WO2005116238A1

WO2005116238A1 - キサントフィルの製造方法

Info

Publication number: WO2005116238A1
Application number: PCT/JP2005/008274
Authority: WO
Inventors: Kai Zhang
Original assignee: Yamaha Hatsudoki Kabushiki Kaisha
Priority date: 2004-05-26
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2005-12-08
Also published as: EP1749890A1; CN1878872A; JPWO2005116238A1; US20070092932A1; US7566551B2

Abstract

光合成微細藻類からキサントフィルを製造する方法であって、キサントフィルを含有する光合成微細藻類、好ましくはシスト化した微細藻類を栄養培地に接種して増殖させる工程、および、該増殖した微細藻類をシスト化させる工程を含む方法が提供される。窒素源濃度が低い栄養培地を用いて、増殖工程およびシスト化工程を連続的に行う、１段階培養法、あるいは、窒素源濃度が高い栄養培地で増殖し、シスト化培地に移植する２段階培養法が適用される。

Description

キサントフィルの製造方法技術分野

本発明は、キサントフィルの効率的な生産方法に関する。

背景技術

明

カロチノイドの一種であるキサントフィル（例えば、ァスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アド二ルビン、了ドニキサンチン、ク書

リプトキサンチンなど) は、種々の用途に使用されている。例えば、ァスタキサンチンは、赤色のカロチノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。そのため、食材用色素、化粧品、健康食品、医薬品などとして使用されている。ァスタキサンチンは、化学合成されるものの他、天然物由来のものがある。天然物由来のァスタキサンチンは、ォキアミ、ァマエビなどのェビ類、ファフィァ酵母、藻類などから抽出されている。しかし、ォキアミなどのェビ類あるいは酵母のァスタキサンチン含量は低いため、効率よくァスタキサンチンが抽出されない。

他方、藻類、例えば、へマトコッカスは、外部環境の変化に応じてシスト化し、藻体内にァスタキサンチンを蓄積する。そのため、藻類によるァスタキサンチンの生産研究が行われている。

例えば、 J. Fabregas et al. , J. Biotech. Vol. 89, p66, (2001)には、へマトコッカスを 2段階で培養し、ァスタキサンチンを生産する方法が記載されている。この方法では、第 1段階で、 1日に 1 0〜4 0 %の培養液を交換しながら（すなわち、半回分培養しながら）へマトコッカスの栄養細胞を得る。第 2段階では、さらに 1 5日間、光を照射しながら回分培養を行い、栄養細胞の休眠細胞化（すなわち、シスト化）と細胞内部へのァスタキサン 008274

チンの蓄積を誘発する。

R. T. Lorenz et al. , TIBTECH, vol. 18 (April) , pl60- 167，（2000)には、ァスタキサンチンの商業的生産のために、へマトコッカスの 2段階培養方法が記載されている。この方法においては、第 1段階で、密閉されたパイオリアクター内で光照射しながらへマトコッカスを培養して栄養細胞を得る。そして、次の第 2段階では、この栄養細胞を、培地中の窒素とリンを欠乏させた屋外培養池に移し、培養池の温度を上昇させながら照射光の強度を上げて培養する力、屋外培養池の培地に塩化ナトリゥムを添カ卩して培養することにより、栄養細胞の休眠細胞化（すなわち、シスト化）と細胞内部へのァスタキサンチンの蓄積を誘発する。

特開 2 0 0 0— 6 0 5 3 2号公報には、第 1段階で、密閉されたパイオリアクター内で光照射しながらへマトコッカスを培養して栄養細胞を得、そして、次の第 2段階では、屋外培養池で休眠細胞に移行させてァスタキサンチンの生成、蓄積を誘発させ、へマトコッカスを捕食するあるいはへマトコッカスに寄生する生物が増殖する前に、へマトコッカスを回収する方法が記載されている。

しかし、上記のような 2段階の反応においては、第 2段階において、レースウェイ式大気開放型培養液などの開放または屋外培養池で培養を行う場合、培地に雑菌が増殖する可能性が高い。そのため、短期間にシスト化を行わなければならず、シスト化細胞のァスタキサンチン含量も低い。ァスタキサンチンの生産効率を高めるためには、大量の栄養細胞を準備しなければならない。

他方、特開 2 0 0 4— 1 2 9 5 0 4号公報には、喑所でもしくは光を照射しないで、かつ好気的な条件下でへマトコッカスを培養することにより、ァスタキサンチンを生産する方法が記載されているが、ァスタキサンチンの生産性は低いという問題がある。 5 008274

3 そこで、藻類からの効率的なァスタキサンチンの製造方法が望まれている。発明の開示

本発明は、光合成微細藻類からキサントフィルを製造する方法であって、キサントフィルを含有する光合成微細藻類を栄養培地に接種して増殖させる工程；および、該増殖した微細藻類をシスト化させる工程を含む方法を提供する。

1つの実施形態では、上記キサントフィルを含有する光合成微細藻類が、シスト化された光合成微細藻類である

別の実施形態では、上記増殖工程およびシスト化工程が同一培養槽内で行なわれる。

また、別の実施形態では、上記微細藻類の増殖およびシスト化が、前記増殖工程およびシスト化工程が、低栄養培地を用いて行われる。

さらに別の実施形態では、上記増殖工程およびシスト化工程が回分培養で行われる。

さらに異なる実施形態では、上記増殖工程およびシスト化工程が、それぞれ異なる培地を用いて行なわれる。

別の実施態様では、上記増殖工程およびシスト化工程が、それぞれ回分培養で行なわれる。

また、一つの実施形態では、上記増殖工程およびシスト化工程が、光照射下行われる。

さらに別の実施形態では、上記記微細藻類がへマトコッカス属に属する緑藻である。

また、別の実施形態では、上記緑藻がへマトコッカス 'プルビアリスである。

さらに異なる実施形態では、上記キサントフィルがァスタキサンチンである。

また、本発明は、キサントフィルを含有する遊走子を有する光合成微細藻類を提供する。

図面の簡単な説明

図 1は、栄養培地に接種するへマトコッカスのシスト化細胞の顕微鏡写真である。

図 2は、培養開始から 5 0時間目のへマトコッカス細胞の顕微鏡写真でめる。

図 3は、培養開始から 2 0 0時間目のへマトコッカス細胞の顕微鏡写真である。

図 4は、培養開始から 3 5 0時間目のへマトコッカス細胞の顕微鏡写真である。

図 5は、本発明の 1段階培養方法における、藻類の増殖およびァスタキサンチン含量の経時変化を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の方法は、キサントフィルを含有する光合成微細藻類、好ましくはシスト化した光合成微細藻類を増殖培地に接種して増殖させ、ついで、シスト化させることを特徴とする。以下、本明細書において、光合成微細藻類を単に「微細藻類」ということがある。

キサントフィルを含有する微細藻類、好ましくはキサントフィルを多く蓄積した、シスト化した微細藻類を増殖培地に接種して増殖させた場合、シスト化した微細藻類は、キサントフィルを含有する遊走子を放出する。この遊走子がキサントフィルを含有したまま、栄養細胞となる。栄養細胞は、さらにキサントフィルを含有したまま、分裂によっても増殖する。従って、微細藻類の数は、単純な細胞分裂による場合よりも、早く増加する。そして、この増殖（増加）した、キサントフィルを含有する微細藻類（栄養細胞）をさらにシスト化することにより、更なるキサントフィルが微細藻類内で、生産され、蓄積される。従って、本発明の方法でシスト化した微細藻類中には、もともと存在していたキサントフィルに加えて、新たに生産されたキサントフィルが含まれるので、単に微細藻類の栄養細胞からシスト化させた場合に比べて、キサントフィル含量が高くなる。以下、本発明について、詳細に説明する。

(光合成微細藻類）

本発明に用いられる光合成微細藻類としては、光合成をすることができ、かつキサントフィルを生産する能力がある藻類であれば、特に制限はない。緑藻類が、キサントフィル類の生産の点から、好ましく用いられる。

本発明に用いられる緑藻類としては、例えば、へマトコッカス（Haematoc occus) 属に属する単細胞藻類が好ましく用いられる。好ましいへマトコッカス属の藻類としては、へマトコッカス 'プルビアリス（H. pluvialis) 、へマトコッカス .ラクストリス (H. lacustris) 、へマトコッカス '力ペンシス (H. capensis) 、へマトコッカス · ドロエノケンシ (H. droebakens i) 、へマトコッカス 'ジンパプェンシス（H. zimbabwiensis) などが挙げられる。へマトコッカス 'プルビアリス（H. pluvialis) としては、独立行政法人国立環境研究所に寄託されている N I E S 1 4 4株、米国テキサス大学藻類保存施設に寄託されている U T E X 2 5 0 5株、デンマークのコぺンノヽーケン大学の Scandinavian Culture Center for Algae and Protozoa,

Botanical Instituteに保存されている K 0 0 8 4株などが挙げられる。へマトコッカス .ラタストリス（H. lacustris) としては、 A T C Cに寄託されている A T C C 3 0 4 0 2株および同 3 0 4 5 3株、東京大学応用微生物研究所に寄託されている I AM C - 3 9 2株、同 C— 3 9 3株、同 C _ 3 9 4株および同 C— 3 3 9株、あるいは U T E X 1 6株および同 2 9 4株などが挙げられる。

へマトコッカス .力ペンシス（H. capensis) としては、 U T E X L B 1 0 2 3株などが挙げられる。

へマトコッカス . ドロエバケンシ（H. droebakensi) としては、 U T E X

5 5株が挙げられる。

へマトコッカス .ジンパブェンシス（H. zimbabwiensis) としては、 U T E X L B 1 7 5 8株などが挙げられる。

これらの中でも、へマトコッカス ·プルビアリスが好ましく用いられる。 (シスト化）

本発明においては、上記微細藻類であって、キサントフィルを含有する微細藻類が、栄養培地に接種される。キサントフィルを含有する微細藻類には、キサントフィルを含有する栄養細胞およびシスト化した微細藻類が含まれる。キサントフィルを含有する微細藻類の栄養細胞は、その微細藻類が、かってシスト化していた（休眠状態にあった）ことを意味する。

微細藻類は、例えば、光照射、栄養飢餓状態、酸化物の存在など、生育環境からのストレスを受けると、細胞内にキサントフィルなどを蓄積し、休眠胞子化する。この休眠状態に入ることをシスト化という。本明細書では、シスト化は、休眠状態に入りキサントフィルを蓄積し始めた状態から完全にシスト化し休眠胞子となった状態までのいずれかの状態を含む。キサントフィル含量を高める観点からは、できるだけシスト化が進行し、キサントフィルを多く蓄積した微細藻類を用いることが好ましい。

(培地）

微細藻類の培養に用いる培地としては、特に制限がない。一般に、増殖に必要な窒素と、微量金属の無機塩（例えば、リン、カリウム、マグネシウム、鉄など）、ビタミン類（例えば、チアミンなど）などを含む培地が用いられる。例えば、 VT培地、 C培地、 MC培地、 MBM培地、 MDM培地などの培地（これらは、藻類研究法千原光雄 ·西澤一俊編、共立出版（1 9 7 9) を参照のこと）、 OHM培地（これは、非特許文献 1を参照のこと）、 BG- 1 1培地およびこれらの改変培地などが用いられる。

これらの培地は、増殖を目的とする培地、シスト化を目的とする培地など、用途に応じて使用することができる。例えば、微細藻類の増殖を目的とする場合は、窒素源となる成分の多い培地（富栄養培地：窒素として、 0. 1 5 g/L以上を含む培地）を用いる。シスト化を目的とする場合は、窒素源となる成分をほとんど含まない培地（シスト化培地：窒素として、 0. 02 g ZL未満）を用いる。あるいは、その中間の濃度の窒素源を含む培地（低栄養培地：窒素として、 0. 02 g/L以上で、 0. 15 g/L未満）を用いてもよい。

培地中の窒素源濃度、リン濃度などは、接種する微細藻類の量に依存して、決めればよい。例えば、培養開始時の微細藻類（へマトコッカス）の濃度が 10⁵オーダーの場合、低栄養培地を用いると、ある程度まで、微細藻類は増殖するが、窒素源の量が少ないため、増殖はすぐに止まる。このような場合、低栄養培地は、後述するように、一段階で（回分的に）増殖とシスト化を連続して行う場合に適した培地である。さらに、 N/P比（モル比）を 1 0〜30に、好ましくは 15〜20に調整することにより、シスト化へスムーズに導くことができる。

培養開始時の微細藻類の濃度がさらに高い場合、上記富栄養培地を用いて、上記培養を行うことができる。

このように、培地の組成は、種々の条件を考慮して決定することができる。なお、本発明で用いる培地には、酢酸、グルコースなどの有機炭素源がほとんど含まれないため、長期間の培養でも、雑菌の混入はほとんどない。

(培養装置） P T/JP2005/008274

微細藻類の培養装置は、二酸化炭素が供給でき、かつ培養液に光照射ができる装置であれば、特に制限はない。例えば、小スケールの場合は、扁平培養ビン、大スケールの場合は、ガラス製、プラスチック製などの透明板で構成された平板培養槽、照明器を備えた撹拌機つきのタンク型培養槽、チューブ型培養槽、エアドーム型培養槽、中空円筒型培養槽などが用いられる。また、密閉容器が好ましく用いられる。

(培養条件）

培養条件に特に制限はなく、一般に、微細藻類の培養に用いられる温度、 pHが用いられる。微細藻類の培養は、例えば 1 5〜35°Cで行われ、好ましくは 20〜25°Cで行われる。培養中の ρΗは、 6〜8に保たれることが好ましい。二酸化炭素は、 1〜3 νΖν%濃度の二酸化炭素を含有するガスを、例えば、 0. 2〜2 V vmとなるように吹き込むことで、供給される。平板培養槽を用いる場合、この二酸化炭素の供給により、培養液が撹拌され、微細藻類に対して光照射が均一に行われる。

(光照射）

微細藻類の培養においては、通常、光合成有効光量子束密度（PPFD) を l O O zmo 1— ρ h o t o n /m ² s (以下、単位を m o 1― /m ² sと略す）程度となるように光を照射するが、キサントフィルの生成量を増加させる観点からは、 300 1-p/m² s以上であることが好ましく、 500 πιο 1— p/m² s以上であることがより好ましい。このような P P FDが大きい光を培養開始時からシスト化までの培養過程全般に亘つて照射することにより、ァスタキサンチンの生産量が大きくなる。なお、 PPF Dは、 L I COR— 190 S A平面光量子センサー（L I COR I n c. , L i n c o l n, USA) を用いて、測定した光量子束密度であり、培地を入れていない培養装置の中央部にセンサーを配置し、光を照射して測定した値である。ガラス、アクリル樹脂などの透明板で構成された装置の場合、透明板を通過してくる P P F Dを測定し、所定の P P F Dとなるように光の照度あるいは光源の距離を決定し、光源を配置すればよい。

. (培養方法）

培養は、上記培地、培養装置、培養条件などを適宜選択して組合せ、光照射下、行われる。培養方法には、 2つの方法がある。一つは、シスト化した微細藻類を栄養培地に接種して増殖させ、シスト化させるまでを連続して、同一の培地で行う、 1段階培養法である。他の一つは、シスト化した微細藻類を増殖させる培地とシスト化させる培地とを分離し、増殖とシスト化を別々に行う 2段階培養法である。

1段階培養法は、シスト化した微細藻類を接種してから培養終了までの間、培地を交換することなく連続的に培養する方法である。すなわち、所定の培地で、同一培養槽内で、微細藻類の増殖およびシスト化を行う方法である。この 1段階培養法は、連続培養には不向きであり、回分的に行われることが好ましい。この 1段階培養法では、微細藻類はいつたん増殖するが、培地中の栄養成分の消費による栄養飢餓ストレス、光照射によるストレス、高温による温度ストレス、塩^^ナトリウムの添力 0によるストレスなどを受けて、増殖後、シスト化状態にスムーズに移行する。

キサントフィルを含有する微細藻類、好ましくはシスト化した微細藻類が栄養培地に接種されると、キサントフィルを含む遊走子を 2 ⁿ個（n = l〜 4 ) 放出する。この遊走子がキサントフィルを含んだまま栄養細胞となるので、キサントフィルを含む栄養細胞の数が増加する（微細藻類が増殖する）。さらに、栄養細胞は、細胞分裂により、増殖する。このキサントフィルを含有する栄養細胞をシスト化することにより、もともと有していたキサントフィルに加えて、新たにキサントフィルが蓄積されることから、キサントフィル含量が高められる。

ところで、栄養細胞が増殖を続けると、細胞内のキサントフィル濃度が低下すると考えられるので、増殖は、キサントフィルが細胞内に残っている状態で停止させることが好ましい。

ある程度栄養細胞が増殖した時点で、微細藻類の増殖を停止させるためには、培地を栄養飢餓になるように設計することが好ましい。そのため、 1段階培養法では、培地として、窒素源濃度が低い培地、例えば、上記低栄養培地が好ましく用いられる。接種するシスト化細胞の量が多い場合は、上記のように、窒素源濃度が高い培地、例えば、上記富栄養培地を用いてもよい。なお、低栄養培地で微細藻類の生育が不十分である場合、富栄養培地ある Vヽは低栄養培地を追加して、所望の濃度まで微細藻類を増殖させてもよい。また、低栄養培地を用いる場合、 NZP比（モル比）を 1 0〜3 0の間に調整しておくと、増殖後スムーズにシスト化させることができる。

1段階培養法は、工程の管理が簡便であること、高濃度のキサントフィルを含有する微細藻類が簡便に得られること、別の培養槽に移し替える必要がないため、雑菌の混入が防止できること、培養槽が一つで済むことなどの利点がある。

2段階培養法は、シスト化した微細藻類を増殖させ、ついで、シスト化培地に移送して、シスト化を行う方法である。すなわち、 2段階培養法では、まず、シスト化した微細藻類を富栄養培地または低栄養培地に、好ましくは富栄養培地に接種して微細藻類を増殖させる第 1工程と、この微細藻類を回収して、窒素源をほとんど含まないシスト化培地に移行して、シスト化する第 2工程からなる。

第 1工程における微細藻類の増殖は、キサントフィルが栄養細胞に残存している間に終了させる必要があるため、栄養培地での培養は短時間で行われる。培養の開始時に富栄養培地を用いて培養すると、栄養細胞の増殖速度が、低栄養培地で培養した場合増殖速度よりも速いので、富栄養培地を用いることが好ましい。増殖終了後、微細藻類は回収され、シスト化培地に移し替えられ、第 2工程のシスト化が行われる。

この第 1工程と第 2工程は、それぞれ、別の培養槽で回分的に行ってもよい。第 1工程終了後、増殖した微細藻類を洗浄、回収し、同一培養槽に戻して、第 2工程を行ってもよい。

この 2段階培養法でも、キサントフィル含量が高い微細細胞が得られる。この 2段階培養法は、 1段階培養法に比べて、増殖工程が短時間ですむという利点があるが、途中に増殖した微細藻類を移し替える操作が必要となる。得られたシスト化微細藻類の一部はキサントフィルの回収に、残りの一部は、再度、栄養培地への接種のために用いてもよい。

(キサントフィルの回収）

微細藻類のシスト化により、キサントフィルが微細藻類内に蓄積されるので、藻類を回収後、常法により、キサントフィルを回収することができる。例えば、機械的に微細藻類を破壌した後、有機溶媒により抽出するなどの方法が適用される。

(実施例）

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、この実施例が本発明を制限するものではない。

なお、この実施例において、クロロフィル、キサントフィル、および乾燥藻体を測定したが、その測定法は以下の通りである。

(クロロフィルの測定）

培養液を 5 m l採取し、遠心分離（3 5 0 0 r p m、 5分）して、微細藻類を回収する。微細藻類をボルテックスして分散させ、ジメチルスルホキシド（DM S O) を 5 m l加えて分散して、 3 0分間遮光静置した。その後、 7 0 °Cの恒温槽で 1 0分間、加熱処理し、遠心分離で DM S O画分を回収した。沈殿部分が着色している場合、さらに DM S Oを 5 m 1添加して、上記操作を繰り返す。この操作は、細胞の色が白色になるまで、繰り返す。回収した DMSO画分を併せ、 672 nmの吸光度を、分光光度計（日立分光光度計 U— 3210) を用いて測定する。クロロフィルの濃度は、以下の式で求められる。

クロロフィル濃度 gZm l ) =13. 9 X希釈倍率 X吸光度

(キサントフィルの測定）

培養液を 5ml採取し、遠心分離（3500 r pm、 5分）して、微細藻類を回収する。微細藻類をボルテックスして分散させ、 5質量％のKOHを含む 30 (v/v) %メタノール水溶液を 5m 1加えて、緑藻をボルテックスし、分散させ、 70°Cの恒温水槽で 10分間処理する。この処理により、クロロフィルが分解される。再度、遠心分離（3500 r pm、 5分）を行い、沈殿を回収する。ボルテックス後、酸（例えば酢酸）を用いて、残留ァルカリを中和する。中和後、 DMSOを5ml'加ぇ、 20分間遮光静置し、さらに 70°Cで 10分間、処理する。遠心分離（3500 r pm、 5分）により、上清を回収する。沈殿部分が着色している場合、さらに DMSOを 5 m l添加して、上記操作を繰り返す。この操作を細胞の色が白色になるまで、繰り返す。回収した DMSO画分を併せ、 492 nmの吸光度を測定する。キサントフィルの濃度は、以下の式で求められる。

キサントフィル濃度（/ gZni l ) =4. 5 X希釈倍率 X吸光度なお、以下の実施例で使用するへマトコッカス ·プルビアリスが生産するキサントフィルは、ほとんどがァスタキサンチンである。上記キサントフィルの測定方法がァスタキサンチンの測定にも適用される。

(微細藻類の乾燥質量) 所定量の培養液を採取し、 GC 50ガラス繊維ろ紙（TOYO ' ADVA NT EC製）上で吸引濾過し、無機塩類を溶解するため、 pH4の塩酸水溶液 5 m 1で 2回洗浄した。その後、ろ紙ごと、 105 °Cの恒温乾燥機で 3時間乾燥させ、真空デシケーター中で 1時間、室温まで冷却し、乾燥質量を測定した。なお、 GC 50ガラス繊維ろ紙は、予め、上記恒温乾燥機で、 10 5°C、 1時間乾燥させて、その質量を測定しておいた。 ,

(実施例 1 )

(前培養：増殖のためのシスト化細胞の取得）

ンを生産するへマトコッカス ·プルビアリス K0084株（以下、単に K0084株という）を用いた。 1. 5 L、ライトパス 25 mmの密閉式扁平培養瓶に、以下の表 1に示す M BG- 1 1培地を 1 L入れ、初発の濃度が 0. 6 gZLとなるように K00 84株を接種した。なお、 MBG— 1 1培地の N/P比は 20である。

3容積％の C〇₂を含むガスを 600m 1 /分の速度で（すなわち、 0. 6 v vmで）通気しながら、培養温度 25°C、 p Hを 6〜 8の間で調整し、以下に示す光照射条件下で 5日間培養した。

光照射は、光源として白色蛍光灯（National製、 F L 40 S SW/37) を用いた。光照射の強度は、 L I COR— 190 S A平面光量子センサーを用いて測定した培養槽受光方向の P P FDが 100 μπιο 1一 p/m² sとなるように、光照射の強度を調整した。

培養後の K0084株は、緑色から、茶色ないし茶褐色に変色しており、シスト化したことが確認された。このシスト化した K0084株は、乾燥質量あたり 1. 2%のァスタキサンチンを含有していた。この方法で得られた、栄養培地への接種に用いるシスト化細胞の顕微鏡写真を図 1に示す。

(本培養：シスト化細胞の増殖および増殖した細胞のシスト化）

上記と同じ扁平培養瓶を用い、同じ培地（MBG—l 1培地) に、初発の濃度が 0. 6 gZLとなるようにシスト化した K0084株を接種し、上記と同じ培養条件で培養した。

培養の経過を、図 1〜4および図 5を参照しながら説明する。培養開始時の K0084株は、図 1に示すように褐色をしており、上記のように、ァスタキサンチンの含有量は約 1. 2%であった。培養開始後、図 5 (c) および（d) に示すように、ァスタキサンチンの含有率（乾燥藻体あたりのァスタキサンチン含量）はいつたん低下するのに対して、クロロフィルの含有率 (乾燥藻体あたりのクロロフィル量）は上昇する。そして、約 50時間目からは、これが反転する。すなわち、 50時間目以降、ァスタキサンチンの含有率は上昇に転じ、クロロフィルの含有率は減少に転じる。この 50時間目は、増殖が停止し、シスト化に転じる時期と思われる。

50時間目の細胞の顕微鏡写真を図 2に示す。図 2からわかるように、シスト化したへマトコッカス細胞は、赤色を帯びた遊走子を含んでいる。この遊走子が放出され、栄養細胞に変化していることもわかる。すなわち、遊走子から生じた細胞の細胞壁の内側にクロロフィルの蓄積と思われる緑色の層が見られた。

さらに培養を続けると、ァスタキサンチン含有率は徐々に上昇し、クロ口フィルは減少する。培養開始から 2 0 0時間目の細胞の顕微鏡写真を図 3に、 3 5 0時間目の顕微鏡写真を図 4に示す。 2 0 0時間経過した図 3の細胞は細胞のサイズが大きくなるとともに、細胞の内側に形成された緑層（クロ口フィル層）のさらに内側に褐色のァスタキサンチンが蓄積していることがわかる。 3 5 0時間目には、さらに細胞のサイズが増大し、細胞壁の内側が赤色の内容物で占められていることがわかる。これらの経過は、図⁵ (A) の細胞濃度の経時的増加、図 5 ( B ) のァスタキサンチン濃度の経時的増加とよく一致する。 3 5 0時間目の培養結果を表 2に示す。

(比較例 1 )

K 0 0 8 4株のシスト化していない栄養細胞を MB G— 1 1培地に接種したこと以外は実施例 1と同様にして、 3 5 0時間培養した。結果を表 2に示す。，表 2

表 2からわかるように、シスト化した微細藻類（へマトコッカス）.を接種して増殖させ、シスト化させることにより、栄養細胞を接種して増殖させてた場合に比べて、ァスタキサンチンの濃度および含有率が高くなることがわかる。 (実施例 2)

シスト化した微細藻類を栄養培地で増殖させ、ついで、シスト化培地に移し替える 2段階培養について、検討した。

以下の表 3に示す培地を調製した。表 3の BG— 11培地は、実施例 1の 1段階培養に用いた MB G— 1 1培地の硝酸カリウム（KN〇3) 0. 41 gの代わりに、硝酸ナトリウムを 1. 5 gZL含む富栄養培地である。一方、 NBG— 1 1培地は、硝酸ナトリゥムあるいは硝酸力リゥムという窒素源を含まず、また、リンも含まない、シスト化培地である。表 3

実施例 1と同一条件で培養し、シスト化した K0084株を回収し、洗浄して、表 3の BG—11培地 1 Lに、初発の濃度が 0. 6 gZLとなるように接種し、 PPFDが 300 /zmo 1 -p/m² sとなるように、光照射の強度を調整したこと以外は実施例 1と同様の培養条件で、培養を開始した。 120時間（5日）後に K0084株を回収し、 NBG— 1 1.培地（シスト化用培地）に接種して、同じ扁平培養瓶を用い、同じ培養条件でさらに培養を,継続した。 400時間培養後の結果を表 4に示す。

(実施例 3)

一方、培地として MBG— 1 1を用い、 PPFDが 300 μπιο 1 - / m² sとなるように光照射の条件を調整したこと以外は実施例 1と同様の培養条件で、シスト化細胞を接種して 1段階で培養を行った。 400時間培養後の結果を表 4に示す。

(比較例 2)

栄養細胞を B G— 1 1培地に接種したこと以外は、実施例 2と同様にして. 2段階培養を行つ fこ。 400時間培養後の結果を表 4に示す。表 4

*1) 乾燥藻体あたりのキサントフィル含量この結果は、'シスト化した微細藻類あるいはァスタキサンチンを含む微細藻類を増殖させ、シスト化させることにより、ァスタキサンチン含量が高い微細藻類を得ることができることを示している。そして、 1段階培養法およぴ 2段階培養法のいずれの方法も、ァスタキサンチン含量の高い微細藻類を得る方法として、有用であることを示している。産業上の利用可能性

本発明は、キサントフィルを含有する微細藻類、例えば、シスト化した微細藻類を接種して増殖させ、シスト化させることにより、キサントフィルを高濃度で含有する、シスト化した微細藻類が得られる。また、得られたシスト化した微細藻類の一部は、次の培養に用いられる。そのため、微細藻類による、効率的なキサントフィルの培養生産方法として、産業上有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 光合成微細藻類からキサントフィルを製造する方法であって、

キサントフィルを含有する光合成微細藻類を栄養培地に接種して増殖させる工程；および、該増殖した微細藻類をシスト化させる工程を含む、方法。

2 . 前記キサントフィルを含有する光合成微細藻類が、シスト化された光合成微細藻類である、請求項 1に記載の方法。

3 . 前記増殖工程およびシスト化工程が同一培養槽内で行なわれる、請求項 1または 2に記載の方法。

4 . 前記増殖工程およびシスト化工程が、低栄養培地を用いて行われる、請求項 1から 3のいずれかの項に記載の方法。

5 . 前記増殖工程おょぴシスト化工程が回分培養で行われる、請求項 1から 4のいずれかの項に記載の方法。

6 . 前記増殖工程およびシスト化工程が、それぞれ異なる培地を用いて行なわれる、請求項 1または 2に記載の方法。

7 . 前記増殖工程およびシスト化工程が、それぞれ回分培養で行なわれる、請求項 6に記載の方法。

8 . 前記増殖工程およびシスト化工程が、光照射下行われる、請求項 1から 7のいずれかの項に記載の方法。

9. 前記微細藻類がへマトコッカス属に属する緑藻である、請求項 1から 8 のいずれかの項に記載の方法。

10. 前記緑藻がへマトコッカス 'プルビアリスである、請求項 1から 9のいずれかの項に記載の方法。

1 1. 前記キサントフィルがァスタキサンチンである、請求項 1から 10のいずれかの項に記載の方法。

12. キサントフィルを含有する遊走子を有する光合成微細藻類。