CN112973794A - 四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系、其构建方法及在可见光催化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种四膜虫‑CdS量子点胞内杂化体系的构建方法，包括：将四膜虫与镉盐在营养培养基中孵育，得到四膜虫‑CdS量子点胞内杂化体系。与现有技术相比，本发明首次提供四膜虫内合成CdS量子点的方法，所合成的量子点具有高低pH、高离子强度、高温剂光催化稳定的特点，同时光催化稳定的特点使四膜虫‑CdS量子点胞内杂化体系非常适合应用于可见光催化反应，且不需要添加空穴牺牲剂，为较高等生物利用太阳能完成化学能储存提供了研究思路。
Description
技术领域
本发明属于生物材料合成与应用技术领域，尤其涉及一种四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系、其构建方法及在可见光催化中的应用。
背景技术
生物圈对光能的利用离不开光敏物质与胞内酶的协作，为了使生物更直接利用光能，因此目前已有一些酶与外源光敏物质协作的研究。
酶与外源光敏物质协作的研究大致可分为两种：一种是酶与光敏物质的直接联合使用；另一种是光敏物质与微生物的耦合使用，比如CdS跟大肠杆菌直接结合光催化推进生物产氢。其中，CdS量子点由于具有合适的导带价带，强稳定性，可见光催化能力等理由而多次出现在耦合体系中，并且量子点是大小在1～10nm间，具有荧光及光催化性能的纳米材料。
目前为止，CdS是耦合体系中最常用的光催化剂且多数时候被合成在胞外。但光催化所产生的电子若想进入胞内又会消耗掉一些能量，并且胞外的CdS也更容易受外部环境的影响，因此很有必要构建胞内生物-CdS耦合体系。另外，也有必要在细菌和真菌之外的更高等的生物中构建耦合体系，再者量子点在进行光催化反应时容易被破坏，因此如何提高量子点的包括光催化稳定性在内的稳定性也是量子点后续使用于光催化反应时需要注意的一点。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有高稳定性的四膜虫-Cds量子点胞内杂化体系、其构建方法及在可见光催化中的应用。
本发明提供了一种四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系的构建方法，包括：
将四膜虫与镉盐在营养培养基中孵育，得到四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系。
优选的，所述四膜虫为梨形四膜虫和/或嗜热四膜虫；所述镉盐选自氯化镉。
优选的，所述四膜虫先在营养培养基中培养至指数期或稳定期早期然后再加入镉盐进行孵育。
优选的，孵育体系中镉盐的浓度为50～1000μM。
优选的，所述孵育的温度为25℃～30℃；所述孵育的时间为12～204h。
本发明还提供了一种上述构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系。
本发明还提供了上述构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系作为可见光催化剂的应用。
本发明还提供了一种可见光催化硝基苯还原的方法，以上述构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系为催化剂。
优选的，将上述构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系与硝基苯混合，在可见光辐照下进行无外源空穴牺牲剂的光催化还原反应。
本发明提供了一种四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系的构建方法，包括：将四膜虫与镉盐在营养培养基中孵育，得到四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系。与现有技术相比，本发明首次提供四膜虫内合成CdS量子点的方法，所合成的量子点具有高低pH、高离子强度、高温剂光催化稳定的特点，同时光催化稳定的特点使四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系非常适合应用于可见光催化反应，且不需要添加空穴牺牲剂，为较高等生物利用太阳能完成化学能储存提供了研究思路。
附图说明
图1为本发明实施例1中得到的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系和对照四膜虫的荧光显微镜观察图；
图2为本发明实施例1中得到的提纯的CdS量子点及其对照组的三维荧光光谱检测图；
图3为本发明实施例1中得到的提纯的CdS量子点的透射电镜图；
图4为本发明实施例1中得到的提纯的CdS量子点X射线吸收精细结构谱(EXAFS)标品和样品的傅里叶变换图及样品的拟合曲线图；
图5为本发明实施例1中得到的四膜虫-CdS量子点的荧光随pH变化的柱形图；
图6为本发明实施例1中得到的四膜虫-CdS量子点的荧光随离子强度变化的曲线图；
图7为本发明实施例1中得到的四膜虫-CdS量子点在100℃处理不同时间后的荧光变化曲线图；
图8为本发明实施例1中得到的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系和四膜虫在光照或黑暗条件下苯胺生成图(a)和气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)确认四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系在光照时生成苯胺的质谱图(b)；
图9为本发明实施例1中得到的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系在光催化反应前后的CdS量子点荧光变化的荧光显微镜观察图；
图10为本发明实施例2和3中野生型，TpyCSE1-KD，TpyCSE2-KO四膜虫在氯化镉处理48h时合成CdS量子点情况的荧光显微镜观察图(a)和相应Image J统计图(b)；
图11为本发明实施例6中50μM和1mM氯化镉浓度处理48h时四膜虫合成四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系的荧光显微镜观察图；
图12为本发明实施例7中100μM氯化镉处理四膜虫12或204h时四膜虫合成四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系的荧光显微镜观察图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系的构建方法，包括：将四膜虫与镉盐在营养培养基中孵育，得到四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系。
其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。
在本发明中，优选先将四膜虫在营养培养基中进行培养，然后加入镉盐进行孵育；所述四膜虫优选为梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)和/或嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)；所述四膜虫可为野生型四膜虫也可为突变型四膜虫；所述突变型四膜虫优选为胱硫醚裂解酶基因敲除的四膜虫，更优选为胱硫醚裂解酶1基因敲除的四膜虫或胱硫醚裂解酶2基因敲除的四膜虫；所述营养培养基可根据四膜虫的种类进行选择，并无特殊的限制，在本发明中，所述营养培养基优选为蛋白胨培养基，更优选包括
蛋白胨8～12g/L、酵母浸膏0.5～2g/L、葡萄糖1.5～2.5g/L、乙二胺四乙酸铁钠盐0.01～0.05g/L与水；所述培养优选培养至指数期或稳定期早期然后再加入镉盐进行孵育；在本发明中，优选培养至培养基中虫子的数量扩大6～30倍再加入镉盐进行孵育；所述培养的温度优选为25℃～30℃，更优选为27℃；所述培养优选为震荡培养；所述震荡培养的转速优选为100～200rpm，更优选为120～200rpm，再优选为140～180rpm，最优选为160rpm；所述镉盐优选为氯化镉；所述镉盐加入的量优选使体系中镉盐的浓度为50～1000μM，更优选为50～100μM；在本发明提供的实施例中，所述镉盐加入的量具体使体系中镉盐的浓度为50μM、75μM、100μM或1000μM；所述孵育的温度优选为25℃～30℃，更优选为27℃；所述孵育的时间优选为12～204h；在本发明提供的实施例中，所述孵育的时间具体为48h、12h或204h；所述孵育优选在震荡的条件下进行；所述震荡的转速优选为100～200rpm，更优选为120～200rpm，再优选为140～180rpm，最优选为160rpm。
孵育结束后，分离收集四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系也可不分离收集直接用于光催化还原反应。所述分离收集的方法优选为离心；所述离心的转速优选为1500～5000rpm，更优选为1500～3500rpm，再优选为3000rpm；所述离心的时间优选为2～7min，更优选为4～6min，最优选为5min；在本发明中优选还用缓冲液洗涤；所述缓冲液优选为Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液的pH值优选为7.1～7.8，更优选为7.2～7.6，再优选为7.3～7.5，最优选为7.4；所述洗涤的次数优选为2～3次；每次洗涤后均优选用离心分离；最后优收集保存于缓冲液中。
本发明首次提供四膜虫内合成CdS量子点的方法，所合成的量子点具有高低pH、高离子强度、高温剂光催化稳定的特点，同时光催化稳定的特点使四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系非常适合应用于可见光催化反应，且不需要添加空穴牺牲剂。
本发明还提供了一种上述构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系。
本发明还提供了一种上述构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系作为可见光催化剂的应用，尤其是作为可见光催化剂在光催化还原反应中的应用。
本发明还提供了一种可见光催化硝基苯还原的方法，以上述构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系为催化剂。
在本发明中，具体为：将上述构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系与硝基苯混合，在可见光辐照下进行无外源空穴牺牲剂的光催化还原反应。其中，所述四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系与硝基苯的质量比优选为400：(10～50)，更优选为400：(20～40)，再优选为400：(30～40)，最优选为400：35；所述可见光辐照的光源优选为氙灯或太阳光；所述光源还可通过滤波片滤过比400或420nm大波长的光；所述光催化还原反应优选在厌氧条件下进行；在本发明中，所述四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系与硝基苯优选混合后进行预孵育，使两种充分接触，再在可见光辐照下进行光催化还原反应；所述四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系与硝基苯预孵育时间优选为0～1h。
光催化还原反应后，优选将四膜虫破碎、离心、过滤上清，通过HPLC检测苯胺的生成。所述四膜虫破碎优选采用2％十二烷基硫酸钠(SDS，质量体积比mg/ml)；所述离心的转速优选为6000～10000rpm，更优选为7000～9000rpm，再优选为8000rpm；所述离心的时间优选为2～7min，更优选为4～6min，再优选为5min；所述过滤上清优选采用0.22μm膜；所述HPLC所用的色谱柱优选为Agilent Symmetry C18(150×4.6mm,5μm)；柱温优选为35℃。流动相中水与乙醇的体积比优选为60:40(％)；流速优选0.8ml/min。苯胺的检测使用紫外检测器，检测波长为231nm。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系、其构建方法及在可见光催化中的应用进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
营养培养基的配置：每升含有
蛋白胨10g，酵母浸粉1g，葡萄糖2g，乙二胺四乙酸铁钠盐0.03g，溶剂为水，定容至1L，121℃灭菌20min，冷却待用。
保种培养基的配制：一颗黄豆粒加10mL的去离子水，121℃灭菌20min，冷却待用。
四膜虫保种：取营养培养基中生长至指数期或稳定期早期的四膜虫100μL加到保种培养基中，梨形四膜虫在27℃，90rpm转速培养12 h后，缓慢加入1mL的灭菌石蜡油，室温竖直静置保存。
实施例1
以1mL含有梨形四膜虫的保种培养基加到30mL的营养培养基的比例扩大四膜虫体系，再5万/ml虫子数量转到新培养基，在27℃，160rpm条件下培养至约150万/ml，添加100μM氯化镉合成CdS量子点48h，3000rpm离心5min，洗涤收集缓冲液均为10mMTris-HCl(pH7.4)，得到约400mg/L的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系。
利用荧光显微镜对实施例1中得到的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系进行分析，得到其荧光显微镜观察图如图1所示，其中对照组为未合成量子点的梨形四膜虫。
表征所需的提纯的CdS量子点通过以下方法获得：在合成CdS的四膜虫中添加2％的SDS和0.2M NaOH。在冰浴中用超声细胞破碎仪破碎10min，功率为120W，0.22μm滤膜过滤。换用10kDa超滤管洗涤过滤收集内管液体，再添加50μg/ml蛋白酶K在37度处理10min。最后用3kDa超滤管洗涤过滤收集内管液体。用Aqualog检测三维荧光光谱得到其三维荧光光谱图如图2所示，由图2显示可知四膜虫合成的CdS量子点的最佳激发光的波长大约在360nm左右，而它的发射光大约在500～550nm之间，对照组是四膜虫经过相同纯化步骤后所得部分的三维荧光光谱。将纯化的CdS量子点滴在铜网上观察透射式扫描电子显微镜(STEM)，得到其透射电镜图如图3所示，由图3结果显示CdS的大小在3～6.5nm之间。将纯化的CdS量子点冻干之后在上海光源BL14W1进行Cd的EXAFS测试，得到其X射线吸收精细结构谱(EXAFS)的傅里叶变换图及样品的拟合曲线，如图4所示，由图4的结果确定了所合成材料为CdS，其拟合结果显示1个Cd原子周围有3.5±0.2个硫原子。
四膜虫-CdS量子点的稳定性通过在360nm的光激发时检测525nm发射光的强度实现，得到四膜虫-CdS量子点的荧光随pH变化的柱形图如图5所示，得到四膜虫-CdS量子点的荧光随离子强度变化的曲线图如图6所示，得到四膜虫-CdS量子点在100℃处理不同时间后的荧光变化曲线图如图7所示。不同pH的溶液用HCl和NaOH配制。结果显示四膜虫-CdS量子点在pH 4～11之间都能保持其稳定性(图5)，且即便在2M的NaCl中其荧光也保持在原先的90％以上(图6)。将四膜虫-CdS量子点装在1.5ml离心管中，温度从室温升到100度并且继续煮30min时荧光仍可以保持90％以上，而即便继续再煮30min，四膜虫-CdS量子点的稳定性仍可保持在80％以上(图7)。
在400mg/L的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系中加入35mg/L硝基苯后，用氮气置换反应体系中的氧气，稳定1h使四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系与硝基苯得到充分接触，接着用350W的氙灯照射。样品用HPLC检测前先8000rpm离心5min后0.22μm滤膜过滤上清。HPLC所使用色谱柱为Agilent Symmetry C18(150×4.6mm,5μm)，柱温是35℃。流动相中水与乙醇的比例为60:40(％)，流速是0.8ml/min。苯胺的检测使用紫外检测器，检测波长为231nm，制作苯胺标准曲线。CdS量子点的光催化明显加快了硝基苯还原反应的进程，从图8a中可观察到反应的促进不是因为四膜虫本身或硝基苯在光下的自降解。苯胺的生成再次通过气相色谱确认，选用非极性J&M DB 5MS柱子(0.25μm,30m×0.25mm)，温度50℃保持3min，之后以5℃/分的速度上升到300℃，保持5min。注射器和检测器的温度是250℃，得到生成苯胺的质谱图如图8(b)所示。图8b的结果显示四膜虫-CdS量子点在光催化反应时确认合成了苯胺。
用荧光显微镜观察并用Image J统计反应前后四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系平均荧光强度的变化，CdS的激发与发射波长分别是360和525nm，得到四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系在光催化反应前后的CdS量子点荧光变化的荧光显微镜观察图，如图9所示。由图9可知，反应前后四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系的荧光并没有衰减，其统计结果显示光催化反应后的荧光是反应前的1.11倍，但两者没有显著性差异，反映出CdS量子点光催化稳定。
实施例2
以1mL含有野生型(WT)和TpyCSE1-KD梨形四膜虫的保种培养基加到30mL的营养培养基并如实施例1的方式扩大四膜虫体系。TpyCSE1-KD指胱硫醚裂解酶1基因敲除的梨形四膜虫。添加100μM的氯化镉，合成12，48h的CdS量子点。培养及收集步骤同实施例1。荧光显微镜观察及Image J统计的平均荧光强度结果显示TpyCSE1-KD的CdS量子点合成效率极低，即便在48h时也仅仅是WT相应时间段的量子点合成量的约一半(图10)。硝基苯还原及检测苯胺生成的步骤同实施例1。还原12h结果是TpyCSE1-KD合成了0.022±0.001mg/mg的苯胺，约只有WT(0.057±0.005mg/mg)合成的1半。
实施例3
以1mL含有TpyCSE2-KO的梨形四膜虫的保种培养基加到30mL的营养培养基并如实施例1的方式扩大四膜虫体系。TpyCSE2-KO指胱硫醚裂解酶2基因敲除的梨形四膜虫。培养，CdS量子点合成及收集步骤同实施例2。如图10及Image J统计结果所示，48h时TpyCSE2-KO的CdS量子点合成效率也只有WT的约一半。硝基苯还原及检测苯胺生成的步骤同实施例1。还原12h结果是TpyCSE2-KO合成了0.032±0.007mg/mg的苯胺，约只有WT合成的1半。
实施例4
以1mL含有TpyCSE1-KD梨形四膜虫的保种培养基加到30mL的营养培养基并如实施例1的方式扩大四膜虫体系。添加50μM的氯化镉，合成48h的CdS量子点。1500rpm，离心3min，洗涤收集缓冲液均为10mMTris-HCl(pH 7.4)，得到四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系。在四膜虫-CdS量子点加入7.5μM硝基苯后，用氮气置换反应体系中的氧气，太阳光照射4.5h后样品处理法和苯胺的检测法同实施例1。此时TpyCSE1-KD无法产生苯胺，而四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系则生成了0.282±0.031mg/L的苯胺。
实施例5
以1mL含有TpyCSE1-KD梨形四膜虫的保种培养基加到30mL的营养培养基并如实施例1的方式扩大四膜虫体系，27℃、160rpm条件下培养至晚指数期。添加75μM的氯化镉，合成48h的CdS量子点。1500rpm，离心3min，洗涤收集缓冲液均为10mM Tris-HCl(pH 7.4)，得到四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系。在四膜虫-CdS量子点加入7.5μM硝基苯后，用氮气置换反应体系中的氧气，太阳光照射6h后样品处理法和苯胺的检测法同实施例1。此时TpyCSE1-KD无法产生苯胺，而四膜虫-CdS量子点则生成了0.986±0.697mg/L的苯胺。
实施例6
以1mL含有梨形四膜虫的保种培养基加到30mL的营养培养基并如实施例1的方式扩大四膜虫体系。添加50～1000μM的氯化镉，合成48h的CdS量子点。培养及收集步骤同实施例1。荧光显微镜观察结果如图11。用1000μM氯化镉合成的四膜虫-CdS量子点体系，加入35mg/L的硝基苯，用氮气置换反应体系中的氧气，500W的氙灯照射，12h后样品的处理及HPLC检测法同实施例1。此时该体系产生了3.272mg/L的苯胺。
实施例7
以1mL含有梨形四膜虫的保种培养基加到30mL的营养培养基并如实施例1的方式扩大四膜虫体系。添加100μM的氯化镉，合成12～204h的CdS量子点。培养及收集步骤同实施例1。荧光显微镜观察结果如图12。用合成204h的四膜虫-CdS量子点体系，硝基苯还原及苯胺检测方法同实施例6。此时该体系产生了3.272mg/L的苯胺。
实施例8
以1mL含有梨形四膜虫的保种培养基加到30mL的营养培养基并如实施例1的方式扩大四膜虫体系。在27℃，160rpm条件下培养至30万/ml。添加100μM的氯化镉合成CdS量子点12h。3,500rpm离心5min，洗涤收集缓冲液均为10mM Tris-HCl(pH 7.4)。硝基苯还原及苯胺检测方法同实施例6。此时该体系产生了2.514mg/L的苯胺。
Claims (9)
1.一种四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系的构建方法，其特征在于，包括：
将四膜虫与镉盐在营养培养基中孵育，得到四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述四膜虫为梨形四膜虫和/或嗜热四膜虫；所述镉盐选自氯化镉。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述四膜虫先在营养培养基中培养至指数期或稳定期早期然后再加入镉盐进行孵育。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，孵育体系中镉盐的浓度为50～1000μM。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述孵育的温度为25℃～30℃；所述孵育的时间为12～204h。
6.一种权利要求1～5任意一项构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系。
7.权利要求1～5任意一项构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系作为可见光催化剂的应用。
8.一种可见光催化硝基苯还原的方法，其特征在于，以权利要求1～5任意一项构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系为催化剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将权利要求1～5任意一项构建方法所构建的四膜虫-CdS量子点胞内杂化体系与硝基苯混合，在可见光辐照下进行无外源空穴牺牲剂的光催化还原反应。
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