA结合，也能与背景染料结合形成复合物，背景染料是与特异性抗体结合形成显色的复合物，荧光素起到染色细胞核的作用，促溶剂增加背景染料和荧光素的溶解度，保湿剂增强染液整体的保湿度和稳定性。本发明中的特异性抗体、背景染料和荧光素共同作用起到特异性染色的效果，三者缺一不可。
进一步的，所述的盐溶液为PBS缓冲液。
进一步的，所述的PBS缓冲液包括氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。
进一步的，氯化钠的质量浓度为0.7-0.9％，磷酸二氢钠的质量浓度为0.01-0.03％，磷酸氢二钠的质量浓度为0.08-0.12％。
进一步的，氯化钠的质量浓度为0.8％，磷酸二氢钠的质量浓度为0.02％，磷酸氢二钠的质量浓度为0.1％。
进一步的，所述的特异性抗体为抗荧光素单克隆抗体。
进一步的，所述的特异性抗体为抗FITC的IgG。
进一步的，所述的特异性抗体的质量浓度为0.01-0.1％。
进一步的，所述的促溶剂为水溶性有机溶剂。
进一步的，所述的促溶剂为二甲基亚砜。
进一步的，所述的促溶剂的质量浓度为5-15％。
进一步的，所述的保湿剂为甘油、丙二醇、丁二醇中的一种或多种。
进一步的，保湿剂为甘油。
进一步的，保湿剂的质量浓度为10-20％。
进一步的，所述的背景染料为水溶性荧光素。
进一步的，所述的背景染料为FITC。
进一步的，所述背景染料的质量浓度为0.01-0.1％。
进一步的，所述的荧光素为核酸结合类荧光素。
进一步的，荧光素为碘化丙啶。
进一步的，碘化丙啶的质量浓度为0.0005-0.0015％。
本发明中各物质的浓度均为质量浓度，表示每单位体积荧光染色剂中各物质的质量含量，单位为kg/L。
一种所述的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂的制备方法，用盐溶液分别将特异性抗体和背景染料稀释，两者等体积混合，得到混合物A，将荧光素溶解在水中与混合物A等体积混合，再加入促溶剂和保湿剂混合均匀，得到所述的荧光染色试剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂结合免疫学和荧光标记的原理，能够特异性的检测金黄色葡萄球菌，本发明的试剂操作简单，只需将试剂滴染在固定的样本上，染色时间短，一分钟以内即可进行观察，临床使用更加方便，快捷，大大提高了金黄色葡萄球菌的检测效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1制备的荧光染色剂对金黄色葡萄球菌的染色结果；
图2是本发明实施例1制备的荧光染色剂对表皮葡萄球菌的染色结果；
图3是本发明实施例1制备的荧光染色剂对皮肤毛囊炎样本的染色结果；
图4是本发明对比例1制备的荧光染色剂对金黄色葡萄球菌的染色结果；
图5是本发明对比例1制备的荧光染色剂对表皮葡萄球菌的染色结果；
图6是本发明对比例1制备的荧光染色剂对皮肤毛囊炎样本的染色结果；
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例的一种快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，本实施例中的PBS缓冲液包括质量浓度为0.7％的氯化钠、质量浓度为0.01％的磷酸二氢钠和质量浓度为0.08％的磷酸氢二钠，余量为水。
所述的荧光染色试剂的通过如下方法制备而成：用PBS缓冲液分别将抗FITC的IgG和FITC稀释至质量浓度为0.2％，两者等体积混合，得到混合物A，将碘化丙啶溶于水，使得碘化丙啶的质量浓度为0.003％，将碘化丙啶溶液与混合物A等体积混合，再加入二甲基亚砜和甘油，混合均匀，使得二甲基亚砜的质量浓度为15％，甘油的质量浓度为20％，得到所述的荧光染色试剂。
采用本实施例制备的荧光染色试剂对样本进行染色30-60s，再冲洗即可完成。
本实施例制备的荧光染色试剂分别对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和皮肤毛囊炎样本进行染色处理。
1、挑取金黄色葡萄球菌，涂于载玻片上，酒精灯烤干后，将所述的荧光染色试剂直接滴加到样本上，反应30-60s，纯化水冲洗后盖上盖玻片，使用吸水纸吸去多余染色液，选择波长为488nm的紫外光作为激发光，置于生物(荧光)显微镜物镜下，进行直接镜检如图1所示。
2、挑取表皮葡萄球菌，涂于载玻片上，酒精灯烤干后，所述的荧光染色试剂直接滴加到样本上，反应30-60s，纯化水冲洗后盖上盖玻片，使用吸水纸吸去多余染色液，选择波长为488nm的紫外光作为激发光，置于生物(荧光)显微镜物镜下，进行直接镜检如图2所示。
3、选取确诊的皮肤毛囊炎样本，将样本拭子涂抹在载玻片上。酒精灯烤干后，将所述的荧光染色试剂直接滴加到样本上，反应30-60s，纯化水冲洗后盖上盖玻片，使用吸水纸吸去多余染色液,选择波长为488nm的紫外光作为激发光，置于生物(荧光)显微镜物镜下，进行直接镜检如图3所示。
从图1-3可以看出，大部分金黄色葡萄球菌被染成外圈绿色，中间橙色，少量的金黄色葡萄球菌被染成绿色，表皮葡萄球菌被染成橙色，皮肤毛囊炎样本中可以清楚的观察到金黄色葡萄球菌。
实施例2
本实施例的一种快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，本实施例中的PBS缓冲液包括质量浓度为0.8％的氯化钠、质量浓度为0.02％的磷酸二氢钠和质量浓度为0.1％的磷酸氢二钠，余量为水。
所述的荧光染色试剂的通过如下方法制备而成：用PBS缓冲液分别将抗FITC的IgG和FITC稀释至质量浓度为0.4％，两者等体积混合，得到混合物A，将碘化丙啶溶于水，使得碘化丙啶的质量浓度为0.002％，将碘化丙啶溶液与混合物A等体积混合，再加入二甲基亚砜和丙二醇，混合均匀，使得二甲基亚砜的质量浓度为10％，丙二醇的质量浓度为15％，得到所述的荧光染色试剂。
本实施例制备的荧光染色试剂也对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和皮肤毛囊炎样本进行染色处理，染色方法及结果与实施例1基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。
实施例3
本实施例的一种快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，本实施例中的PBS缓冲液包括质量浓度为0.9％的氯化钠、质量浓度为0.03％的磷酸二氢钠和质量浓度为0.12％的磷酸氢二钠，余量为水。
所述的荧光染色试剂的通过如下方法制备而成：用PBS缓冲液分别将抗FITC的IgG和FITC稀释至质量浓度为0.04％，两者等体积混合，得到混合物A，将碘化丙啶溶于水，使得碘化丙啶的质量浓度为0.001％，将碘化丙啶溶液与混合物A等体积混合，再加入二甲基亚砜和丁二醇，混合均匀，使得二甲基亚砜的质量浓度为5％，丁二醇的质量浓度为10％，得到所述的荧光染色试剂。
本实施例制备的荧光染色试剂也对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和皮肤毛囊炎样本进行染色处理，染色方法及结果与实施例1基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。
对比例1
本对比例的荧光染色剂的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，用PBS缓冲液分别将抗FITC的IgG和FITC稀释至质量浓度为0.02％，碘化丙啶的质量浓度为0.001％。
本对比例制备的荧光染色试剂也对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和皮肤毛囊炎样本进行染色处理，染色方法与实施例1相同，染色结果分别如图4-6所示。从图中可以看出，大部分金黄色葡萄球菌被染成外圈绿色，中间橙色，少量金黄色葡萄球菌被染成绿色，表皮葡萄球菌被染成橙色，皮肤毛囊炎样本可以清楚的观察到金黄色葡萄球菌，但需要强的激发光，并且绿色容易猝灭。图1-3与图4-6相比，实施例1制备的荧光染色试剂染色效果比对比例1的染色效果好，对比清晰，毛囊炎样本染色增加了颜色反差，检测效率更高。
对比例2
本对比例的荧光染色剂的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，用PBS缓冲液分别将抗FITC的IgG和FITC稀释至质量浓度为0.036％。
本对比例制备的荧光染色试剂也对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和皮肤毛囊炎样本进行染色处理，染色方法及结果与对比例1基本一致。
对比例3
本对比例的荧光染色剂的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，用PBS缓冲液分别将抗FITC的IgG和FITC稀释至质量浓度为0.44％。
本对比例制备的荧光染色试剂也对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和皮肤毛囊炎样本进行染色处理，染色方法及结果与对比例1基本一致。
对比例4
本对比例的荧光染色剂的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，碘化丙啶的质量浓度为0.0008％。
本对比例制备的荧光染色试剂也对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和皮肤毛囊炎样本进行染色处理，染色方法及结果与对比例1基本一致。
对比例5
本对比例的荧光染色剂的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，碘化丙啶的质量浓度为0.0032％。
本对比例制备的荧光染色试剂也对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和皮肤毛囊炎样本进行染色处理，染色方法及结果与对比例1基本一致。
从对比例1-5和实施例1-3的染色结果可以看出，改变抗FITC的IgG和FITC和碘化丙啶的浓度会影响荧光染色试剂的检测效率，只有采用本发明的各物质的浓度配比下才具有较好的染色效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，其特征在于，由如下原料制成：盐溶液、特异性抗体、促溶剂、保湿剂、背景染料和荧光素；
所述的背景染料为FITC，所述背景染料的质量浓度为0.01-0.1%；
荧光素为碘化丙啶，碘化丙啶的质量浓度为0.0005-0.0015%；
其中，所述的特异性抗体为抗FITC的IgG，所述的特异性抗体的质量浓度为0.01-0.1%，所述的促溶剂为水溶性有机溶剂，所述的保湿剂为甘油、丙二醇、丁二醇中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，其特征在于，所述的盐溶液为PBS缓冲液。
3.根据权利要求2所述的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，其特征在于，所述的PBS缓冲液包括氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。
4.根据权利要求3所述的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，其特征在于，氯化钠的质量浓度为0.7-0.9%，磷酸二氢钠的质量浓度为0.01-0.03%，磷酸氢二钠的质量浓度为0.08-0.12%。
5.根据权利要求3或4所述的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，其特征在于，氯化钠的质量浓度为0.8%，磷酸二氢钠的质量浓度为0.02%，磷酸氢二钠的质量浓度为0.1%。
6.根据权利要求1所述的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，其特征在于，所述的促溶剂为二甲基亚砜。
7.根据权利要求6所述的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，其特征在于，所述的促溶剂的质量浓度为5-15%。
8.根据权利要求1所述的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，其特征在于，保湿剂为甘油。
9.根据权利要求1所述的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂，其特征在于，保湿剂的质量浓度为10-20%。
10.一种权利要求1-9任意一项所述的快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂的制备方法，其特征在于，用盐溶液分别将特异性抗体和背景染料稀释，两者等体积混合，得到混合物A，将荧光素溶解在水中与混合物A等体积混合，再加入促溶剂和保湿剂混合均匀，得到所述的荧光染色试剂。
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