CN108181274A - 含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法 - Google Patents
含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,包括以下步骤:S01,合成CdSe量子点的2倍浓度浓缩的酵母菌悬液;S02,绘制细菌荧光探针对水中Cu2+的荧光猝灭效应标准曲线。本发明使用细菌合成CdSe量子点测定水中和血浆中的Cu2+,测定Cu2+时,CdSe量子点本身及表面修饰物可以排除其它多种杂质的干扰,利用细胞膜本身又能够排除其它某些离子、多肽、蛋白质和固形物的干扰,通过这种双重选择性的叠加,使得本法可更准确的测定Cu2+;本法还利用CN‐特异性的与Cu2+发生配位反应,逆转其对CdSe量子点的荧光猝灭作用,利用这一特性可以提高检测Cu2+的准确度。
Description
技术领域
本发明涉及一种含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,属于环境监测技术领域。
背景技术
在环境检测和临床实践中,检测有毒的重金属一直具有重要意义。铜是多种生化反应中必要的微量元素,它在细胞呼吸、骨骼形成和结缔组织的形成中意义重大,它还是大量酶的辅助因子。缺铜容易导致贫血或再生障碍性贫血。然而,体内铜若含量过多易患湿疹、肾病等,甚至使中枢神经系统损伤和紊乱,引发肝豆状核变性病和神经退变病(如老年痴呆症)。根据美国研究理事会(National Research Council)的研究,成人每日建议摄取铜限度为1.5至3.0mg,儿童为1.5至2.5mg,婴儿为0.4至0.6mg。根据世界卫生组织的指导意见,铜被视为“饮用水中具有显著影响健康的成分”。因此,基于其重要的生理影响,需要关注每日摄取的铜含量。
鉴别和测定环境和生物体液中的铜离子(Cu2+)具有重要的意义。目前,已经出现的测定Cu2+的方法,包括DNA酶法、比色法、电化学法和荧光检测法等。近年来,荧光检测法由于检测限低,灵敏度高的优势,受到越来越多的关注。本发明提供一种含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,改法选择性高,检测灵敏度高,可操作性强,适合广泛推广应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,提供一种含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,该法使用细菌合成CdSe量子点测定水中和血浆中的Cu2+,测定Cu2+时,CdSe量子点本身及表面修饰物可以排除其它多种无机盐、脂类物质和核酸的干扰,利用细胞膜本身又能够排除其它某些离子、多肽、蛋白质和固形物的干扰,通过这种双重选择性的叠加,使得本法可更准确的测定Cu2+;另外,本法还利用CN-特异性的与Cu2+发生配位反应,逆转其对CdSe量子点的荧光猝灭作用,利用这一特性可以显著提高检测Cu2+的准确度。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:
含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,包括以下步骤:
S01,合成CdSe量子点的酵母菌悬液,即含CdSe量子点的细菌荧光探针;
S02,绘制细菌荧光探针对水中Cu2+的荧光猝灭效应标准曲线;
当1≤Cu2+浓度≤10μmol/L时,回归方程为I0/I=0.023CCu+1.0109,其线性相关系数为0.9943,检测限为1μmol/L;
当10<Cu2+浓度≤200μmol/L时,回归方程为I0/I=-4×10-5CCu 2+0.0185CCu+1.0268;其线性相关系数为0.9993,检测限为1μmol/L;
其中,CCu为水中铜离子浓度,单位为μmol/L;I0为未加入Cu2+的溶液的荧光强度;I为加入Cu2+后的荧光强度;
S03,细菌荧光探针用于水中Cu2+的测定;
S04,待测水溶液中干扰离子对酵母菌悬液的酵母细胞内的CdSe量子点荧光影响的考察:用细菌荧光探针将含有水中常见干扰离子以及已知含量的Cu2+的溶液进行荧光检测,结果除了Hg2+以外,其他干扰离子对于Cu2+浓度的测定均无明显影响;
S05,Hg2+干扰的排除方法:在待测水溶液中加入CN-,CN-与Cu2+发生络合反应,逆转Cu2+引发的荧光猝灭,若待测水溶液中含有Hg2+,Hg2+与CN-不会络合反应,Hg2+引发的荧光猝灭不会逆转,故通过测量逆转的荧光猝灭即可实现Cu2+的准确测定;
S06,绘制细菌荧光探针对血浆中Cu2+的荧光猝灭效应标准曲线;
当2≤Cu2+浓度≤60μmol/L时,回归方程为I0/I=0.0204×CCu+0.9863,其线性相关系数为0.9985,检测限为1μmol/L;
当60<Cu2+浓度≤600μmol/L时,回归方程为I0/I=-2×10-5CCu 2+0.0201CCu+1.0017,其线性相关系数为0.9968,检测限为1μmol/L;
其中,CCu为血浆中铜离子浓度,单位为μmol/L;I0为未加入Cu2+的溶液的荧光强度;I为加入Cu2+后的荧光强度;
S07,细菌荧光探针用于血浆中Cu2+的测定;
S08,CN-可恢复血浆中Cu2+导致的荧光猝灭,使血浆中Cu2+的含量测定准确。
S01中合成CdSe量子点的酵母菌悬液的获得方法为:取2倍体积的合成了CdSe量子点的原始酵母混悬液,离心去上清后,用PBS洗涤2次后,加入1倍体积的PBS混匀后制得,PBS的浓度为0.02mM,pH=7.4。
S02中标准曲线的绘制方法为:在10mL的容量瓶中加入5mL的合成CdSe量子点的酵母菌悬液,分别加入不同体积的Cu2+储备液,用蒸馏水定容,充分震荡混匀,最终Cu2+的浓度分别为0、1、2、4、6、8、10、20、30、50、100、200、300和500μM,室温避光放置,使用荧光分光光度仪依次测定它们荧光强度I,测定前需要充分震荡混匀;另准备空白试剂,测定其荧光强度I0,待测定前,需要充分混匀,并立即测定,空白试剂的配制方法为:在10mL的容量瓶中加入5mL的合成CdSe量子点的酵母菌悬液,用蒸馏水定容,充分震荡混匀即得;检测波长为565nm;仪器条件:激发波长是350nm,光谱扫描范围是300~700nm,激发狭缝宽度:5nm,发射狭缝宽度:5nm,数据采集间隔:0.1s。
S03中测定水中Cu2+浓度时,先检测待测水溶液的荧光强度,记为I0,再在待测水溶液中加入合成CdSe量子点的酵母菌悬液,再检测待测水溶液的荧光强度,记为I。
水中常见干扰离子包括Mg2+(Cl-)、Na+(Cl-)、Ca2+(Cl-)、K+(Cl-、I-(K+)、Ba2+(Cl-)、NH4 +(COO-)、Ac-(NH4 +)、Cd2+(Cl-)、Zn2+(SO4 2-)、Al3+(Cl-)、Ag+(NO3 -)、Ni+(SO4 2-)、Cu2+(Cl-)、Pb2+(NO3 -)、Hg2+(Ac-)、Fe2+(SO4 2-)和Fe3+(Cl-)。
S06中标准曲线的绘制方法为:在2mL EP管中依次加入0.75mL血浆,100μL各钟浓度的铜溶液和合成了CdSe量子点的3倍浓度浓缩的酵母菌悬液充分震荡混匀。最终Cu2+的浓度分别为0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100、200、400和600μmol/L。分别测定它们的荧光强度。
S06的检测波长为562nm。
S07中测定血浆中Cu2+浓度时,先检测待测血浆的荧光强度,记为I0,再在待测血浆中加入合成CdSe量子点的酵母菌悬液,再检测待测血浆的荧光强度,记为I。
S06中3倍浓度浓缩的酵母菌悬液的配置方法为:取3倍体积的合成了CdSe量子点的原始酵母混悬液,离心去上清后,用PBS洗涤2次后,加入1倍体积的PBS混匀后制得,PBS的浓度为0.02mM,pH=7.4。
半导体量子点(如CdSe)由于其粒径小,位于材料表面的原子数目相对较多,因而其表面状态的微小改变容易对材料产生巨大的影响,因此,基于其表面状态的改变而获得的信号,如荧光猝灭等,检测灵敏度高。另外,它还具有荧光量子点产率高、荧光强度高和荧光稳定等的优点。
本发明利用量子点或者包含量子点的系统接触重金属后的荧光强度变化来测定重金属含量,针对重金属检测的特异性来自多个方面,至少包含下面几种:
1、特定条件下合成的量子点本身,由于自身性质和修饰物的特征具有特异性;
2、构建荧光共振能量转移系统获得特异性;
3、具有独特的荧光可逆性;
本发明利用酵母菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌这三种不同的菌合成CdSe量子点的研究过程中,偶然发现Cu2+使得量子点发生了猝灭。此种猝灭现象使得细菌细胞合成的量子点具备了测定相应离子的潜力,同时由于量子点位于细胞内,完全有可能保证测定的选择性。这种选择性既来自微生物合成的量子点本身的特性(蛋白质包壳),又来自于细胞膜的选择透过性。活细胞的细胞膜具有重要的生理功能,它能够维持胞内环境的稳定,其最重要的特性是半透性,或称选择透过性,即对进出入细胞的物质有很强的选择透过性。只有通过耗时和耗能的主动运输、胞饮作用、吞噬作用或胞吐作用(而实践中我们可以通过快速测定避免这些干扰),物质进入细胞内只能经过细胞膜的易化扩散和被动运输。细胞膜和其它生物膜都是选择透过性膜,这种膜能够让水分子、气体分子(如O2、CO2、N2)等自由通过,某些离子、小的不带电的极性分子(如尿素、乙醇)和脂溶性小分子也允许通过,而其它的离子和小分子不可以通过,分子量超过一定阈值的大分子无法通过。生物膜的这一特性,与细胞膜的生命活动动密切相关,是活细胞的一个重要特征。本实验中,细胞内合成的量子点受到细胞膜的保护,有效的阻挡了大量未知的干扰量子点荧光和物化特性的物质,使得它们排除干扰,增加探针的选择性。
水中一般杂质少,特别是澄清的地表水仅有少量无机盐(钙(Ca2+)、镁(Mg2+)、钠(Na+)、钾(K+)、碳酸根(CO3 2-)、碳酸氢根(HCO3-)、硫酸根(SO4 2-)和氯离子(Cl-))、小分子有机物和泥沙等固形物。
血浆中物质复杂,但是对于健康人而言,血浆中主要含有:
1.水、氨基酸、微量元素、核酸衍生物、离子、维生素、脂类物质和蛋白酶等,是细胞生长必须的物质。
2.极少量的激素和各种生长因子。
3.胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(睾酮、孕酮)等。
4.可能干扰重金属测定的结合蛋白:结合蛋白可以携带重要的低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁。
我们尝试使用细菌合成CdSe量子点测定水中和血浆中的Cu2+。测定Cu2+时,CdSe量子点本身及表面修饰物可以排除其它多种无机盐、脂类物质和核酸的干扰,利用细胞膜本身又能够排除其它某些离子、多肽、蛋白质和固形物的干扰。通过这种双重选择性的叠加,使得更准确的测定Cu2+成为可能。为此我们定量测定了Cu2+对量子点的荧光猝灭效应,绘制了标准曲线。考察了共存离子对Cu2+测定的影响。考察了氰化钠中的氰根(CN-)可以特异性的与Cu2+发生配位反应,逆转其对CdSe量子点的荧光猝灭作用,利用这一特性可以提高检测Cu2+的准确度。利用合成的CdSe荧光量子点,我们测定了血浆中的Cu2+含量,采用标准添加法,绘制了标准曲线。
附图说明
图1为含CdSe量子点的细菌荧光探针用于水中Cu2+的测定;
图2为细菌荧光探针对水中Cu2+的荧光猝灭效应标准曲线;
图3为共存离子对酵母细胞内量子点荧光强度的影响图一;
图4为共存离子对酵母细胞内量子点荧光强度的影响图二;
图5为水中Hg2+干扰的排除方法图;
图6为含CdSe量子点的细菌荧光探针用于血浆中Cu2+的测定;
图7为细菌荧光探针对血浆中Cu2+的荧光猝灭效应标准曲线;
图8为血浆中Hg2+干扰的排除方法图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
一、操作的典型步骤
1.标准添加法,绘制Cu2+导致量子点荧光猝灭的标准曲线。在10mL的容量瓶中加入5mL的合成了CdSe量子点的酵母菌悬液(2倍浓度浓缩的菌悬浊液,即取100mL合成了CdSe量子点的原始酵母混悬液,离心去上清后,用PBS(0.02mM,pH=7.4)洗涤2次后,加入50mL PBS混匀后制得),分别加入不同体积的Cu2+储备液,用蒸馏水定容。充分震荡混匀,室温避光放置,使用荧光分光光度仪(RF-5301,Shimadzu;Ex=350nm)测定它们荧光强度(Intensityof fluorescence,I)的改变。注意,测定前需要充分震荡混匀。另准备空白试剂,测定其荧光强度(I0)。待测定前,需要充分混匀,并立即测定。仪器条件:激发波长是350nm,光谱扫描范围是300~700nm,激发狭缝宽度(EX Slit Width):5nm,发射狭缝宽度(EM Slit Width):5nm,数据采集间隔(Response Time):0.1s。
二、Cu2+对量子点的荧光猝灭效应及标准曲线的绘制
1.我们采用标准加入法,研究Cu2+对量子点的荧光猝灭效应,并依据相关方程绘制相应的标准曲线。在10mL容量瓶中依次加入5mL合成了CdSe量子点的酵母菌悬液(两倍浓度),适当量的铜标准储备液,用水定容,充分震荡混匀。最终Cu2+的浓度分别为0、1、2、4、6、8、10、20、30、50、100、200、300和500μM。测定各自的荧光强度,空白的荧光强度为I0,其它的荧光强度为I;荧光图谱见图1,绘制标准曲线如图2所示。
如图1所示,酵母菌合成的量子点探针用于水中Cu2+的测定。从上到下分别是CCu 2+=0、1、2、4、6、8、10、20、30、50、100、200、300和500μM。
加入Cu2+后,量子点峰值的荧光强度将明显降低,这表明Cu2+能够穿透酵母菌细胞膜,进入细胞猝灭酵母菌细胞中的CdSe量子点。利用这种峰值荧光猝灭和铜含量之间的关系,我们建立了测定Cu2+含量的工作曲线及相关拟合方程式。值得一提的是,荧光发射体(即含CdSe量子点的细菌荧光探针)与猝灭剂(即Cu2+)的相互作用,引起的荧光猝灭作用一般可以使用Stern-Volmer方程描述:
I0/I=1+KSV*[C]
I0和I分别为加入猝灭剂前后体系的荧光强度。KSV为Stern-Volmer猝灭系数,与荧光猝灭的效率有关,C为相应的猝灭剂即Cu2+离子浓度。即I0/I与铜离子浓度[C]一般符合线性关系,因此我们依据量子点荧光峰值(565nm)获得I0、I和相应的[C],绘制I0/I~[C]散点图,根据实际情况拟合I0/I~[C]的关系。
如图2a所示,当1≤Cu2+浓度≤10μmol/L时,回归方程为I0/I=0.023CCu+1.0109,其线性相关系数为0.9943,检测限为1μmol/L;
如图2b所示,当10<Cu2+浓度≤200μmol/L时,回归方程为I0/I=-4×10-5CCu 2+0.0185CCu+1.0268;其中-4E-5代表-4×10-5;
其中,CCu为水中铜离子浓度,单位为μmol/L;I0为未加入Cu2+的溶液的荧光强度;I为加入Cu2+后的荧光强度;
即Cu2+浓度在1~10μmol/L时,是用这个线性方程I0/I=0.023CCu+1.0109,在浓度比较小的时候它的线性良好,荧光发射峰值与铜离子浓度是符合Stern-Volmer方程,但当Cu2+高浓度时,呈现荧光猝灭饱和趋势,不完全符合Stern-Volmer方程,荧光发射峰值与铜离子浓度呈现二项式相关,即I0/I=-4×10-5CCu 2+0.0185CCu+1.0268。
三、其他离子对酵母菌细胞内CdSe量子点荧光的影响
由于许多常见阴阳离子可能干扰Cu2+的测定,因此有必要考察水中常见的元素离子对于酵母细胞内CdSe量子点荧光强度的影响。实验中为了放大这种影响,结合实际情况将Mg2+(Cl-)、Na+(Cl-)、Ca2+(Cl-)和K+(Cl-)浓度设置为1mol/L,I-(K+)、Ba2+(Cl-)、NH4 +(COO-)、Ac-(NH4 +)、Cd2+(Cl-)和Zn2+(SO4 2-)浓度设置为50mM,上述离子浓度已经高于一般水,甚至是一般海水中的相关离子浓度,结果如图3所述。另外,Al3+(Cl-),Ag+(NO3 -)、Ni+(SO4 2-)、Cu2+(Cl-)、Pb2+(NO3 -)、Hg2+(Ac-)、Fe2+(SO4 2-)和Fe3+(Cl-)的浓度设置为10mM,所测结果如图4所示。
如图3所示,b为共存离子对酵母细胞内量子点荧光强度的影响;a为在紫外暗箱灯下的观察结果;从左到右分别是I-(K+)、Ba2+(Cl-)、NH4 +(COO-)、Ac-(NH4 +)、Cd2+(Cl-)、Zn2+(SO4 2-)、Control(空白)、Mg2+(Cl-)、Na+(Cl-)、Ca2+(Cl-)和K+(Cl-)。
如图4所示,b为共存离子对酵母细胞内量子点荧光强度的影响;a为在紫外暗箱灯下的观察结果;从左到右分别是Al3+(Cl-),Ag+(NO3 -)、Ni+(SO4 2-)、Cu2+(Cl-)、对照、Pb2+(NO3 -)、Hg2+(Ac-)、Fe2+(SO4 2-)和Fe3+(Cl-)。
由此可见,这些离子的浓度为Cu2+的1000倍以上,除了Hg2+以外,对于Cu2+浓度的测定均无明显影响。因此,这些离子并不会对量子点的测定产生干扰作用。上述结果并不奇怪,在合成CdSe量子点的过程中,酵母细胞一直在YPD培养基中培养,无论是培养基中还是酵母细胞中都含有大量的无机盐,在这个环境下合成的量子点对于无机盐具有一定的耐受力。
四、CN-逆转的Cu2+引发的荧光猝灭
上述实验结果表明,除了Hg2+以外,常见离子均不会影响酵母合成的CdSe量子点对Cu2+的测定。对于Hg2+对测定的干扰,有必要采取一定方法排除。另外,由于水来源不同,水质千差万别,水中仍然可能存在猝灭CdSe量子点的物质,为了进一步排除非Cu2+物质导致荧光猝灭产生的干扰,我们设计通过加入CN-,特异性的与Cu2+发生络合反应,逆转后者引发的荧光猝灭,可以实现Cu2+的准确测定。在10mL容量瓶中依次加入5mL合成了CdSe量子点的酵母菌悬液(两倍浓度),适当量的铜标准储备液,用水定容,充分震荡混匀。最终Cu2+的浓度为0和20μM。取出1.5mL测定各自的荧光强度,然后每个样品中再加入100μL NaCN(1mmol/L)溶液,混匀后静置2min,再混匀后测定荧光强度,参加图5。
如图5所示,20μmol/L的Cu2+和Hg2+导致酵母荧光探针的荧光猝灭,和加入CN-导致的荧光恢复。内插图为相应的紫外暗箱灯下观察的结果。其中:(1)对照组:酵母荧光探针,(2)向酵母荧光探针中加入了100μL NaCN(1mmol/L);(3)酵母荧光探针中加入了20μmol/L的Cu2+水样;(4)酵母荧光探针中加入了20μmol/L的Cu2+水样后,再加入100μL NaCN(1mmol/L);(5)酵母荧光探针中加入100μL的水;(6)酵母荧光探针中加入了20μmol/L的Hg2+水样;(7)酵母荧光探针中加入了20μmol/L的Hg2+水样后,再加入100μL NaCN(1mmol/L)。
通过NaCN的添加实验,我们发现:
(1).单纯NaCN的添加对对照组CdSe量子点的荧光没有影响,但是会稀释量子点,导致荧光强度降低,该降低程度与添加纯净水样品一致;
(2).CN-能够逆转Cu2+导致的荧光猝灭,最终荧光强度与单独添加CN-后的样品组一致;
(3).CN-不能逆转Hg2+导致的荧光猝灭。
总之,利用CN-逆转Cu2+导致的荧光猝灭,可以排除Hg2+和其他潜在的不可逆猝灭量子点的物质引发的干扰,保证了Cu2+测定的选择性。
五、使用酵母合成CdSe荧光量子点测定血浆中的Cu2+含量
1.标准曲线的绘制:在2mL EP管中依次加入0.75mL血浆,100μL各钟浓度的铜溶液和合成了CdSe量子点的3倍浓度浓缩的酵母菌悬液充分震荡混匀。最终Cu2+的浓度分别为0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100、200、400和600μmol/L。分别测定它们的荧光强度,检测波长为562nm,测定血浆中Cu2+浓度时,先检测待测血浆的荧光强度,记为I0,再在待测血浆中加入合成CdSe量子点的酵母菌悬液,再检测待测血浆的荧光强度,记为I;荧光图谱见图6,绘制标准曲线如图7所示。
当2≤Cu2+浓度≤60μmol/L时,回归方程为I0/I=0.0204×CCu+0.9863,其线性相关系数为0.9985,检测限为1μmol/L;
当60<Cu2+浓度≤600μmol/L时,回归方程为I0/I=-2×10-5CCu 2+0.0201CCu+1.0017,其线性相关系数为0.9968,检测限为1μmol/L;
其中,CCu为血浆中铜离子浓度,单位为μmol/L;I0为未加入Cu2+的溶液的荧光强度;I为加入Cu2+后的荧光强度;
为了准确的测定血浆中的Cu2+含量,本发明准备了以下样品:
样品1、对照:向2mL EP管中依次加入0.75mL合成了CdSe量子点的酵母菌悬液(两倍浓度)和0.75mL的PBS,混匀后测定荧光。
样品2、加入血浆:向2mL EP中依次加入0.75mL合成了CdSe量子点的酵母菌悬液(两倍浓度)和0.75mL的血浆,混匀后测定荧光。
样品3、加入添加了30μmol/L Cu2+的血浆:向2mL EP中依次加入0.75mL合成了CdSe量子点的酵母菌悬液(两倍浓度)和0.75mL的添加了30μmol/L Cu2+的血浆,混匀后测定荧光。
样品4、5和6:向上述样品1、2和3中再加入100μL的NaCN(1mmol/L)获得相应的样品。
样品7:向上述样品1中再加入100μL的纯净水。
检测结果如图8所示,血浆中的微量铜会猝灭量子点,具体见荧光光谱图和紫外暗箱灯下观察结果;酵母荧光探针分别在下述介质中(1)PBS;(2)纯血浆;(3)血浆中添加30μmol/L的Cu2+;(4)PBS中加100μL NaCN(1mmol/L);(5)血浆中加100μL NaCN(1mmol/L);(6)血浆中添加30μmol/L的Cu2+和100μL NaCN(1mmol/L);(7)PBS中添加100μL的水。
由图8可知:
(1)、样品2中的血浆会猝灭量子点,利用Origin Graph软件自动拟合的线性方程I0/I=0.0204×CCu+0.9863计算,样品2的血浆中Cu2+含量为11.6μmol/L。
(2)、样品3中在血浆中添加30μmol/L的Cu2+使得荧光猝灭更加剧烈,表明引发荧光猝灭的可能是血浆中的Cu2+成分。
(3)、样品5和6与样品2和3相比,荧光有所恢复,而且恢复程度相当,并且与样品4和7的荧光强度相当。这表明CN-可以逆转Cu2+在血浆中引起的荧光猝灭,也可以逆转血浆中内源性Cu2+引发的荧光猝灭。从结果上看,逆转后的荧光强度与直接添加等量的蒸馏水组荧光强度相当。根据国家卫生和计划生育委员会编制的《临床常用生化检验项目参考区间(第1部分)》,正常人血铜浓度范围为11.0‐22.0μmol/L,与本实验结果一致。
综上所述:本发明建立了含CdSe量子点的酵母荧光探针测定水中Cu2+离子浓度的方法。在1~10μmol/L的范围内,探针的荧光发射峰值与铜离子浓度呈良好的线性关系,回归方程为I0/I=0.023CCu+1.0109,其线性相关系数为0.9943,检测限为1μmol/L。
在杂质离子的浓度高达1mol/L时,Mg2+(Cl-)、Na+(Cl-)、Ca2+(Cl-)和K+(Cl-)以及50mM的I-(K+)、Ba2+(Cl-)、NH4 +(COO-)、Ac-(NH4 +)、Cd2+(Cl-)和Zn2+(SO4 2-)10mM的Al3+(Cl-),Ag+(NO3 -)、Ni+(SO4 2-)、Pb2+(NO3 -)、Fe2+(SO4 2-)和Fe3+(Cl-)都不会引发量子点的荧光猝灭。实验表明,利用CN-逆转Cu2+导致的荧光猝灭,可以排除Hg2+和其他潜在的不可逆猝灭量子点的物质引发的干扰,保证了Cu2+测定的选择性。
血浆中的铜离子含量为11.6μmol/L。同时,氰化钠可以恢复血浆中铜离子导致的荧光猝灭。进一步,本发明建立了含CdSe量子点的酵母荧光探针测定血浆中Cu2+离子浓度的方法。利用标准添加法可以绘制标准曲线,当Cu2+离子浓度在2~60μmol/L时,I0/I(562nm)值与铜离子浓度线性良好,回归方程为I0/I=0.0204×CCu+0.9863,其线性相关系数为0.9985,检测限为1μmol/L。在60-600μmol/L范围内,I0/I(562nm)值与铜离子浓度二项式拟合很好。荧光发射峰值与铜离子浓度呈良好的线性关系,回归方程为I0/I=-2×10-5 CCu 2+0.0201CCu+1.0017,其线性相关系数为0.9985,检测限为1μmol/L。
根据国家卫生和计划生育委员会编制的《临床常用生化检验项目参考区间(第1部分)》,正常人血铜浓度范围为11.0-22.0μmol/L。本实验方法的线性范围可以覆盖正常人的血铜浓度范围,在临床检验中具有快速、简便和稳定可靠的优势,准确度也能够适应测定的具体需要。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
S01,合成CdSe量子点的酵母菌悬液,即含CdSe量子点的细菌荧光探针;
S02,绘制细菌荧光探针对水中Cu2+的荧光猝灭效应标准曲线;
当1≤Cu2+浓度≤10μmol/L时,回归方程为I0/I=0.023CCu+1.0109,其线性相关系数为0.9943,检测限为1μmol/L;
当10<Cu2+浓度≤200μmol/L时,回归方程为I0/I=‐4×10-5CCu 2+0.0185CCu+1.0268;
其中,CCu为水中铜离子浓度,单位为μmol/L;I0为未加入Cu2+的溶液的荧光强度;I为加入Cu2+后的荧光强度;
S03,细菌荧光探针用于水中Cu2+的测定;
S04,待测水溶液中干扰离子对酵母菌悬液的酵母细胞内的CdSe量子点荧光影响的考察:用细菌荧光探针将含有水中常见干扰离子以及已知含量的Cu2+的溶液进行荧光检测,结果除了Hg2+以外,其他干扰离子对于Cu2+浓度的测定均无明显影响;
S05,Hg2+干扰的排除方法:在待测水溶液中加入CN‐,CN‐与Cu2+发生络合反应,逆转Cu2+引发的荧光猝灭,若待测水溶液中含有Hg2+,Hg2+与CN‐不会络合反应,Hg2+引发的荧光猝灭不会逆转,故通过测量逆转的荧光猝灭即可实现Cu2+的准确测定;
S06,绘制细菌荧光探针对血浆中Cu2+的荧光猝灭效应标准曲线;
当2≤Cu2+浓度≤60μmol/L时,回归方程为I0/I=0.0204×CCu+0.9863,其线性相关系数为0.9985,检测限为1μmol/L;
当60<Cu2+浓度≤600μmol/L时,回归方程为I0/I=‐2×10-5CCu 2+0.0201CCu+1.0017,其线性相关系数为0.9968,检测限为1μmol/L;
其中,CCu为血浆中铜离子浓度,单位为μmol/L;I0为未加入Cu2+的溶液的荧光强度;I为加入Cu2+后的荧光强度;
S07,细菌荧光探针用于血浆中Cu2+的测定;
S08,CN‐可恢复血浆中Cu2+导致的荧光猝灭,使血浆中Cu2+的含量测定准确。
2.根据权利要求1所述的含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,其特征在于:S01中合成CdSe量子点的酵母菌悬液的获得方法为:取2倍体积的合成了CdSe量子点的原始酵母混悬液,离心去上清后,用PBS洗涤2次后,加入1倍体积的PBS混匀后制得,PBS的浓度为0.02mM,pH=7.4。
3.根据权利要求1所述的含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,其特征在于:S02中标准曲线的绘制方法为:在10mL的容量瓶中加入5mL的合成CdSe量子点的酵母菌悬液,分别加入不同体积的Cu2+储备液,用蒸馏水定容,充分震荡混匀,最终Cu2+的浓度分别为0、1、2、4、6、8、10、20、30、50、100、200、300和500μM,室温避光放置,使用荧光分光光度仪依次测定它们荧光强度I,测定前需要充分震荡混匀;另准备空白试剂,测定其荧光强度I0,待测定前,需要充分混匀,并立即测定,空白试剂的配制方法为:在10mL的容量瓶中加入5mL的合成CdSe量子点的酵母菌悬液,用蒸馏水定容,充分震荡混匀即得;检测波长为565nm;仪器条件:激发波长是350nm,光谱扫描范围是300~700nm,激发狭缝宽度:5nm,发射狭缝宽度:5nm,数据采集间隔:0.1s。
4.根据权利要求1所述的含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,其特征在于:S03中测定水中Cu2+浓度时,先检测待测水溶液的荧光强度,记为I0,再在待测水溶液中加入合成CdSe量子点的酵母菌悬液,再检测待测水溶液的荧光强度,记为I。
5.根据权利要求1所述的含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,其特征在于:水中常见干扰离子包括Mg2+(Cl-)、Na+(Cl-)、Ca2+(Cl-)、K+(Cl-)、I-(K+)、Ba2+(Cl-)、NH4 +(COO-)、Ac-(NH4 +)、Cd2+(Cl-)、Zn2+(SO4 2-)、Al3+(Cl-)、Ag+(NO3 -)、Ni+(SO4 2-)、Cu2+(Cl-)、Pb2+(NO3 -)、Hg2+(Ac-)、Fe2+(SO4 2-)和Fe3+(Cl-)。
6.根据权利要求1所述的含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,其特征在于:S06中标准曲线的绘制方法为:在2mLEP管中依次加入0.75mL血浆,100μL各钟浓度的铜溶液和合成了CdSe量子点的3倍浓度浓缩的酵母菌悬液充分震荡混匀。最终Cu2+的浓度分别为0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100、200、400和600μmol/L。分别测定它们的荧光强度。
7.根据权利要求1所述的含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,其特征在于:S06的检测波长为562nm。
8.根据权利要求1所述的含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,其特征在于:S07中测定血浆中Cu2+浓度时,先检测待测血浆的荧光强度,记为I0,再在待测血浆中加入合成CdSe量子点的酵母菌悬液,再检测待测血浆的荧光强度,记为I。
9.根据权利要求6所述的含CdSe量子点的细菌荧光探针对水和血浆中铜离子的高选择性检测方法,其特征在于:S06中3倍浓度浓缩的酵母菌悬液的配置方法为:取3倍体积的合成了CdSe量子点的原始酵母混悬液,离心去上清后,用PBS洗涤2次后,加入1倍体积的PBS混匀后制得,PBS的浓度为0.02mM,pH=7.4。
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