CN104031941A - 一种硒化镉量子点的生物合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硒化镉量子点的生物合成方法，所述方法为：以亚硒酸盐为Se源，以水溶性镉盐为Cd源，以巯基化合物为稳定剂，以大肠杆菌或酵母菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，在二水合柠檬酸三钠的作用下，于大肠杆菌发酵培养基或酵母菌发酵培养基中，37℃培养1～6天，离心，弃去上清，收集沉淀，获得硒化镉量子点；本发明合成了尺寸可调且均一的、生物相容性好的、高发光CdSe量子点，并能够应用于酵母菌的染色，该量子点表现出尺寸相关的发光性质，量子点的直径大约在5nm左右，在高分辨透射电镜下显示出良好的单晶结构，量子产率达到了35％。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种量子点的合成方法，特别涉及一种硒化镉量子点的生物合成方法。
(二)背景技术
纳米技术是当前国际领域的热点研究课题，近几十年来，已经被应用于从疾病诊断到基因修复和靶向药物治疗等诸多研究方向，而其中最受关注的就是将量子点用于生物标记和染色等。
量子点的合成方法很多，目前为止，应用比较广泛的就是金属有机法(参见：Qu L,Peng Z A,等，纳米快报，1卷，2001，333(2001))。和水相合成方法(参见：Su Y,He Y,等，生物材料，30卷，19(2009))。一般来说，化学合成的量子点存在一定的生物毒性，必须在其表面上修饰上生物分子，使其具有生物相容性才能应用于生物标记。近年来，已经有很多量子点采用生物方法合成，但是这些量子点大部分是在细胞内合成，收集所制备的量子点比较麻烦，需要通过细胞洗涤、细胞破坏和细胞碎片去除等过程，因此限制了量子点的后续的应用。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种高量子产率的，高发光性的硒化镉量子点的生物合成方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种硒化镉量子点的生物合成方法，所述方法为：以亚硒酸盐为Se源，以水溶性镉盐为Cd源，以巯基化合物为稳定剂，以大肠杆菌(优选大肠杆菌(E.coli K12(DH10B))或酵母菌(优选酵母菌(Saccharomyces cerevisiae(S288C))经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，在二水合柠檬酸三钠的作用下，于大肠杆菌发酵培养基或酵母菌发酵培养基中，37℃培养1～6天，离心，弃去上清，收集沉淀，获得硒化镉量子点；所述Se源用量以Se物质的量计，所述Cd源用量以Cd物质的量计，所述Se与Cd物质的量之比为1:10.7～32；所述稳定剂的加入量以Se物质的量计为2.7～25g/mol，所述二水合柠檬酸三钠的加入量以Se物质的量计为20～100g/mol，所述催化剂的加入量以湿菌体质量计，所述湿菌体质量以Se物质的量计0.1～3g/mmol。
进一步，所述大肠杆菌发酵培养基为M9培养基，所述酵母菌发酵培养基为察氏培养基；所述M9培养基终浓度组成：磷酸氢二钠15g/L，磷酸二氢钾7.5g/L，氯化铵2.5g/L，氯化钠1.25g/L，七水合硫酸镁0.002mol/L，葡萄糖溶液2g/L，溶剂为水，pH自然；所述察氏培养基终浓度组成：蔗糖30g/L，硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钾0.5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，pH值7.0，溶剂为水。
进一步，所述亚硒酸盐以0.01mol/L亚硒酸盐水溶液的形式加入，所述亚硒酸盐为Na2SeO3或K2SeO3。
进一步，所述水溶性镉盐以0.04mol/L水溶性镉盐水溶液的形式加入，所述水溶性镉盐为CdCl2、Cd(NO3)2或CdSO4。
进一步，所述巯基化合物为硫代苹果酸(MSA)、谷胱甘肽(GSH)、L-半胱氨酸(L-cys)、巯基乙酸或巯基丙酸，优选MSA、GSH或L-cys。
进一步，所述Se与Cd物质的量之比为1:10.7～21。
进一步，所述稳定剂的加入量以Se物质的量计为21～25g/mol，所述二水合柠檬酸三钠的加入量以Se物质的量计为60～80g/mol，所述催化剂的加入量以湿菌体质量计，所述湿菌体质量以Se物质的量计0.1～3g/mmol。
进一步，所述合成方法先将催化剂接种至大肠杆菌发酵培养基或酵母菌发酵培养基中，再加入Se源、Cd源、稳定剂、二水合柠檬酸三钠进行生物合成反应；所述大肠杆菌发酵培养基为M9培养基，所述酵母菌发酵培养基为察氏培养基，具体优选为：先将大肠杆菌经LB培养基种子培养后的湿菌体接种至M9培养基或将酵母菌经YPD种子培养基培养后的湿菌体接种至察氏培养基中，37℃培养至OD600＝0.6，过滤，去沉淀获得大肠杆菌湿菌体或酵母菌湿菌体；然后将大肠杆菌湿菌体接种至M9培养基或将酵母菌湿菌体接种至察氏培养基，在磁力搅拌下，加入Se源、Cd源、稳定剂、二水合柠檬酸三钠进行生物合成反应，制成硒化镉量子点。
进一步，所述催化剂按如下方法之一制备：(1)将大肠杆菌接种至LB培养基，37℃培养至OD600＝0.6，得到种子液，离心，去除上层清液，沉淀接种至M9培养基，37℃培养至OD600＝0.6，离心，弃上清，得到大肠杆菌湿菌体；所述LB培养基终浓度组成为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0，溶剂为水；所述M9培养基终浓度组成：磷酸氢二钠15g/L，磷酸二氢钾7.5g/L，氯化铵2.5g/L，氯化钠1.25g/L，七水合硫酸镁0.002mol/L，葡萄糖溶液2g/L，pH自然，溶剂为水；(2)将酵母菌接种至YPD培养基，37℃培养至OD600＝0.6，得到种子液，离心，去除上层清液，沉淀接种到察氏培养基，37℃培养至OD600＝0.6，离心，弃上清，得到酵母菌湿菌体；所述YPD培养基终浓度组成：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH值7.0，溶剂为水；所述察氏培养基终浓度组成：蔗糖30g/L，硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钾0.5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，pH值7.0，溶剂为水。
进一步，所述硒化镉量子点的生物合成方法按如下步骤进行：将大肠杆菌经种子培养获得的湿菌体接种至M9培养基或将酵母菌经种子培养获得的湿菌体接种至察氏培养基，在磁力搅拌下，加入Se源、Cd源、巯基化合物和二水合柠檬酸三钠，37℃培养4～6天，离心，取沉淀，获得CdSe量子点；所述巯基化合物为硫代苹果酸、谷胱甘肽或L-半胱氨酸；所述Se与Cd物质的量之比为1:10.7～21；所述巯基化合物的加入量以Se物质的量计为21～25g/mol，所述二水合柠檬酸三钠的加入量以Se物质的量计为60～80g/mol，所述催化剂的加入量以湿菌体质量计，所述湿菌体质量以Se物质的量计0.1～3g/mmol。
本发明的有益结果主要体现在：本发明在大肠杆菌或酵母菌作用下合成了尺寸可调且均一的、生物相容性好的、高发光CdSe量子点，并能够应用于酵母菌的染色，该量子点表现出尺寸相关的发光性质，量子点的直径大约在5nm左右，在高分辨透射电镜下显示出良好的单晶结构，量子产率达到了35％；本发明方法合成的量子点具有天然的生物相容性，而且反应条件温和、操作方便，成本低廉，属于“绿色”合成化学。
(四)附图说明
图1为实施例1制备的CdSe量子点的荧光发射光谱图和紫外吸收光谱图，A为以MSA为稳定剂制备的CdSe量子点的荧光发射光谱图，B为以MSA为稳定剂制备的CdSe量子点的紫外吸收光谱图，C为以GSH为稳定剂制备的CdSe量子点的荧光发射光谱图，D为以GSH为稳定剂制备的CdSe量子点的紫外吸收光谱图，E为以L-cys为稳定剂制备的CdSe量子点的荧光发射光谱图，F为以L-cys为稳定剂制备的CdSe量子点的紫外吸收光谱图。
图2为实施例2制备的CdSe量子点的荧光发射光谱图和紫外吸收光谱图，a为以MSA为稳定剂制备的CdSe量子点的荧光发射光谱图，b为以MSA为稳定剂制备的CdSe量子点的紫外吸收光谱图，c为以GSH为稳定剂制备的CdSe量子点的荧光发射光谱图，d为以GSH为稳定剂制备的CdSe量子点的紫外吸收光谱图，e为以L-cys为稳定剂制备的CdSe量子点的荧光发射光谱图，f为以L-cys为稳定剂制备的CdSe量子点的紫外吸收光谱图。
图3为实施例3制备的CdSe量子点的荧光显微镜成像，A为大肠杆菌作为催化剂制备的CdSe量子点的荧光显微镜成像，B为和酵母菌作为催化剂制备的CdSe量子点的荧光显微镜成像。
图4为实施例3制备的CdSe量子点的高分辨透射电镜成像。
图5为实施例3制备的CdSe量子点的红外成像。
图6为实施例3制备的CdSe量子点的激光扫描共聚焦显微镜成像，A为荧光成像，B为明场成像，C为叠加成像。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
将大肠杆菌(E.coli K12(DH10B)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供)接种至LB培养基，37℃培养至OD600＝0.6，得到种子液，将其离心分离，去除上层清液，获得大肠杆菌湿菌体。取1ml大肠杆菌湿菌体接种至M9培养基，37℃培养至OD600＝0.6，得到第二代大肠杆菌湿菌体，用于量子点的制备。
LB培养基(500ml)：酵母膏2.5g，蛋白胨5g，氯化钠5g，用NaOH调pH至7.0左右，溶剂为水。
M9培养基(500ml)：磷酸氢二钠15g，磷酸二氢钾7.5g，氯化铵2.5g，氯化钠1.25g，1ml(1mol/L)七水合硫酸镁水溶液，葡萄糖2g/L，pH自然，溶剂为水。
取0.015g第二代大肠杆菌湿菌体移入一单颈烧瓶中，加入到45ml的M9培养基中，随后在不断磁力搅拌下加入4ml0.04mol·l-1CdCl2水溶液，400mg二水合柠檬酸三钠，40mg MSA，1.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3水溶液，在37℃下培养5天，然后通过离心分离收集得到蛋白质包裹的CdSe量子点，所获得CdSe量子点的荧光发射光谱和紫外吸收光谱谱图见图1中A、B所示。
同样条件下，将40mg MSA，1.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3水溶液改为122.805mg GSH，0.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3溶液，所获得荧光发射光谱和紫外吸收光谱谱图见图1中C、D所示。
同样条件下，将40mg MSA，1.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3水溶液改为96.83mg L-cys，0.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3溶液，所获得荧光发射光谱和紫外吸收光谱谱图见图1中E、F所示。
在大肠杆菌体系中，从三种不同稳定剂包裹的CdSe量子点的荧光发射光谱可以看出，在相同的反应时间下，三种稳定剂合成的CdSe量子点荧光发射峰对应的波长不同，荧光强度不同，而MSA为稳定剂包裹的CdSe量子点的荧光发射峰对应的波长最长，荧光强度也最强，说明培养相同的时间，以MSA为稳定剂合成的CdSe量子点的粒径较大，所得产物浓度高。
从三种不同稳定剂包裹的CdSe量子点的紫外吸收光谱可以看出，随着培养时间的延长，紫外吸收峰位置发生红移，而GSH包裹的CdSe量子点的红移较明显，表明随着时间延长，该稳定剂包裹的量子点的粒径增长比较快，由此可见，随着培养时间的延长，量子点的粒径在逐渐增加，而以GSH为稳定剂时，培养相同的时间，量子点粒径增长最快。
参照实施例3实验方法得出结论，三种不同稳定剂包裹的CdSe量子点的粒径大约在5nm左右，具有良好的单分散性，呈现出近似球形的结构，量子产率在35％左右。
实施例2：
将酵母菌(Saccharomyces cerevisiae(S288C)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供)接种至YPD培养基，37℃培养至OD600＝0.6，得到种子液，将其离心分离，去除上层清液，获得酵母菌湿菌体，取1ml酵母菌湿菌体接种到察氏培养基，37℃继续培养至OD600＝0.6，得到第二代酵母菌湿菌体，用于量子点的制备。
YPD培养基(500ml)：酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，用NaOH调pH至7.0左右，溶剂为水；
察氏培养基(500ml)：蔗糖15g，硝酸钠1g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钾0.25g，七水合硫酸镁0.25g，用NaOH调pH至7.0左右，溶剂为水。
取0.015g第二代酵母菌湿菌体，移入一单颈烧瓶中，加入到45ml的察氏培养基(组成同上)中，随后在磁力搅拌下加入4ml0.04mol·l-1CdCl2水溶液，400mg二水合柠檬酸三钠，100mg MSA，0.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3水溶液，其中在37℃下培养5天，然后通过离心分离收集得到的蛋白质包裹的CdSe量子点。所获得CdSe量子点荧光发射光谱和紫外吸收光谱谱图见图2中a、b所示。
同样条件下，将100mg MSA，0.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3水溶液，改为122.805mg GSH，0.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3溶液，得到的蛋白质包裹的CdSe量子点，荧光发射光谱和紫外吸收光谱谱图见图2中c、d所示。
同样条件下，将100mg MSA，0.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3水溶液，改为96.83mg L-cys，0.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3溶液，得到的蛋白质包裹的CdSe量子点，荧光发射光谱和紫外吸收光谱谱图见图2中e、f所示。
在酵母菌体系中，从三种不同稳定剂包裹的CdSe量子点的荧光发射光谱可以看出，培养相同时间，三种稳定剂合成的CdSe量子点荧光发射峰对应的波长不同，荧光强度不同，而MSA为稳定剂包裹的CdSe量子点的荧光发射峰对应的波长最长，荧光强度也最强，说明培养相同的时间，以MSA为稳定剂合成的CdSe量子点的粒径较大，所得产物浓度高。
从三种不同稳定剂包裹的CdSe量子点的紫外吸收光谱可以看出，随着培养时间的延长，紫外吸收峰位置发生红移，而GSH包裹的CdSe量子点的红移较明显，表明随着时间延长，该稳定剂包裹的量子点的粒径增长比较快，由此可见，随着培养时间的延长，量子点的粒径在逐渐增加，而以GSH为稳定剂时，培养相同的时间，量子点粒径增长最快。
参照实施例3实验方法得出结论，三种不同稳定剂包裹的CdSe量子点的粒径大约在5nm左右，具有良好的单分散性，呈现出近似球形的结构，量子产率在35％左右。
实施例3：
(1)大肠杆菌湿菌体的配置方法如实施例1所述，取0.0015g第二代大肠杆菌湿菌体移入一单颈烧瓶中，加入到45ml的M9培养基(组成同实施例1)中，随后在不断搅拌下加入4ml0.04mol·l-1CdCl2水溶液，400mg二水合柠檬酸三钠，40mg MSA，1.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3水溶液，在37℃下培养5天，过滤，弃去沉淀，上层清液加入同等体积的无水乙醇，离心，得到CdSe量子点，在真空干燥箱中进行烘干，将干燥后的CdSe量子点进行高分辨透射电镜成像(图4所示)，红外成像(图5所示)。
(2)将大肠杆菌经LB培养基种子培养后的湿菌体接种至M9培养基(培养方法同实施例1)，获得含大肠杆菌的培养液；将步骤(1)经过提取、烘干得到的CdSe量子点加入到含有大肠杆菌的50ml的培养液中，37℃培养2天，经过离心获得湿菌体，用M9培养基洗涤之后，进行荧光显微镜成像(图3中A所示)。
(3)将酵母菌经YPD种子培养基培养后的湿菌体接种至察氏培养基中(培养方法同实施例2)，获得含酵母菌的培养液；按照步骤(2)方法，将含酵母菌的培养液50ml，37℃培养2天，经过离心获得湿菌体，用察式培养基洗涤之后，进行荧光显微镜成像(图3中B所示)，激光扫描共聚焦显微镜成像(图6所示，A为荧光成像，B为明场成像，C为荧光成像与明场成像的叠加成像)。
高分辨透射电镜结果显示，CdSe量子点具有很好的单分散性，呈现出近似球形的结构，粒径大约在5nm左右。
红外成像结果表明，CdSe量子点在3415，1657，1578，1385cm-1处均有明显的吸收峰，3415cm-1处为N-H的伸缩振动的吸收峰，1657cm-1，1578cm-1处的吸收峰分别为酰胺Ⅰ谱带和酰胺Ⅱ谱带的特征吸收峰，1385cm-1处的吸收峰为C-N伸缩振动，由于这些吸收峰的存在，进一步证明了蛋白质的存在，而我们选用的培养基中，并不含外源蛋白，所以量子点外面的蛋白质即为微生物自身分泌的蛋白质包裹在其外面。
荧光显微成像结果显示，大肠杆菌呈现绿色荧光，表明量子点已经进入到微生物的体内。
激光扫描共聚焦显微镜成像表明，酵母菌呈现出绿色的荧光，表明量子点已进入到酵母菌体内，酵母菌的细胞质和细胞核均被标记上绿色荧光，所以，我们合成的量子点具有很好的生物相容性，不需要将量子点进一步修饰，即可应用于生物染色，这对量子点在生物标记和生物染色方面的应用具有极大的优势。
实施例4：
第二代大肠杆菌湿菌体的制备方法如实施例1。取0.0025g第二代大肠杆菌湿菌体移入一单颈烧瓶中，加入到45ml的M9培养基中，随后在磁力搅拌下加入4ml0.04mol·l-1CdCl2水溶液，200mg二水合柠檬酸三钠，96.83mg GSH，1ml0.01mol·l-1Na2SeO3水溶液，在37℃下培养5天，然后通过离心分离收集得到蛋白质包裹的CdSe量子点。
参照实施例3得出结论，GSH包裹的CdSe量子点表现出良好的尺寸效应，量子点的粒径大约在4nm左右，单分散性好，量子产率在30％左右。
实施例5：
第二代酵母菌湿菌体的制备方法如实施例2。取0.0075g第二代酵母菌湿菌体移入一单颈烧瓶中，加入到45ml的M9培养基中，随后在磁力搅拌下加入4ml0.04mol·l-1CdCl2水溶液，500mg二水合柠檬酸三钠，122.805mg L-cys，0.5ml0.01mol·l-1Na2SeO3水溶液，在37℃下培养5天，然后通过离心分离收集得到蛋白质包裹的CdSe量子点。
参照实施例3得出结论，L-cys包裹的CdSe量子点发光性能良好，具有尺寸相关的特性，量子点的粒径大约在5nm左右，单分散性好，量子产率在30％左右。
Claims (10)
1.一种硒化镉量子点的生物合成方法，其特征在于所述方法为：以亚硒酸盐为Se源，以水溶性镉盐为Cd源，以巯基化合物为稳定剂，以大肠杆菌或酵母菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，在二水合柠檬酸三钠的作用下，于大肠杆菌发酵培养基或酵母菌发酵培养基中，37℃培养1～6天，离心，弃去上清，收集沉淀，获得硒化镉量子点；所述Se源用量以Se物质的量计，所述Cd源用量以Cd物质的量计，所述Se与Cd物质的量之比为1:10.7～32；所述稳定剂的加入量以Se物质的量计为2.7～25g/mol，所述二水合柠檬酸三钠的加入量以Se物质的量计为20～100g/mol，所述催化剂的加入量以湿菌体质量计，所述湿菌体质量以Se物质的量计0.1～3g/mmol。
2.如权利要求1所述硒化镉量子点的生物合成方法，其特征在于所述大肠杆菌发酵培养基为M9培养基，所述酵母菌发酵培养基为察氏培养基。
3.如权利要求1所述硒化镉量子点的生物合成方法，其特征在于所述亚硒酸盐以0.01mol/L亚硒酸盐水溶液的形式加入，所述亚硒酸盐为Na2SeO3或K2SeO3。
4.如权利要求1所述硒化镉量子点的生物合成方法，其特征在于所述水溶性镉盐以0.04mol/L水溶性镉盐水溶液的形式加入，所述水溶性镉盐为CdCl2、Cd(NO3)2或CdSO4。
5.如权利要求1所述硒化镉量子点的生物合成方法，其特征在于所述巯基化合物为硫代苹果酸、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、巯基乙酸或巯基丙酸。
6.如权利要求1所述硒化镉量子点的生物合成方法，其特征在于所述Se与Cd物质的量之比为1:10.7～21。
7.如权利要求1所述硒化镉量子点的生物合成方法，其特征在于所述稳定剂的加入量以Se物质的量计为21～25g/mol，所述二水合柠檬酸三钠的加入量以Se物质的量计为60～80g/mol，所述催化剂的加入量以湿菌体质量计，所述湿菌体质量以Se物质的量计0.1～3g/mmol。
8.如权利要求1所述硒化镉量子点的生物合成方法，其特征在于所述合成方法先将催化剂接种至大肠杆菌发酵培养基或酵母菌发酵培养基中，再加入Se源、Cd源、稳定剂、二水合柠檬酸三钠进行生物合成反应；所述大肠杆菌发酵培养基为M9培养基，所述酵母菌发酵培养基为察氏培养基。
9.如权利要求1所述硒化镉量子点的生物合成方法，其特征在于所述催化剂按如下方法之一制备：(1)将大肠杆菌接种至LB培养基，37℃培养至OD600＝0.6，得到种子液，离心，去除上层清液，沉淀接种至M9培养基，37℃培养至OD600＝0.6，离心，弃上清，得到大肠杆菌湿菌体；所述LB培养基终浓度组成为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0，溶剂为水；所述M9培养基终浓度组成：磷酸氢二钠15g/L，磷酸二氢钾7.5g/L，氯化铵2.5g/L，氯化钠1.25g/L，七水合硫酸镁0.002mol/L，葡萄糖2g/L，溶剂为水；(2)将酵母菌接种至YPD培养基，37℃培养至OD600＝0.6，得到种子液，离心，去除上层清液，沉淀接种到察氏培养基，37℃培养至OD600＝0.6，离心，弃上清，得到酵母菌湿菌体；所述YPD培养基终浓度组成：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH值7.0，溶剂为水；所述察氏培养基终浓度组成：蔗糖30g/L，硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钾0.5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，pH值7.0，溶剂为水。
10.如权利要求9所述硒化镉量子点的生物合成方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：将大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体接种至M9培养基或将酵母菌经发酵培养获得的湿菌体接种至察氏培养基，在磁力搅拌下，加入Se源、Cd源、巯基化合物和二水合柠檬酸三钠，37℃培养4～6天，离心，取沉淀，获得CdSe量子点；所述巯基化合物为硫代苹果酸、谷胱甘肽或L-半胱氨酸；所述Se与Cd物质的量之比为1:10.7～21；所述巯基化合物的加入量以Se物质的量计为21～25g/mol，所述二水合柠檬酸三钠的加入量以Se物质的量计为60～80g/mol，所述催化剂的加入量以湿菌体质量计，所述湿菌体质量用量以Se物质的量计0.1～3g/mmol。
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