CN103777016B

CN103777016B - 一种通过荧光靶向细胞检测病毒和细菌的方法

Info

Publication number: CN103777016B
Application number: CN201310691503.3A
Authority: CN
Inventors: 庞代文; 熊玲红; 崔然
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2013-12-17
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2033-12-17
Also published as: CN103777016A

Abstract

本发明涉及一种将细胞高效地转化为生物探针并应用于病毒和细菌检测的方法，包括步骤：将实验室提出的“时-空耦合”新策略这种原创性方法成功地应用于金黄色葡萄球菌（金葡菌）中，从而细菌体内能够高效地被发光量子点点亮，巧妙了构建了一种信号报告体，由于细胞表面天然表达蛋白A，无需进行复杂的代谢和基因工程改性细胞，只需将荧光菌与抗体孵育，离心洗涤多余抗体，细胞壁表面就能够与抗体结合，得到具有靶向性的探针。结合免疫磁捕获方法，通过免疫磁球捕获待检测的病毒或细菌，利用这种荧光靶向探针成功的实现对禽流感H9N2病毒和鼠寒沙门氏菌检测。整个构建细胞探针的方法简单且巧妙，检测过程特异性强，灵敏度高。

Description

一种通过荧光靶向细胞检测病毒和细菌的方法

技术领域

本发明涉及一种通过荧光靶向细胞检测病毒和细菌的方法，属于化学生物学领域。

背景技术

近年来，随着洁净，无毒和环境友好“绿色化学”的发展，使用有机生物体合成纳米材料越来越值得关注。大量的有机生物体被科研工作者用来合成无机纳米材料，例如使用酿酒酵母细胞作为反应器可控地合成荧光量子点，利用大肠杆菌合成CdS纳米晶体，在蚯蚓体内合成发光量子点等。尽管在生物合成领域已经取得了巨大进展，但是使用生物体合成高质量发光纳米材料并且进一步将胞内的荧光应用于生物医学方面仍然是一个巨大的挑战。

我们课题组首次提出了“时-空耦合”新策略，利用酵母的富硒及对于重金属的解毒能力这两个重要功能实现了在酵母细胞内合成多色发光量子点（绿色，黄色和红色）。亚硒酸钠这个无机物质在细胞内被还原为低价态的有机硒，然后镉解毒通过与胞内含巯基的生物分子结合形成的镉前体在未被转运到液泡之前即与还原的低价有机硒相遇，从而合成了发光CdSe量子点，为生物合成开创了一片新领域。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种用生物体系为平台构建生物探针并且应用于病毒和细菌检测的方法。

本发明将实验室提出的“时-空耦合”新策略这种原创性方法成功地应用于金葡菌中，通过向培养有金葡菌的培养基中适时适量依次加入亚硒酸钠和氯化镉，在细菌体内合成了发光量子点，从而细菌能够高效地被发光量子点点亮，巧妙地构建了一种信号报告体，由于金葡菌细胞壁表面天然表达蛋白A，能够直接与单克隆抗体结合，制备具有靶向性探针。该探针是由发光细胞和结合在表面的抗体构成，其中细胞的荧光作为信号报告体，而已结合的抗体是具有靶向性并且能够特异性识别抗原，因此所获得的探针是一种具有荧光靶向性双功能探针。结合免疫磁捕获方法，将磁球偶联上目标检测病毒或细菌的单克隆抗体，从而捕获目标病毒或细菌，用制备的荧光靶向细胞作为探针去检测捕获的目标病毒或细菌，通过检测磁球-病毒/细菌-探针复合物的荧光信号检测病毒或细菌。

具体的技术方案是：

1、向含有金葡菌的培养基中加入终浓度为5mM的亚硒酸钠，孵育12h后，离心除去上清液，再转入新鲜培养基中，再加入终浓度为1mM的氯化镉，孵育12h，在细菌体内即合成了CdS_0.5Se_0.5量子点，荧光菌即构建完毕，将细胞离心洗涤后，与病毒或细菌单克隆抗体孵育，通过离心洗涤多余抗体，即获得荧光靶向细胞，并用牛血清白蛋白进行封闭；

2、利用EDC/NHS活化法将抗病毒或细菌表面蛋白的单克隆抗体偶联到表面带羧基（-COOH）的磁性纳米球表面，并用牛血清白蛋白对其进行封闭；将免疫磁球加入样品溶液中孵育，用磁力架吸附并洗涤，最后加入溶液重悬，得到磁球-病毒/细菌的复合物；

3、将(1)构建的荧光靶向细胞加入到（2）得到磁球-病毒/细菌复合物中孵育，用磁力架吸附并洗涤，最后加入溶液重悬，得到磁球-病毒/细菌-荧光菌的复合物，利用荧光显微镜对磁球-病毒/细菌-荧光菌进行检测。

其中步骤1中，将Na₂SeO₃和CdCl₂先后依次加入到含有稳定生长期金葡菌的培养基中，孵育12 h后，细菌体内合成了发光量子点。细胞表面含有蛋白A，通过与抗体孵育，细胞能够有效地结合抗体形成荧光靶向细胞。结合免疫磁捕获的方法，利用已制备的荧光探针能够实现病毒或细菌检测。

所述荧光靶向细胞，其荧光来源于细胞内生物合成的发光量子点，表面带有抗病毒或细菌表面抗原的抗体，是直接将细胞与抗体孵育，通过细胞壁表面内源表达的蛋白A直接与抗体结合来制备。

所述的磁球，表面带有-COOH，通过EDC/NHS活化抗病毒或细菌的抗体偶联在磁球上，用于捕获病毒或细菌。

所述目标病毒或细菌是指H9N2禽流感病毒、鼠寒沙门氏菌等。

基于上述方法，本发明利用“时空耦合”策略，人为巧妙地控制外加无机盐的时间和用量，使原本不可能发荧光的金葡菌通过与无机盐共孵育，在细菌体内合成了发光量子点，从而有效地点亮细胞，同时利用细胞表面天然表达蛋白A这一特性，将其与抗体结合制备靶向性细胞，这样就成功制备了荧光靶向双功能细胞作为荧光探针。该探针是由发光细胞和结合在表面的抗病毒或细菌表面抗原的抗体构成，所述发光细胞内含有生物合成的发光量子点CdS_0.5Se_0.5。其中细胞的荧光作为信号报告体，而已结合的抗体是具有靶向性并且能够特异性识别抗原。该探针稳定性好，发光效率高（几乎每个细胞都有荧光），结合免疫磁捕获，利用偶联有病毒或细菌的单克隆抗体的免疫磁球捕获病毒或细菌，用荧光探针识别目标病毒或细菌，通过荧光显微镜对磁球-病毒/细菌-荧光探针复合物进行检测。

整个检测过程非常简单，灵敏度高，特异性强。本发明方法构思巧妙，简单易行，无需对细胞进行复杂的基因或代谢工程的改进和修饰，就能制备荧光强度高，光稳定性好，发光效率高的荧光生物探针，结合免疫磁球，实现了对病毒和细菌的检测。

附图说明

图1为整个实验的原理示意图，包括A)生物探针的构建以及B)病毒的检测。

图2为细菌合成量子点的实验组明场显微镜结果（A）和荧光场结果（B），对照组明场显微镜结果（C）和荧光场结果（D），实验组荧光场区域放大结果（E），合成量子点的细菌的水合粒径结果（F），用IPP软件处理合成量子点细菌的荧光图片，统计500个单独细菌的荧光情况，表示每个细菌的荧光强度分布情况（G）。

图3合成量子点细菌的荧光光稳定性结果。刚合成量子点的金葡菌其荧光结果（A），合成量子点的金葡菌于4℃下放置2个月的荧光结果（B），刚合成量子点的金葡菌于65℃水浴30 min的荧光结果（C）,合成量子点的金葡菌于4℃放置2个月后于65℃水浴加热30 min的荧光结果（D），IPP软件处理对应不同条件下发光细菌后荧光强度柱状图（E）。

图4为发光细胞的发光效率。刚合成量子点的金葡菌于65℃水浴加热30 min的镜检结果，其中（A）为明场结果，（B）为荧光场结果，（C）为明场和荧光场的叠加结果。合成量子点的金葡菌放置4℃2个月后于65℃加热30 min的镜检结果，其中（D）为明场结果，（E）为荧光场结果，（F）为明场和荧光场叠加结果。

图5胞内发光量子点的表征结果。（A）为从细菌体内提出的量子点的电镜结果。（B）为统计200颗量子点的粒径分布结果。（C）提取出来量子点的高分辨透射电镜结果，其晶面间距为0.19 nm。（D）为细菌内合成量子点的原位高分辨透射电镜结果，其晶面间距为0.19 nm。（E）为菌内提出量子点的X射线粉末衍射结果，其中直线段为标准JCPDS卡中CdS_0.52Se_0.48的射线衍射结果（no：49-1460）。

图6为荧光生物靶向双功能细胞检测H9N2病毒的特异性结果以及检测不同浓度的H9N2病毒的检测结果。实验组检测H9N2病毒的荧光图片（B），阴性对照检测H1N1病毒的荧光图片（E）以及空白对照的荧光图片（H），其中（A），（D），（G）分别为其对应的明场结果，（C）,（F），（I）均为对应明场和荧光场叠加结果。实验组病毒浓度为1.75×10⁴ng/mL，对照组病毒浓度为实验组的100倍。（J）为实验组和对照组统计结果的柱状图。（K）为磁球捕获H9N2病毒的透射电镜结果。（L）为荧光菌检测病毒的电镜结果，即磁球病毒荧光菌在一起的电镜结果。（M），（N），（O），（P），（Q）分别为对应病毒浓度为1.75×10⁴ng/mL，1.75×10³ng/mL，89.4 ng/mL，8.94 ng/mL，0 ng/mL的检测结果。（R）为不同浓度H9N2检测结果的统计情况。

具体实施方式

以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1 H9N2禽流感病毒的检测

下面以禽流感H9N2病毒为例，对本发明方法进行详细的说明。

一、方法

1. 荧光靶向双功能细胞的构建

一个单金黄色葡萄球菌菌落从琼脂糖平板上挑出，放入100 mL新鲜的LB培养基（酵母提取物：5 g/L，蛋白胨：10 g/L，氯化钠：5 g/L）中于37℃培养12 h。这样取1mL细菌悬液加入到99 mL新鲜的LB培养基中继续于37℃培养12 h，再向细菌悬液中加入终浓度为5 mM的亚硒酸钠，共孵育12 h获得硒化的金葡菌。硒化的金葡菌离心收集，再转入100 mL新鲜的LB培养基中，再向硒化的细菌悬液中加入终浓度为1 mM的CdCl₂共孵育12 h后，细胞内合成了荧光CdS_0.5Se_0.5量子点，即形成了发光金葡菌。合成量子点的细菌离心收集后，用pH 8.0,0.1 M的Tris-HCl缓冲液洗涤三次，重悬在相同Tris-HCl缓冲液。取OD为1.5的细菌（终体积为100 μL）于65℃水浴加热30 min，这样处理后的细菌不能再在平板上长出菌落，细胞进入不可培养的状态。将处理后的细菌与2 μL（0.59 mg/mL）鼠单克隆抗HA抗体于37℃，150 rpm摇床上孵育3 h后，离心收集菌沉淀，用同样的Tris-HCl缓冲液洗涤三次除去多余抗体，再用1% BSA于37℃条件下封闭30 min，继续用相同Tris-HCl缓冲液洗涤1次，即获得荧光靶向双功能细胞。

2. 免疫磁球的制备

取10 μL 50 mg/mL表面带羧基的超顺磁球（500 nm）用pH为7.2，0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤三次，将50 mM EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和50 mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)分别溶解在MES缓冲液（0.1 M MES，0.15 M NaCl，pH=6.5）中，再依次加入到超顺磁球中（终体积为800 μL）于37℃反应30 min活化表面的羧基。活化的磁球用pH为7.2，0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤三次。接下来将16 μL（0.59 mg/mL）单克隆抗HA的抗体加入到活化的磁球中（终体积400 μL）于37℃，150 rpm摇床上反应4 h，用pH为7.2，0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤三次出去多余的抗体，将免疫磁球保存在含有1%牛血清白蛋白和0.05%叠氮化钠的磷酸盐缓冲溶液中（终体积400 μL），于4℃保存。

3. 特异性实验及目标病毒的检测

采用禽流感H1N1、新城疫病毒、杆状病毒、猪伪狂犬病毒作为阴性对照，另外，0.01 M 磷酸盐（PBS pH 7.2)作为空白对照（其中阴性对照病毒浓度为阳性H9N2病毒浓度的100倍）。取50 μL上述已制备的免疫磁球，用0.01M PBS (pH 7.2) 洗涤三次，将阳性样品H9N2病毒，阴性对照样品H1N1病毒，新城疫病毒，杆状病毒，猪伪狂犬病毒分别都加入到免疫磁球中（终体积为100 μL），于37℃，150 rpm摇床上反应30 min，磁分选，再用同样的PBS洗涤3次，再将OD为1.5的荧光靶向双功能细胞加入到磁球病毒复合物中，继续于37℃，150 rpm摇床上反应30 min。反应复合物应0.1M pH=8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤5次，将反应复合物用荧光显微镜检测。按照上述实验步骤，检测不同浓度的H9N2病毒。

二、结果

1. 合成量子点细菌的表征

图1为整个发明过程的原理示意图，本发明从生物合成的角度出发，图2的A，B分别为实验组的明场和荧光场图片，很明显可以观察到在细菌体内出现了很强的黄色荧光，而在阴性实验中，细菌体内是没有黄色荧光（D），发光的金葡菌单分散性好，荧光强（图E）。水合粒径为800.7 nm，其多分散指数为0.082，表明了荧光菌分散性好，尺寸均一，并且属于纳米范畴。为了说明胞内发光量子点的光强分布，统计500个发光细菌，用IPP软件统计结果（F）表明其胞内荧光强度强且均一。考察荧光菌的荧光光稳定性，设计了4组独立实验，分别为刚合成量子点的细菌，合成量子点的细菌于4℃放置两个月，合成量子点的细菌于65℃水浴加热30 min后以及合成量子点的细菌于4℃放置两个月后再65℃水浴30 min，用IPP软件统计其荧光图片，其结果图3所示，表明发光细菌的荧光光稳定性很好。发光细菌的发光效率如图4所示，通过明场和荧光场叠加结果显示，其明场细菌所对应的荧光场发光的个数达到99%以上，几乎每个细菌都有荧光，其发光效率几乎100%。

2. 胞内发光量子点的表征

由于细菌细胞壁主要有磷壁酸和肽聚糖构成，细菌细胞壁相对不厚，用超声波破细胞仪即可以将细胞破碎，收集胞内的量子点，超滤纯化后，通过跑透析袋电泳收集纯化后的量子点，其透射电镜结果图5（A）显示其胞内合成的量子点单分散性很好，统计200颗量子点的粒径，其粒径分布结果显示其粒径大约2 nm左右（B），提取出来量子点的高分辨透射电镜结果（C）有明显晶格条纹，其晶面间距为0.19 nm，原位高分辨电镜结果与提取出来的一致（D），与CdS_0.52Se_0.48的（103）晶面吻合。提取出的量子点纯化后的X射线衍射（E）结果表明其衍射峰与标准卡中CdS_0.52Se_0.48主峰一致，峰宽是因为粒径较小。其元素分析结果显示物质的量之比Cd：S：Se为1:0.5:0.5，即胞内合成的量子点为CdS_0.5Se_0.5。

3. 特异性

H1N1禽流感病毒，新城疫病毒，杆状病毒，猪伪狂犬病毒，以及空白对照为其阴性对照实验来检测该方法的特异性和选择性。图6中A-I用荧光显微镜法检测1.75×10⁴ng/mL H9N2禽流感病毒和磷酸盐缓冲溶液即空白对照，H1N1禽流感病毒的明场，荧光场以及明场和荧光场叠加的结果。很明显实验组中发现磁球出现团聚的现象，且磁球周围出现了荧光菌的黄色荧光，对照组单分散性好，磁球周围也没有出现荧光菌的黄色荧光，阴阳性结果说明了病毒作为一个桥将磁球连接了磁球和病毒。柱状分布图分别统计了实验组和对照组结果，分别选取20个视野统计其荧光菌的个数，每组实验平行三次，其中对照组病毒浓度是实验组病毒浓度的100倍。电镜结果（K）很明显的展示了磁球捕获病毒的直观结果，可以看到磁球表面有多个病毒结合位点，捕获的病毒完整度高，也为该实验的可靠性提供了直接的依据。电镜结果（L）展示了生物探针检测磁球捕获的病毒，很明显的形成了免疫复合夹心物，进一步支撑了该生物探针检测病毒的特异性。为了进一步定量说明该方法检测不同浓度病毒，我们考察了不同浓度目标病毒检测下的结果。实验结果表明，随着目标病毒浓度逐渐减低，其团聚的程度和荧光探针的数目也逐渐减低（M-Q）。由于细菌的发光效率几乎达到100%，这样每一个荧光点就是一个发光细胞，于是随机统计20个视野，计算其每个视野的平均发光点数目作为该浓度条件下的实验结果。其统计结果如（R）所示，随着目标病毒浓度的减低，每个视野中发光细菌的个数也逐渐降低。

通过以上各项表征与检测，证明本发明方法可以高效地将细胞转化为发光生物探针，操作简单快速，只需向含有金葡菌的培养基中适时适量依次加入亚硒酸钠和氯化镉，就能在细胞体内合成发光量子点，从而高效地点亮细胞，此外无需进行复杂的代谢和基因工程改性细胞表面，就能将细胞构建成靶向探针，并且结合免疫磁捕获方法，可以用来检测病毒，改变与细胞孵育的抗体就能得到不同靶向探针，从而可以有效地检测不同病原体，该方法特异性好，灵敏度高，抗干扰能力强。

Claims

1.一种通过荧光靶向细胞检测病毒和细菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)向含有金葡菌的培养基中适时适量加入亚硒酸钠和氯化镉，与细胞共孵育一定时间，在细菌体内就合成了量子点，荧光菌即构建完毕，将细胞离心洗涤后，与抗病毒或细菌表面某种抗原的单克隆抗体孵育，通过离心洗涤多余抗体，即获得荧光靶向细胞，并用牛血清白蛋白进行封闭；

(2)利用EDC/NHS活化法将抗病毒或细菌的单克隆抗体偶联到表面带羧基的磁性纳米球表面，并用牛血清白蛋白对其进行封闭；将免疫磁球加入样品溶液中孵育，用磁力架吸附并洗涤，最后加入溶液重悬，得到磁球-病毒/细菌的复合物；

(3)将(1)构建的荧光靶向细胞加入到（2）得到磁球-病毒/细菌复合物中孵育，用磁力架吸附并洗涤，最后加入溶液重悬，得到磁球-病毒/细菌-荧光菌的复合物，利用荧光显微镜对磁球-病毒/细菌-荧光菌进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标病毒和细菌分别为禽流感H9N2病毒和鼠伤寒沙门氏菌。