CN112903995B - 一种比色/荧光探针、检测玉米赤霉烯酮的试纸条及应用 - Google Patents

一种比色/荧光探针、检测玉米赤霉烯酮的试纸条及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种比色/荧光探针、检测玉米赤霉烯酮的试纸条及应用，一种比色/荧光探针，含有：玉米赤霉烯酮单克隆抗体和信号载体，玉米赤霉烯酮单克隆抗体吸附于所述的信号载体上；所述的信号载体为刚果红染色的金黄色葡萄球菌或异硫氰酸荧光素染色的金黄色葡萄球菌。本发明既保留了完整的单克隆抗体标记表面结构，又保留了单克隆抗体出色的生物活性，从而摆脱了传统纳米材料的固有局限性，实现高灵敏目标物检测，检测限低至0.013ng/mL，能成功应用于玉米、绿豆、小米和花生样品中的玉米赤霉烯酮检测。

Description

一种比色/荧光探针、检测玉米赤霉烯酮的试纸条及应用
技术领域
本发明属生物检测领域，具体涉及一种比色/荧光探针、检测玉米赤霉烯酮的试纸条及应用，通过标记抗体制备比色/荧光探针，使用了该探针的试纸条，及其用于快速检测玉米赤霉烯酮的应用。
背景技术
玉米赤霉烯酮(ZEN)又称为F-2毒素，是镰刀菌产生的次生代谢产物，主要存在于农产品中。ZEN已被证明是一种内分泌干扰物，与子宫内膜增生症，青春期早期综合征和人宫颈癌密切相关。迄今为止，已经报道了检测玉米赤霉烯酮的几种分析方法，包括薄层色谱法、液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法和电化学生物传感器等。然而，复杂的准备步骤、昂贵的设备和耗时的程序和熟练的操作人员使得这些方法不适合在许多实验室和其他地点现场快速检测技术。为了更灵敏地检测玉米赤霉烯酮，特别是现场快速检测，实现易于快速、便捷和价格低廉方法仍然是巨大的技术挑战。
近年来，免疫层析试纸条，由于其快速、灵敏度高、特异性好，并且成本较低，受到了广泛的关注，成为现场快速检测的重要手段，主要用于监测低浓度的分析物，例如病毒，癌症生物标志物，细菌和毒素。目前各种信号标记材料，如聚合物点、磁性量子点、碳点、Pt-Ni(OH)2纳米片和钙钛矿纳米晶体等被用作信号载体来提高试纸条检测方法的灵敏度。但是，免疫层析试纸条的适用性始终受到纳米材料和抗体的一些不可控制因素的阻碍：(1)功能性纳米材料的制备通常需要有毒试剂，强化学试剂，高温和高压，这对环境有害且难以复制；(2)抗体和纳米材料之间的交联(被动吸附和共价偶联)不仅易受孵育参数(抗体的等电点，温度，离子浓度)的影响，而且抗体随机且非特异性地固定在材料的表面，这会削弱抗体的活性，并使生物传感器无法有效监控其预期的分析物。为了规避这些限制，迫切需要开发一种简便且环保的策略，以生产具有出色光学特性的替代载体，定向固定抗体，从而保留抗体的生物识别能力。
发明内容
针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种比色/荧光探针、检测玉米赤霉烯酮的试纸条及应用。基于染料染色技术，使用刚果红或异硫氰酸荧光素对金黄色葡萄球菌染色作为生物载体，通过标记抗体制备比色/荧光探针，该探针稳定，信号强且可以定向的结合抗体Fc片段，从而使Fa片段区域有效暴露，最大程度地保留生物活性，并且大大提高了灵敏度，这对于监控食品中的残留的玉米赤霉烯酮具有很重要的意义和应用价值。
为达到上述技术效果，本发明采取的技术方案为：
一种比色/荧光探针，含有：
玉米赤霉烯酮单克隆抗体和信号载体，玉米赤霉烯酮单克隆抗体吸附于所述的信号载体上；
所述的信号载体为刚果红染色的金黄色葡萄球菌或异硫氰酸荧光素染色的金黄色葡萄球菌。
可选的，所述的金黄色葡萄球菌的粒径为598～609nm，金黄色葡萄球菌的OD600值为2.6；
玉米赤霉烯酮单克隆抗体的浓度为1mg/mL；
所述的刚果红染色的金黄色葡萄球菌为采用溶液浓度为1mg/mL的刚果红染色，异硫氰酸荧光素染色的金黄色葡萄球菌为采用溶液浓度为1mg/mL的异硫氰酸荧光素染色。
可选的，比色/荧光探针的制备方法包括：
玉米赤霉烯酮单克隆抗体与刚果红染色后的金黄色葡萄球菌液混合或异硫氰酸荧光素染色后的金黄色葡萄球菌液混合，再经过蛋白封闭及离心重悬于缓冲液即得。
可选的，玉米赤霉烯酮单克隆抗体与刚果红染色后的金黄色葡萄球菌液的用量比为4μg:1mL；
玉米赤霉烯酮单克隆抗体与异硫氰酸荧光素染色后的金黄色葡萄球菌液的用量比为4μg:1mL；
混合时间为2h，蛋白封闭的时间为30min。
可选的，刚果红对金黄色葡萄球菌的染色时间为25min，异硫氰酸荧光素对金黄色葡萄球菌的染色时间为60min。
一种检测玉米赤霉烯酮的试纸条，该试纸条上载有本发明所述的比色/荧光探针。
可选的，所述的试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线和控制线，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理。
可选的，1mg/mL玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物以1μL/cm的划线速率涂覆在检测线上得检测线，0.5mg/mL羊抗鼠免疫球蛋白以1μL/cm的划线速率涂覆在控制线上为控制线；37℃条件下干燥30min；
所述的样品垫与结合垫的制备方法包括：将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，37℃干燥8h；
所述的样品垫的规格为长13～18mm，宽2～4mm，所述的结合垫的规格为长7～9mm，宽2～4mm。
本发明所述的比色/荧光探针用于制备检测粮食中玉米赤霉烯酮试纸条或试剂盒的应用，所述的粮食优选为玉米、绿豆、小米和/或花生。
本发明所述的检测玉米赤霉烯酮的试纸条用于检测玉米、绿豆、小米和/或花生中玉米赤霉烯酮的应用。
与现有技术相比，其优点与积极效果在于：
(1)打破传统复杂的交联过程：该发明只通过染色后的金黄色葡萄球菌与抗体进行简单的吸附作用制备比色/荧光荧光探针，免去了复杂的标记过程(如EDC/NHS方法)；
(2)比色/荧光探针：首次在免疫层析试纸条检测中通过刚果红或异硫氰酸荧光素对金黄色葡萄球菌染色作为生物载体标记抗体制备比色/荧光探针，该探针稳定，信号强且可以定向的结合抗体Fc片段，从而使Fa片段区域有效暴露，保留了抗体的生物识别能力。这项工作为玉米、绿豆、小米和花生样品中的玉米赤霉烯酮检测开发了便宜，灵敏，便携和快速读出的分析系统；
(3)灵敏度高：本发明提供的试纸条对玉米赤霉烯酮的最低检测限为0.013ng/mL；该方法能高灵敏度检测玉米赤霉烯酮，可作为通用方法快速、便捷检测食品中毒素的残留；
(4)特异性高：该发明试纸条能高度特异性识别玉米赤霉烯酮，对其他毒素都无特异性；
(5)良好的实际应用：本发明可以检测玉米、豆类、小米和花生中的玉米赤霉烯酮，具有很好的应用前景，可以作为检测各种毒素的通用检测方法。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1为研究不同比色染料和荧光染料对金黄色葡萄球菌的染色以及有色的金黄色葡萄球菌在免疫层析试纸条上的适用性；
图2为本发明的快速检测玉米赤霉烯酮的免疫层析试纸条的试纸条组装示意图；
图3为本发明的快速检测玉米赤霉烯酮的免疫层析的原理流程图；
图4为本发明制备的免疫层析试纸条检测灵敏度和特异，Control，OTB，OTA，AFB1，AFB2，AFG1，FB1，PAT，DON和ZEN分别表示空白，赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B，黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B2，黄曲霉毒素G1，伏马菌素B1，展青霉素，呕吐毒素和玉米赤霉烯酮；
图5为本发明制备的免疫层析试纸条检测的实际应用；
图6为本发明制备的有色的金黄色葡萄球菌的表征；
图7为本发明比色/荧光探针的验证；
以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种比色/荧光探针、检测玉米赤霉烯酮的试纸条及应用。基于染料染色技术，使用刚果红或异硫氰酸荧光素对金黄色葡萄球菌染色作为生物载体，通过标记抗体制备比色/荧光探针，该探针稳定，具有优良的光学特性且可以定向的结合抗体Fc片段，从而使Fa片段区域有效暴露，最大程度地保留生物活性，并且大大提高了灵敏度，这对于监控食品中的残留的玉米赤霉烯酮具有很重要的意义和应用价值。
本发明的金黄色葡萄球菌(SA)是自然界中容易获得的革兰氏阳性微生物，由于其表面存在大量的蛋白A，可以直接靶向结合单克隆抗体(mAbs)的Fc部分，从而使材料与抗体特异性结合。使用染色后的SA进行mAbs的位点特异性标记有几个优点：(1)SA具有较大的表面体积比，丰富的官能团以及将生物废物转化为功能材料的能力；(2)所使用的染料具有成本效益，极佳的光学性能，易于获得并且易于装载到完整细胞中；(3)更重要的是，无需进行额外的修饰即可轻松对微生物载体进行染色，从而摒弃了传统纳米材料的固有局限性；(4)在连接过程中，无需对mAbs进行修饰并进行定点捕获，从而可以完美地保持抗原结合活性并充分暴露Fab结构域。
为了获得最佳的测定性能，发明人优化了SA的浓度，染料的添加量，染色时间，mAbs的使用量，比色/荧光探针的体积以及免疫时间，并确定了最优的系统条件。最终制得的试纸条用于检测食品中残留的玉米赤霉烯酮毒素，该方法已成功应用于玉米，豆类，小米和花生中玉米赤霉烯酮的检测，验证了其实用性，灵敏性和准确性。
结合图3，该试纸条的工作原理为：将金黄色葡萄球菌在LB肉汤中培养获得纯净的细胞溶液。将刚果红(CR)和异硫氰酸荧光素(FITC)染料加入上述介质中制备载体SACR和SAFITC。加入玉米赤霉烯酮单克隆抗体制备比色/荧光探针。该试纸条检测基于竞争检测原理，将比色/荧光探针与样品溶液混合，然后滴到测试条上，通过毛细作用移向试纸的测试区域。当样品溶液中不存在时，比色/荧光探针会被检测线中玉米赤霉烯酮抗原捕获，在检测线上形成可见带。相反，对于阳性样品，游离的玉米赤霉烯酮和固定在检测线上抗原之间存在强烈的竞争反应，导致检测线强度随玉米赤霉烯酮浓度的增加而降低。当玉米赤霉烯酮浓度足够高时，比色/荧光探针仅会被控制线上的羊抗鼠免疫球蛋白捕获，不会在检测线上出现可见带。
制备该荧光探针的方法包括：
(1)制备有色的金黄色葡萄球菌(SA)：在培养基中生长SA以获得均匀形状和活化的细胞，然后向上述细胞培养物中添加刚果红或异硫氰酸荧光素以使细菌着色。
(2)制备比色/荧光探针：将玉米赤霉烯酮单克隆抗体加入步骤(1)中有色的金黄色葡萄球菌溶液中混合，用牛血清蛋白封闭，离心重悬于磷酸盐缓冲液即得，玉米赤霉烯酮单克隆抗体与有色的金黄色葡萄球菌溶液的混合比为4μg:1mL，混合时间为2h，牛血清蛋白的终体积浓度1％，封闭时间为30min。
本发明的免疫层析试纸条由五部分构成，依次将硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫和吸水垫贴至衬板上，其中硝酸纤维素上划线包被有玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物(ZEN-BSA)和羊抗鼠免疫球蛋白(IgG)分别做为检测线T线和控制线C线。
本发明中所用的实验试剂均为市售所得，并未做进一步处理，检测仪器设备等均为常用的仪器。
实施例1：不同染料对玉米赤霉烯酮的试纸条的影响
金黄色葡萄球菌用不同的染料着色可能会对免疫层析试纸条产生不同的影响，因为各种染料具有不同的特性，例如颜色强度，水分散性和生物相容性。因此，我们采用了一系列可见染料和荧光染料对金黄色葡萄球菌进行染色，并应用于免疫层析试纸条，以研究和比较免疫层析试纸条上不同染料的信号。如图1所示，在比色染料中，除橙黄II和胭脂红外，金黄色葡萄球菌可以被大多数染料染色，并且相应的条带显示不同的颜色。此外，因为用刚果红作为染料试纸条的条带的着色时间和程度要优于其他染料。因此，这项工作使用刚果红作为免疫层析试纸条上的比色信号。同样，由于异硫氰酸荧光素在免疫层析试纸条上的信号简单，因此被选作荧光染料。
实施例2：快速检测玉米赤霉烯酮的试纸条的探针制备
遵从上述技术方案，本实施例给出比色/荧光探针及制备方法，包括以染色的金黄色葡萄球菌作为信号载体，然后加入玉米赤霉烯酮单克隆抗体进行吸附即得。包括以下步骤：
(1)制备有色的金黄色葡萄球菌(SACR和SAFITC)：将金黄色葡萄球菌(SA)在37℃，160rpm摇动下在LB肉汤中培养12h。将培养物以5000rpm离心5min，然后重新分散在去离子水中，以获得纯净的细胞溶液。将细菌原液稀释至OD600为2.6，作为载体。然后将刚果红(CR)和异硫氰酸荧光素(FITC)染料加入上述介质中，并在37℃下搅拌一段时间。最后，使用去离子水以5000rpm离心5min清洗三次，然后在65℃加热30min以灭活细菌，以便进一步使用。通过将一定比例的制备的SACR和SAFITC载体。
(2)制备比色/荧光探针：将玉米赤霉烯酮单克隆抗体加入步骤(1)中有色的金黄色葡萄球菌溶液中混合，用牛血清蛋白封闭，离心重悬于0.01M磷酸盐缓冲液即得。
在搅拌下将适量的4μg玉米赤霉烯酮单克隆抗体放入1mL上述制备的SACR或SAFITC中2h，然后添加10％BSA并反应30min以封闭多余未结合的位点。最后，将混合物离心，分散在500μL磷酸盐缓冲液(0.01M PBS)中，并保存在4℃冰箱里进一步使用。下述实施例3-6使用的检测玉米赤霉烯酮的探针为实施例1制备得到的。
实施例3：快速检测玉米赤霉烯酮的免疫层析试纸条的制备
结合图2，本实施例给出了快速检测玉米赤霉烯酮的高灵敏度免疫层析试纸条，包括硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫和吸水垫以及衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线和控制线，结合垫及样品垫分别经封闭液进行封闭处理。
硝酸纤维素膜的制备方法包括：1mg/mL玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物和0.5mg/mL羊抗鼠免疫球蛋白分别以1μL/cm的划线速率涂覆在检测线和控制线上，检测线和控制线之间的间距为40mm；然后于37℃条件下干燥30min。
样品垫的制备：将玻璃纤维膜剪裁成长15mm宽3mm的规格，放入封闭液(2％BSA)中浸湿，于37℃条件下干燥8h，得样品垫，然后置4℃冰箱中保存。
结合垫的制备：将玻璃纤维膜剪裁成长8mm宽3mm的规格，放入封闭液(2％BSA)中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8h，得样品垫，然后置4℃冰箱中保存。
吸水垫的制备：将吸水纸剪裁成长18mm宽3mm的规格，即得吸水垫。
试纸条的组装：首先将硝酸纤维素膜贴附于衬板上，然后样品垫压结合垫1～3mm，结合垫压硝酸纤维素膜1～3mm，吸水垫压硝酸纤维素膜1-3mm依次贴附于衬板上，即得快速检测玉米赤霉烯酮的免疫层析试纸条。
实施例4：快速检测玉米赤霉烯酮的试纸条的灵敏度测定
检测过程：将玉米赤霉烯酮标准品溶于0.01M磷酸盐缓冲液中，连续稀释为0到12.0ng/mL不同的浓度，0.01M磷酸盐缓冲液作为为空白对照。将4μL的SACR-mAb探针或2.5μL的SAFITC-mAb探针与100μL玉米赤霉烯酮标准溶液混合孵育，再把测试条的样品垫浸入不同浓度100μL检测液中，混合物通过毛细血管力的作用向吸收垫迁移。反应20min后，用肉眼观察T线的信号强度，并用便携式装置定量测量。
检测结果：当通过肉眼观察到检测线T线明显比空白对照条浅时，相应的玉米赤霉烯酮最小浓度定义为视觉检测限(vLOD)，当检测线T线完全消失时，相应的最小浓度作为阈值浓度。竞争抑制率IC10定义为检测限(LOD)。
见图4A,在SACR-CICA检测玉米赤霉烯酮的校准曲线中得到，随着玉米赤霉烯酮的浓度从0到12.0ng/mL，试纸条T线强度不断降低，vLOD为0.045ng/mL，使T线完全消失的阈值浓度为1.5ng/mL。图4B为SACR-CICA标准曲线检测玉米赤霉烯酮的线性区域，在0.02～12ng/mL范围内的回归方程为Y＝179.53-165.26X(X＝lg[玉米赤霉烯酮浓度])，具有良好的拟合关系(相关系数(R2)＝0.9838)。见图4D,在SAFITC-FICA检测玉米赤霉烯酮的校准曲线中得到，随着玉米赤霉烯酮的浓度从0到12.0ng/mL，试纸条T线荧光强度不断降低，vLOD为0.09ng/mL，使T线完全消失的阈值浓度为3ng/mL。图4D为SAFITC-FICA标准曲线检测玉米赤霉烯酮的线性区域，在0.045～12ng/mL范围内呈良好的线性关系，R2为0.9836，回归方程为Y＝48.63-48.92X(X＝lg[玉米赤霉烯酮浓度])。通过计算SACR-CICA的LOD为0.013ng/mL，比SAFITC-FICA的LOD(0.039ng/mL)低约3倍。因此，该方法能高灵敏度检测玉米赤霉烯酮，可作为通用方法快速、便捷检测食品中毒素的残留。
实施例5：快速检测玉米赤霉烯酮的试纸条的特异性测定
检测过程：分别将黄曲霉毒素B1(AFB1)，黄曲霉毒素B2(AFB2)，黄曲霉毒素G1(AFG1)，赭曲霉毒素A(OTA)，赭曲霉毒素B(OTB)，呕吐毒素(DON)，伏马菌素B1(FB1)和展青霉素(PAT)用0.01M磷酸盐缓冲液稀释至100ng/mL的浓度，与4μL的SACR-mAb探针或2.5μL的SAFITC-mAb探针与100μL检测液混合孵育，再把测试条浸入100μL测试溶液中，同时取100μL0.01M磷酸盐缓冲液作为空白对照液。20min后，使用条带读取器获得T线强度。
见图4C，验证了SACR-CICA检测玉米赤霉烯酮的特异性。玉米赤霉烯酮的样品浓度为1.5ng/mL时，T线上的颜色被抑制，而对于其他常见的毒素在T线上可以观察到明显的颜色。见图4F，验证了SAFITC-FICA检测玉米赤霉烯酮的特异性。仅在掺有3ng/mL玉米赤霉烯酮的样品会导致T线的荧光强度显着降低，而对于其他常见毒素的T线上可以观察到很强的荧光带。说明该发明试纸条能高度特异性识别玉米赤霉烯酮，有很高的特异性。
实施例6：快速检测玉米赤霉烯酮的试纸条的应用
检测过程：将玉米，绿豆，小米和花生加标预处理玉米赤霉烯酮。在预处理之前，使用液相色谱-质谱法(LC-MS)确认空白的真实样品是否存在玉米赤霉烯酮。将2g样品磨碎，然后加入10mL甲醇-水(30:70，v/v)，充分振荡20min。将得到的提取物在6000rpm下离心10min获得上清液。
将上述预处理的实际样品溶液稀释并加标(玉米赤霉烯酮浓度为0-12ng/mL)，将4μL的SACR-mAb探针或2.5μL的SAFITC-mAb探针与100μL玉米赤霉烯酮标准溶液混合孵育，再把测试条的样品垫浸入100μL测试溶液中，混合物通过毛细作用向吸收垫迁移。反应20min后，用肉眼观察T线的信号强度，并用便携式装置定量测量。
见图5A、C、E和G，对于SACR-CICA，随着玉米赤霉烯酮浓度的增加，T线的强度逐渐降低。玉米，绿豆，花生和小米样品的视觉检测限vLOD均为0.36μg/kg。见图5B、D、F和H，对于SAFITC-FICA，随着玉米赤霉烯酮浓度的增加，T线的荧光强度逐渐降低。在绿豆中玉米赤霉烯酮的vLOD约为0.72μg/kg，而玉米，小米和花生样品中的玉米赤霉烯酮的vLOD约为0.36μg/kg。因此，本发明能检测玉米，豆类，小米和花生中的玉米赤霉烯酮，与加标样品的结果一致，反映了其良好的实际应用价值。
实施例7：有色的金黄色葡萄球菌的表征
(1)扫描电镜：合成载体的SEM图像如图6中A、B和C所示，其中清晰显示了由SA，SACR和SAFITC形成的平均粒径为609±42.18nm，600±45.55nm和598±43.41nm的典型纳米球(图D、E和F)。合成载体在大小上没有显着差异，表明染料的加入对SA微球表面没有影响。
(2)紫外可见光谱图：在紫外可见光谱中，分别将CR和FITC孵育后，在SA上明显出现了CR(497nm)和FITC(493nm)的特征吸收峰，这意味着成功将CR和FITC加载到了SA上(图G和H)。同时，可以注意到SAFITC在515nm发射的强荧光特性，并在467nm处具有最佳激发。
(3)显微镜和共聚焦显微镜图(图I和图J)：显微镜和共聚焦显微镜图像显示SACR显示亮红色，SAFITC显示绿色，均具有良好的分散性。
实施例8：比色/荧光探针的表征
为了证明本发明成功制备了比色/荧光探针，本发明人还做了以下实验(见图7)：
(1)zeta电位：图A和B可以看出SA，SACR和SAFITC的Zeta电位分别为-19.77mV，-21.77mV和-21.6mV，加入单克隆抗体后的Zeta电位的发生了明显的变化，表明抗体成功地标记在SACR和SAFITC表面。
(2)紫外可见光谱图：图C和D可以观察到加入抗体后的SACR和SAFITC在280nm出现了抗体的特征峰，表明单克隆抗体与SACR和SAFITC的成功标记。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (9)

1.一种比色/荧光探针，其特征在于，含有：
玉米赤霉烯酮单克隆抗体和信号载体，玉米赤霉烯酮单克隆抗体吸附于所述的信号载体上；所述的信号载体为刚果红染色的金黄色葡萄球菌或异硫氰酸荧光素染色的金黄色葡萄球菌；
所述的金黄色葡萄球菌的粒径为598～609 nm，金黄色葡萄球菌的OD600值为2.6；
玉米赤霉烯酮单克隆抗体的浓度为1mg/mL；
所述的刚果红染色的金黄色葡萄球菌为采用溶液浓度为1 mg/mL的刚果红染色，异硫氰酸荧光素染色的金黄色葡萄球菌为采用溶液浓度为1 mg/mL的异硫氰酸荧光素染色。
2.如权利要求1所述的比色/荧光探针，其特征在于，比色/荧光探针的制备方法包括：
玉米赤霉烯酮单克隆抗体与刚果红染色后的金黄色葡萄球菌液混合或异硫氰酸荧光素染色后的金黄色葡萄球菌液混合，再经过蛋白封闭及离心重悬于缓冲液即得。
3.如权利要求2所述的比色/荧光探针，其特征在于，玉米赤霉烯酮单克隆抗体与刚果红染色后的金黄色葡萄球菌液的用量比为4 μg :1 mL；
玉米赤霉烯酮单克隆抗体与异硫氰酸荧光素染色后的金黄色葡萄球菌液的用量比为4μg :1 mL；
混合时间为2 h，蛋白封闭的时间为30 min。
4.如权利要求1或2所述的比色/荧光探针，其特征在于，刚果红对金黄色葡萄球菌的染色时间为25min，异硫氰酸荧光素对金黄色葡萄球菌的染色时间为60min。
5.权利要求1～4任一所述的比色/荧光探针用于制备检测粮食中玉米赤霉烯酮试纸条或试剂盒的应用。
6.一种检测玉米赤霉烯酮的试纸条，其特征在于，该试纸条上载有权利要求1～4任一权利要求所述的比色/荧光探针。
7.如权利要求6所述的检测玉米赤霉烯酮的试纸条，其特征在于，所述的试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线和控制线，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理。
8.如权利要求7所述的检测玉米赤霉烯酮的试纸条，其特征在于，1 mg/mL玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物以1 μL/cm的划线速率涂覆在检测线上得检测线，0.5 mg/mL羊抗鼠免疫球蛋白以1 μL/cm的划线速率涂覆在控制线上为控制线；37℃条件下干燥30min；
所述的样品垫与结合垫的制备方法包括：将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，37℃干燥8h；
所述的样品垫的规格为长13～18 mm，宽2～4 mm，所述的结合垫的规格为长7～9 mm，宽2～4 mm。
9.权利要求6～8任一所述的检测玉米赤霉烯酮的试纸条用于检测玉米、绿豆、小米和/或花生中玉米赤霉烯酮的应用。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113484519B (zh) * 2021-07-21 2023-04-28 西北农林科技大学 一种探针、检测玉米赤霉烯酮的方法及应用
CN114836200B (zh) * 2022-06-16 2023-05-05 郑州大学 基于人血清蛋白的复合荧光探针及其制备方法和在检测赭曲霉毒素a中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4471058A (en) * 1982-07-26 1984-09-11 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for the detection and/or determination of a polyvalent antigen using at least two different monoclonal antibodies
CN106066400A (zh) * 2016-06-14 2016-11-02 焦作百奥泰科生物科技有限公司 一种检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸
CN107602701A (zh) * 2017-08-11 2018-01-19 中国农业科学院油料作物研究所 基于抗独特型纳米抗体的玉米赤霉烯酮绿色免疫分析方法
CN107976541A (zh) * 2017-11-29 2018-05-01 洛阳现代生物技术研究院有限公司 同步检测玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素b1的试纸卡、制备及检测方法
CN108459161A (zh) * 2018-03-05 2018-08-28 武汉纺织大学 接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜及细菌检测的方法
CN110488016A (zh) * 2019-08-14 2019-11-22 江南大学 一种玉米赤霉烯酮-呕吐毒素双通道免疫定量试纸条
CN110563839A (zh) * 2019-08-19 2019-12-13 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌肠毒素b纳米抗体b1、应用及试剂盒

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2097912A1 (en) * 1991-10-09 1993-04-10 Yoshiyuki Kamio Method of detecting methicillin-resistant staphylococcus aureus, novel peptides, and dnas encoding the same
JPH1128099A (ja) * 1997-05-12 1999-02-02 Kikkoman Corp 黄色ブドウ球菌の検出法
CN102841204B (zh) * 2012-08-27 2014-11-26 暨南大学 一种玉米赤霉烯酮免疫荧光快速检测试纸条及其制备方法和用途
CN103777016B (zh) * 2013-12-17 2015-09-02 武汉大学 一种通过荧光靶向细胞检测病毒和细菌的方法
CN104849461B (zh) * 2014-02-14 2016-09-21 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测玉米赤霉烯酮的试纸条及其应用
CN104198737B (zh) * 2014-09-11 2016-07-06 中国科学院武汉病毒研究所 基于金黄色葡萄球菌的生物探针、制备方法及其应用
CN105506070A (zh) * 2015-08-20 2016-04-20 江苏省家禽科学研究所 一种特异性探针及将其用于快速灵敏定量金黄色葡萄球菌的方法
CN107228819B (zh) * 2017-06-04 2019-12-13 胥振国 一种金黄色葡萄球菌的流式细胞术检测方法
CN107422124A (zh) * 2017-06-16 2017-12-01 普菲特益斯生物科技（北京）有限公司 玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡及其制备方法
CN109061144A (zh) * 2018-09-19 2018-12-21 无限极（中国）有限公司 一种用于检测玉米赤霉烯酮的定性定量免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN110988344B (zh) * 2019-12-26 2022-02-25 江苏美克医学技术有限公司 快速鉴别金黄色葡萄球菌的荧光染色试剂及其制备方法
CN110982870B (zh) * 2019-12-26 2022-03-22 江苏美克医学技术有限公司 一种微生物多重荧光染色液及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4471058A (en) * 1982-07-26 1984-09-11 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for the detection and/or determination of a polyvalent antigen using at least two different monoclonal antibodies
CN106066400A (zh) * 2016-06-14 2016-11-02 焦作百奥泰科生物科技有限公司 一种检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸
CN107602701A (zh) * 2017-08-11 2018-01-19 中国农业科学院油料作物研究所 基于抗独特型纳米抗体的玉米赤霉烯酮绿色免疫分析方法
CN107976541A (zh) * 2017-11-29 2018-05-01 洛阳现代生物技术研究院有限公司 同步检测玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素b1的试纸卡、制备及检测方法
CN108459161A (zh) * 2018-03-05 2018-08-28 武汉纺织大学 接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜及细菌检测的方法
CN110488016A (zh) * 2019-08-14 2019-11-22 江南大学 一种玉米赤霉烯酮-呕吐毒素双通道免疫定量试纸条
CN110563839A (zh) * 2019-08-19 2019-12-13 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌肠毒素b纳米抗体b1、应用及试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Niazi S 等. A novel bioassay based on aptamer-functionalized magnetic nanoparticle for the detection of zearalenone using time resolved-fluorescence NaYF4: Ce/Tb nanoparticles as signal probe.Talanta.2018,186全文. *
王青 ; 徐美蓉 ; 黄铮 ; 寇向龙 ; .快速检测技术在食品检测领域中的应用.食品安全导刊.2019,(30),全文. *

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