WO2018056160A1 - アスタキサンチンの生産方法 - Google Patents

アスタキサンチンの生産方法 Download PDF

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astaxanthin
red
led
blue light
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泉田　仁
英治 大橋
徹 沼沢
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日本水産株式会社
バイオジェニック株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the present invention relates to an efficient production method of astaxanthin. More specifically, the present invention relates to light irradiation during a green stage culture period when culturing microalgae that produce astaxanthin.
  • Astaxanthin is a kind of red-orange carotenoid, and is a pigment mainly contained in marine organisms such as crustaceans such as shrimp and crab, salmon, salmon roe, coral and algae.
  • This astaxanthin is known to have a strong antioxidant action, and is used as a food coloring, cosmetics, health food, pharmaceuticals and the like.
  • Astaxanthin is produced by chemical synthesis or culture of bacteria, yeast, microalgae, and the like.
  • astaxanthin obtained by culturing the microalgae of the genus Haematococcus (hereinafter referred to as Haematococcus algae) has an astaxanthin content of 2% by weight or less per dry weight of bacteria and yeast.
  • Astaxanthin is produced by, for example, microalgae such as Haematococcus algae, Chlorella, Senedesmus.
  • Haematococcus algae are cysted by changes in the external environment and accumulate astaxanthin in the algae.
  • irradiation with sunlight or artificial light is required.
  • a light source for artificial light a fluorescent lamp, an LED (light emitting diode) or the like is used.
  • the microalgae that produce astaxanthin is an appropriate light-irradiated culture condition, a green floating state with two zoospores, motility and cell proliferation (green stage), temperature, strong light, salt It is known that there is a state (red stage) in which floating cells change to cyst cells due to stress such as nutrient depletion, and astaxanthin accumulates in the cells. Astaxanthin is hardly contained in floating cells, but astaxanthin accumulates at a high concentration during the period of cyst cells.
  • patent document 1 when the inventors cultured microalgae to produce astaxanthin, the blue light LED and the red light LED are used in combination during the culturing period of the red stage after cyst formation. It reports that production efficiency can be increased. Regarding light irradiation during the culture period of the green stage before cysting, it is considered to use blue light and red light in combination with the absorption wavelength of chlorophyll, and reports such as Patent Documents 2 to 5 have been reported. In both cases, the combined use of blue light and red light increases the growth of algae and increases the amount of algal bodies (the number of floating cells) in the culture solution.
  • An object of the present invention is to provide a method for further improving the production efficiency of the astaxanthin culturing method using LEDs with low power and low calorific value.
  • An object of the present invention is to produce astaxanthin with high efficiency by using an LED that is power-saving and can suppress a temperature rise in a portion that transmits light.
  • Patent Documents 2 to 5 disclose that the amount of algal bodies in the culture solution is increased by irradiating blue and red light during the cultivation period of the green stage, but the production amount of astaxanthin is also increased. Whether or not to do so has not been studied. Therefore, it has only been disclosed that the photon flux density of blue and red light is equal or strong under red.
  • the inventors of the present application increased the amount of astaxanthin in the algal body by increasing the photon flux density of the blue light relative to the red light by increasing the photon flux density of the blue light in the green stage culture, As a result, it was found that the production amount of astaxanthin in the culture broth was increased, and the present invention was completed.
  • blue light LED with peak wavelength of 420-500nm and red light LED with peak wavelength of 620-690nm are blue light than conventional technology in the green stage of microalgae cultivation.
  • astaxanthin can be efficiently produced by increasing the photon flux density of the LED and culturing while simultaneously irradiating.
  • continuous light irradiation is preferred. That is, as the amount of irradiated light increases, the content of astaxanthin at the red stage increases, and as a result, astaxanthin production efficiency is higher than when the light is alternately switched.
  • the gist of the present invention is the following astaxanthin production methods (1) to (8).
  • (1) In a method for producing astaxanthin in which microalgae are cultured to produce astaxanthin in the alga, light irradiation during the green stage culture period of microalgae is performed with a blue LED having a peak wavelength of 420 to 500 nm and a peak wavelength of 620.
  • the light irradiation during the red stage culture period of microalgae is performed by using a blue light LED having a peak wavelength of 420 to 500 nm and a red light LED having a peak wavelength of 620 to 690 nm (1).
  • Any astaxanthin production method (6) The astaxanthin production method according to (5), wherein the ratio of the photon flux density between the blue light LED and the red light LED during the red stage culture of microalgae is 1: 1 to 20: 1.
  • the astaxanthin production method according to (5) or (6), wherein the photon flux density of the blue light LED and the red light LED is 20 to 1000 ⁇ mol / m 2 / s during the red stage culture period.
  • astaxanthin can be produced efficiently without greatly changing the conventional astaxanthin production method and apparatus.
  • the present invention relates to a method for producing astaxanthin using microalgae.
  • microalgae culture in the green stage (green, two zoospores, motility, state of floating cells with high cell proliferation, cystation Before culturing), a blue light LED with a peak wavelength of 420 to 500 nm and a red light LED with a peak wavelength of 620 to 690 nm are converted into a microalgae so that the ratio of photon flux density is 2: 3 to 20: 1. Irradiating.
  • microalgae capable of producing astaxanthin can be used.
  • the microalgae here is limited to those that carry out photosynthesis.
  • microalgae cyanobacteria, red algae, brown algae, green algae, diatoms, and true-eye algae are known, but the microalgae of the present invention is limited to microalgae capable of producing astaxanthin.
  • microalgae that produce astaxanthin microalgae belonging to the genus Hematococcus (hematococcus algae) are generally used.
  • Haematococcus droebakensi H. droebakensi
  • Haematococcus zimbabwiensis down cis H. zimbabwiensis
  • Haematococcus lactis and Hematococcus prubiaris are preferably used.
  • microalgae that produce astaxanthin can be used.
  • Chlorella zone fin donation cis is Chlorella (Chlorella zofingiensis), mono Rafi Day um genus (Monoraphidium sp.) Of the microalga, Other Vischeria helvetica, Coelastrella, Scenedesmus, Chlamydomonas nivalis, Protosiphon botryoides, etc. Neochloris wimmeri be able to.
  • an autotrophic medium which does not contain a carbon source in order to prevent the contamination of a culture medium.
  • an autotrophic medium containing nitrogen necessary for growth, trace metal inorganic salts, vitamins and the like is used.
  • media such as VT media, C media, MC media, MBM media, MDM media (see Algae Research Method Mitsuo Chihara and Kazutoshi Nishizawa, Kyoritsu Shuppan (1979)), BG-11 media, and modified media thereof Etc. are used.
  • aerate air containing carbon dioxide when culturing microalgae in a medium, it is preferable to aerate air containing carbon dioxide. Cultivation can also be carried out by aeration with air that does not contain oxygen dioxide. However, since the growth of microalgae is slowed, the culture is carried out by aeration with air containing 0.1 to 5% carbon dioxide, preferably 0.5 to 3% carbon dioxide. Cultivation is possible without aeration, but for good growth, the aeration rate is 0.01 to 3.0 vvm, preferably 0.015 to 1 vvm, and the pH is 5 to 10, preferably 6 to 9.
  • the culture temperature is, for example, in the range of 10 to 45 ° C., preferably in the range of 18 to 38 ° C., taking the case of using Haematococcus lactoris and Haematococcus prubiaris as an example.
  • the pH of the medium is adjusted to a range of 5.0 to 9.5, preferably 6.0 to 9.0.
  • a microalgae For light irradiation on the green stage for astaxanthin production, a microalgae is used in combination with a blue light LED having a peak wavelength of 420 to 500 nm and a red light LED having a peak wavelength of 620 to 690 nm.
  • a blue light LED having a peak wavelength of 420 to 500 nm
  • a red light LED having a peak wavelength of 620 to 690 nm.
  • the irradiation method which blinks blue light LED and red light LED alternately may be used. It is also possible to irradiate intermittently with an interval.
  • “intermittent irradiation” includes irradiation with pulsed light. If light irradiation is performed intermittently, power consumption can be reduced. However, continuous light irradiation is preferred to increase production efficiency. That is, as the amount of irradiated light increases, the astaxanthin content at the red stage increases, and as a result, the astaxanthin production efficiency is higher than when the light is alternated.
  • continuous irradiation does not mean that there is no interruption for 24 hours, but at least 12 hours in one day, preferably 15 hours or more, more preferably 18 hours or more, 21 hours or more, most preferably 24 hours, It means irradiating both blue light and red light.
  • a light source in the light irradiation process an LED, a light bulb, a fluorescent lamp, or the like can be used.
  • the light source other than the LED needs to cut unnecessary light because the wavelength spectrum of the light source used is wide. As a result, the efficiency becomes worse.
  • an LED it is possible to irradiate light with a narrow wavelength range without requiring a special means such as cutting off a part of light, and astaxanthin can be efficiently produced with less irradiation energy.
  • organic EL lighting may be used.
  • a plurality of LED chips are provided so that efficient irradiation can be performed.
  • the light sources are arranged at equal intervals from each other in order to enable as uniform light irradiation as possible.
  • multiple blue and red LED chips may be used as independent panels for irradiation, or multiple blue and red LED chips are embedded in the same panel at a fixed rate. May be used for irradiation.
  • the wavelength of the blue light LED to be irradiated has a peak wavelength in the range of 420 to 500 nm, preferably 430 to 490 nm, and the wavelength of the red light LED is in the range of 620 to 690 nm, preferably 630 to 680 nm.
  • Two or more types of light having different peak wavelengths can be used for both the blue light LED and the red light LED.
  • irradiation can be performed using a blue light LED having a peak wavelength of 430 nm and 470 nm and a red light LED having a peak wavelength of 630 nm and 660 nm. It is preferable to use light having a narrow wavelength width for both the blue light LED and the red light LED. This is because more efficient astaxanthin production can be achieved by selecting and irradiating only light in a wavelength region suitable for astaxanthin production.
  • the ratio of the blue light LED and the red light LED cage that simultaneously irradiates the microalgae during the green stage culture is from 2: 3 to 20: 1, preferably from 1: 1 to 20: 1, from 3: 2 to the photon flux density.
  • 20: 1, 3: 2 to 10: 1, 2: 3 to 3: 1, 2: 1 to 10: 1, 2: 1 to 5: 1, 2: 1 to 4: 1, and 2: 3 to 5: 1, 2: 3 to 3: 1, 2: 1 to 3: 1 are particularly preferable.
  • Haematococcus algae such as Haematococcus laxtris and Haematococcus pluvialis are green floating cells that are motile and proliferate, and extreme environments such as temperature, strong light, salt, water content, nutritional status, etc.
  • cyst cell states that cyst due to the stress of change. When cysts are formed, astaxanthin accumulates in the algae and turns red.
  • Light irradiation using a blue light LED having a peak wavelength of 420 to 500 nm and a red light LED having a peak wavelength of 620 to 690 nm can also be used in a cyst cell state (red stage) in which astaxanthin is accumulated in the cell.
  • the red stage may be natural light, white color, or red light, but it is preferable to use a blue light LED and a red light LED in combination. In this case as well, it is more preferable to increase blue light (see Patent Document 1).
  • the green stage of Haematococcus algae has many motility floating cells and low cell density, it can grow well even if the photon flux density is 20 ⁇ mol / m 2 / s or less.
  • the photon flux density of the green stage is not particularly limited as long as the cells do not grow, become cysts or die, but for example, if the culture device has a light transmission width (diameter, thickness) of 100 mm or less, the peak wavelength 420 to 500 nm blue light LED and peak wavelength 620 to 690 nm red light LED are respectively 5 to 100 ⁇ mol / m 2 / s, preferably 10 to 70 ⁇ mol / m 2 / s, more preferably 20 to 50 ⁇ mol / m 2 / s.
  • Astaxanthin can be efficiently produced by irradiation with s.
  • a blue light LED with a peak wavelength of 420 to 500 nm and a red light LED with a peak wavelength of 620 to 690 nm are each 10 to 200 ⁇ mol / m 2.
  • Astaxanthin can be produced efficiently by irradiation with / s, preferably 20 to 150 ⁇ mol / m 2 / s, more preferably 30 to 100 ⁇ mol / m 2 / s.
  • the photon flux density of the red stage is not particularly limited, but for example, culture with a light transmission width (diameter, thickness) of 70 mm or less
  • a blue LED having a peak wavelength of 420 to 500 nm and a red LED having a peak wavelength of 620 to 690 nm are each 20 ⁇ mol / m 2 / s or more, preferably 50 ⁇ mol / m 2 / s or more, more preferably 100 ⁇ mol.
  • Astaxanthin can be efficiently produced by irradiation at / m 2 / s or higher, 150 ⁇ mol / m 2 / s or higher, or 300 ⁇ mol / m 2 / s or higher. If the culture apparatus has a light transmission width larger than that, it may be further increased. That is, when cultivating red stage Haematococcus algae, astaxanthin can be efficiently produced by irradiating both the blue light LED and the red light LED.
  • the upper limit is not particularly photon flux density, is preferably from 3000 ⁇ mol / m 2 / s of the balance between energy cost and effectiveness, 1000 ⁇ mol / m 2 / s or less is particularly preferred.
  • the light source in the red stage is not particularly specified. Natural light or fluorescent light can be used, but astaxanthin can be produced most efficiently by using a blue light LED having a peak wavelength of 420 to 500 nm and a red light LED having a peak wavelength of 620 to 690 nm.
  • the method for recovering astaxanthin from the culture solution is not particularly limited.
  • microalgae culture solution containing astaxanthin is separated by solid-liquid separation means such as filtration and centrifugation, and then microalgae cells are collected and then dried (natural drying, drum drying, hot air drying, spray drying, freeze drying, etc.) By doing so, a dried product of microalgae can be obtained.
  • the obtained dried microalga contains astaxanthin (as a free form) at a concentration of 1 to 10% by mass. Preferably, it is contained at a concentration of 4 to 10% by mass.
  • a component containing astaxanthin can be obtained by crushing, extracting and collecting the wet algal body containing astaxanthin or the dried product.
  • astaxanthin is extracted after mechanically destroying dried microalgae.
  • the extraction method include a chemical extraction method using an organic solvent such as chloroform, hexane, acetone, methanol, and ethanol, and an edible oil and fat, or a physical extraction method by pressing a dry product of green algae. Or you may extract and collect
  • the extraction solvent is distilled off to obtain an astaxanthin-containing oil.
  • the microalgae culture apparatus for producing astaxanthin can supply carbon dioxide and can irradiate the culture solution with a blue light LED having a peak wavelength of 420 to 500 nm and a red light LED having a peak wavelength of 620 to 690 nm.
  • a flat culture bottle having a thickness of about 10 to 50 mm and a glass tube having a diameter of about 20 to 70 mm are preferably used.
  • a large scale it is composed of a plastic bag, glass or plastic tube or transparent plate, and a culture tank equipped with an illuminator and a stirrer is used as necessary.
  • the light transmission width is preferably 400 mm or less, more preferably 70 mm or less.
  • a culture tank for example, a plate culture tank (flat panel culture algae), a tube type culture tank, an air dome type culture tank, a hollow cylindrical culture tank, a tank type internally lit culture tank, or the like is used.
  • a sealed container is preferably used.
  • a type in which a tube is wound around an LED as disclosed in JP 2012-29578 A or a hybrid type reactor as disclosed in JP 2014-39491 can be used.
  • astaxanthin culture There are two types of astaxanthin culture: a type that is provided outdoors and uses sunlight, a type that is provided indoors and that uses artificial light, and a type that uses both.
  • the method using sunlight does not incur energy costs and can be manufactured at a low cost.
  • the quality may be deteriorated due to congestion, contamination, and the like.
  • the present invention can be used for any type. Even when natural light is used, at least during the green stage of the culture period, irradiation with a 420-500 nm blue light LED and a red light LED with a peak wavelength of 620-690 nm is used, and the photon flux density of the blue light LED is increased.
  • the effect of the present invention can be obtained by using it together with the photon flux density higher than that of the red LED.
  • a blue light LED with a wavelength of 420 to 500 nm and a red light LED with a peak wavelength of 620 to 690 nm are used in combination.
  • Other light sources such as fluorescent lamps may be used during the red stage period, but blue light and red light may be used in combination as in the astaxanthin production culture period.
  • the ratio of the photon flux density between the blue light and the red light during the red stage is preferably 1: 1 to 20: 1, more preferably 1: 1 to 5: 1 and 3: 2 to 4: 1.
  • the culture in the green stage period is performed at a ratio of the photon flux density of the blue light LED and the red light LED at 2: 3 to 5: 1, and the red stage period is performed at 1: 1 to 5: 1.
  • the green stage period is 3: 2 to 5: 1 and the red stage period is 3: 2 to 5: 1 is exemplified.
  • Hematococcus culture green stage
  • Hematococcus lactoris NIES144 strain National Institute for Environmental Microbiology Preservation Facility Storage
  • BG11 modified A medium Table 1
  • Red LED wavelength 660 nm
  • blue LED wavelength 450 nm
  • the cells were cultured for 5 days with aeration and agitation.
  • the spectrum of the blue light LED and red light LED used in the experiment is shown in FIG. After 14 days of culture, dried alga bodies were obtained by filtration. The weight of the dry algal bodies was measured, and the dry algal body weight per culture broth was determined. Moreover, the astaxanthin content in the dry alga body and the astaxanthin production amount per culture solution were determined by reverse phase HPLC.
  • the astaxanthin content in the alga body is increased by simultaneously irradiating the green stage with the blue light LED and the red light LED, and as a result, the production amount of astaxanthin per culture solution can be increased. confirmed.
  • the amount of energy used can be reduced and the amount of astaxanthin produced per culture solution can be increased.

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Abstract

微細藻の培養によるアスタキサンチンの生産方法の効率を高めるである。微細藻を培養して藻体内にアスタキサンチンを生産させるアスタキサンチンの生産方法において、微細藻のグリーンステージ培養期間中の光照射を、ピーク波長が420～500nmの青色光LEDとピーク波長が620～690nmの赤色光LEDを併用し、青色光LEDと赤色光LEDの光量子束密度の比が２：３～２０：１で行うことを特徴とするアスタキサンチンの生産方法である。青色光LEDと赤色光LED の光量子束密度はそれぞれ5～200μmol/m2/sが好ましい。

Description

アスタキサンチンの生産方法
　本発明は、アスタキサンチンの効率的な生産方法に関する。さらに詳しくは、アスタキサンチンを生産する微細藻を培養する際のグリーンステージ培養期間中の光照射に関する。
　アスタキサンチンは、赤橙色のカロテノイドの一種で、エビやカニなどの甲殻類や、鮭、イクラ、鯛、藻類など、主に海の生物に多く含まれる色素である。このアスタキサンチンは、強力な抗酸化作用を持つことが知られ、食品用色素、化粧品、健康食品、医薬品などとして使用される。
　アスタキサンチンは、化学合成、又は、細菌、酵母、微細藻などの培養により生産されている。微細藻の中でもヘマトコッカス属の微細藻（以降、ヘマトコッカス藻）を培養して得られるアスタキサンチンは、細菌、酵母の乾燥重量あたりのアスタキサンチン含有量が2重量%以下であるのに対して、2重量%以上の高含量で培養することができ、またその安全性から世界中で生産されている。ヘマトコッカス藻などの光合成をする微細藻を利用したアスタキサンチンの生産にはその生育に適した光照射が必要である。
　アスタキサンチンは、例えばヘマトコッカス藻、クロレラ、セネデスムスなどの微細藻によって生産される。特にヘマトコッカス藻は、外部環境の変化ストレスによってシスト化し、藻体内にアスタキサンチンを蓄積する。アスタキサンチンの蓄積のためには、太陽光または人工光の照射が必要となる。人工光の光源としては蛍光灯、LED（light emitting diode）等が利用されている。
　アスタキサンチンを生産する微細藻類は、適切な光照射培養条件化、緑色で２本の遊走子を持ち運動性があり細胞増殖がさかんな浮遊細胞の状態(グリーンステージ)と、温度、強光、塩、栄養枯渇などのストレスにより浮遊細胞がシスト細胞へと変化し、アスタキサンチンを細胞内に蓄積する状態（レッドステージ）が存在することが知られている。浮遊細胞にはアスタキサンチンはほとんど含まれないが、シスト細胞の期間はアスタキサンチンを高濃度に蓄積する。
　太陽光のみで培養した場合は、気温変動、日照時間変動に影響されるため、安定かつ効率的な生産が困難である。そのため、人工光の一つである蛍光灯を用いた培養が、古くから試みられている。
　蛍光灯に代わり、低電力でかつ発熱量の少ない光源としてLEDが知られ、LEDを用いてアスタキサンチンを生産することが検討されている。
　本発明者らは、特許文献１において、微細藻を培養してアスタキサンチンを生産する場合に、シスト化後のレッドステージの培養期間に、青色光LEDと赤色光LEDを併用することにより、アスタキサンチンの生産効率を高めることができることを報告している。
　シスト化前のグリーンステージの培養期間中の光照射については、クロロフィルの吸収波長との関係から、青色光と赤色光を併用することが検討され、特許文献２～５などの報告がある。これらはいずれも青色光と赤色光を併用することにより、藻類の成長が高まり、培養液中の藻体量（浮遊細胞数）が増加するというものである。
ＷＯ２０１５／１５１５７７ ＷＯ２０１４／１１９７８９ ＷＯ２０１４／１１９７９２ ＷＯ２０１４／１１９７９４ ＣＮ１０２７６６５７８
　低電力でかつ発熱量の少ないLEDを用いたアスタキサンチン培養方法の生産効率をより高める方法を提供することを課題とする。
　本発明は、省電力であり光を透過する部分の温度上昇を抑えることができるLEDを用いて、効率の良いアスタキサンチンの生産することを目的とする。
　特許文献２～５には、グリーンステージの培養期間中に青色と赤色の光を照射することにより、培養液中の藻体量が増加することが開示されているが、アスタキサンチンの生産量も増加するかどうかについての検討はされていない。そのため、青色と赤色の光の光量子束密度は同等か赤色が強い条件で培養することが開示されるのみであった。
　ところが、本願発明者らは、グリーンステージの培養において、赤色光に対する青色光の光量子束密度を大きくすることにより、藻体量の増加は少ないが、藻体中のアスタキサンチンの蓄積量が多くなり、結果的に培養液中のアスタキサンチン生産量が増加することを見出し、本願発明を完成させた。
　上記目的を解決するために鋭意検討した結果、微細藻の培養のグリーンステージにおいて、ピーク波長が420～500nmの青色光LEDとピーク波長が620～690nmの赤色光LEDを、従来技術よりも青色光LEDの光量子束密度を大きくして、同時に照射しながら培養することで効率よくアスタキサンチンを生産することを見出した。特に、連続して光照射することが好ましい。すなわち、照射した光量が多いほどレッドステージでのアスタキサンチン含量が多くなるため、光を交互にするよりも結果的にアスタキサンチン生産効率が高くなるためである。
　本発明は以下の（１）～（８）のアスタキサンチンの生産方法を要旨とする。
（１）微細藻を培養して藻体内にアスタキサンチンを生産させるアスタキサンチンの生産方法において、微細藻のグリーンステージ培養期間中の光照射を、ピーク波長が420～500nmの青色光LEDとピーク波長が620～690nmの赤色光LEDを併用し、青色光LEDと赤色光LEDの光量子束密度の比が２：３～２０：１で行うことを特徴とするアスタキサンチンの生産方法。
（２）青色光LEDと赤色光LEDの光量子束密度の比が３：２～２０：１である（１）のアスタキサンチン生産方法。
（３）青色光LEDと赤色光LEDによる光照射をグリーンステージ培養期間中連続して行うことを特徴とする（１）又は（２）のアスタキサンチン生産方法。
（４）青色光LEDと赤色光LED の光量子束密度がそれぞれ5～200μmol/m2/sであることを特徴とする（１）ないし（３）いずれかのアスタキサンチン生産方法。
（５）さらに、微細藻のレッドステージ培養期間中の光照射をピーク波長が420～500nmの青色光LEDとピーク波長が620～690nmの赤色光LEDを併用して行うことを特徴とする（１）ないし（４）いずれかのアスタキサンチン生産方法。
（６）微細藻のレッドステージ培養期間中の青色光LEDと赤色光LED の光量子束密度の比が１:１～２０:１である（５）のアスタキサンチン生産方法。
（７）レッドステージ培養期間中の、青色光LEDと赤色光LED の光量子束密度がそれぞれ20～1000μmol/m2/sであることを特徴とする（５）又は（６）のアスタキサンチン生産方法。
（８）微細藻がヘマトコッカス属であること特徴とする（１）ないし（７）いずれかのアスタキサンチン生産方法。
　本発明により、従来のアスタキサンチンの製造方法や装置を大きく変えることなく、アスタキサンチンを効率よく生産することができる。
実施例で用いた青色光LEDと赤色光LEDのスペクトルを示す図である。
　本発明は微細藻を利用したアスタキサンチン生産方法に関し、微細藻の培養において、グリーンステージ（緑色で２本の遊走子を持ち運動性があり細胞増殖がさかんな浮遊細胞の状態であって、シスト化する前まで）の培養時に、ピーク波長が420～500nmの青色光LEDとピーク波長620～690nmの赤色光LEDを、光量子束密度の比を2:3～20:1になるように微細藻に照射することを特徴とする。
　本発明では、アスタキサンチンを生産することができる微細藻を用いることができる。ここでいう微細藻は光合成をするものに限定される。微細藻としては、シアノバクテリア、紅藻、褐藻、緑藻、ケイ藻, 真正眼点藻などが知られているが、本発明の微細藻はアスタキサンチンを生産することができる微細藻に限定される。アスタキサンチンを生産する微細藻としては、ヘマトコッカス属に属する微細藻(ヘマトコッカス藻)が一般的に用いられる。
　ヘマトコッカス藻では、ヘマトコッカス・ラクストリス（Haematococcus lacustris）、ヘマトコッカス・プルビアリス（H. pluvialis）、ヘマトコッカス・カペンシス（H. capensis）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（H. droebakensi）、ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（H. zimbabwiensis）などを用いることができる。中でも、ヘマトコッカス・ラクストリス及びヘマトコッカス・プルビアリスが好ましく用いられる。
　ヘマトコッカス属以外でもアスタキサンチンを生産する微細藻を用いることができる。例えば、クロレラ属であるクロレラ・ゾフィンギエンシス(Chlorella zofingiensis)、モノラフィデイウム属(Monoraphidium sp.)の微細藻、その他にVischeria helvetica、Coelastrella、Scenedesmus、Chlamydomonas nivalis、Protosiphon botryoides、Neochloris wimmeriなどを挙げることができる。
　微細藻の培養に用いる培地としては特に制限がないが、培地の雑菌汚染を防止するために炭素源を含まない独立栄養培地を用いるのが好ましい。一般に、増殖に必要な窒素、微量金属の無機塩、ビタミン類などを含む独立栄養培地が用いられる。例えば、ＶＴ培地、Ｃ培地、ＭＣ培地、ＭＢＭ培地、ＭＤＭ培地などの培地（藻類研究法　千原光雄・西澤一俊編、共立出版（1979）を参照）、ＢＧ－１１培地、およびこれらの改変培地などが用いられる。
　また、培地中で微細藻を培養する際は、二酸化炭素を含む空気を通気することが好ましい。二酸化酸素を含まない空気を通気することでも培養できるが、微細藻の生育が遅くなるため、0.1～5%の二酸化炭素、好ましくは0.5～3%の二酸化炭素含む空気を通気し培養する。通気なしでも培養は可能であるが、良好な生育のためには通気量0.01～3.0vvm、好ましくは0.015～1vvm、またpHは5～10、好ましくは6～9である。
　培養温度としては、ヘマトコッカス・ラクストリス及びヘマトコッカス・プルビアリスを利用する場合を例に採れば、例えば10～45℃ の範囲であり、好ましくは18～38℃ の範囲である。また、培地のｐＨは、5.0～9.5の範囲、好ましくは6.0～9.0の範囲に調整される。
　アスタキサンチン生産のためのグリーンステージにおける光照射は、微細藻をピーク波長が420～500nmの青色光LEDとピーク波長が620～690nmの赤色光LEDを併用する。微細藻のグリーンステージ培養期間中、全期間、あるいは、一定期間、青色光LEDと赤色光LEDの両方を照射することが必要である。青色光LEDと赤色光LEDの両方を照射する場合は、同時に照射することで最も効率よくアスタキサンチンを生産することができるが、24時間以内に青色光LEDと赤色光LEDを交互に照射する方法でも効率よくアスタキサンチンを生産できる。あるいは青色光LEDと赤色光LEDを交互に点滅させるような照射方法でもよい。インターバルを設けて間欠的に照射したりすることもできる。ここでの「間欠的に照射」にはパルス光による照射を含む。光の照射を間欠的に行なえば、消費電力を削減できる。しかし、生産効率を高くするには、連続して光照射することが好ましい。すなわち、照射した光量が多いほどレッドステージでのアスタキサンチン含量が多くなるため、光を交互にするよりも結果的にアスタキサンチン生産効率が高くなる。ここで連続照射とは、２４時間一切途切れることなくという意味ではなく、少なくとも１日のうち１２時間以上、好ましくは１５時間以上、さらに好ましくは１８時間以上、２１時間以上、最も好ましくは２４時間、青色光と赤色光の両方を照射することを意味する。
　光照射工程における光源としては、LED、電球、蛍光灯などを用いることができるが、LED以外の光源は、使用する光源の光の波長スペクトルが広域にわたるため、不要な光をカットすること必要があるため、効率が悪くなる。LEDを用いれば一部の光をカットするといった特別の手段を要することなく波長域を絞った光の照射が可能となるため、少ない照射エネルギーで効率よくアスタキサンチンを生産することが可能になる。LEDとして、有機EL照明を用いてもよい。
　LEDチップは効率的な照射が行えるように複数個備えられることが好ましい。光源を複数個使用する場合にはできるだけ均一な光の照射を可能にすべく、各光源が互いに均等な間隔をおいて配置されることが好ましい。また、青色光LEDと赤色光LEDの複数個のチップを独立したパネルにして照射をしても良いし、青色光LEDと赤色光LEDの複数個のチップを一定割合で同一パネルに埋め込んだパネルを用いて照射してもよい。
　照射する青色光LEDの波長は、ピーク波長が420～500nm範囲であり、好ましくは430～490nm、赤色光LEDの波長は 620～690nm範囲であり、好ましくは630～680nmである。
　青色光LED、赤色光LEDともピーク波長が異なる2種類以上の光を用いることもできる。例えばピーク波長が430nmと470nmの青色光LEDと630nmと660nmの赤色光LEDを用いて照射することもできる。
　青色光LED、赤色光LED共に波長幅の狭い光を用いることが好ましい。アスタキサンチン生産に適した波長領域の光のみを選択して照射することで、より効率的なアスタキサンチン生産ができるからである。
　微細藻をグリーンステージ培養中に同時照射する青色光LEDと赤色光LED の比は、光量子束密度で２:３～２０:１であり、好ましくは１：１～２０：１、３：２～２０：１、３：２～１０：１、２：３～３：１、２:１～１０:１、２：１～５：１、２:１～４:１、さらに、２:３～５:１、２:３～３:１、２:１～３:１が特に好ましい。
　ヘマトコッカス・ラクストリス及びヘマトコッカス・プルビアリスなどのヘマトコッカス藻は、運動性があり細胞増殖がさかんな緑色の浮遊細胞の状態と、温度、強光、塩、水分量、栄養状態などの極端な環境変化のストレスによりシスト化するシスト細胞の状態がある。シスト化すると藻体内にアスタキサンチンを蓄積し、赤色になる。
ピーク波長420～500nmの青色光LEDとピーク波長620～690nmの赤色光LEDを用いた光照射は、アスタキサンチンを細胞内に蓄積するシスト細胞の状態（レッドステージ）でも使用することができる。レッドステージは自然光、白色色、赤色光なででもよいが、青色光LEDと赤色光LEDを併用するのが好ましい。この場合も青色光を強くするのがさらに好ましい（特許文献１参照）。
　ヘマトコッカス藻のグリーンステージは運動性がある浮遊細胞が多く細胞密度も低いため光量子束密度が20μmol/m2/s以下でも良く増殖させることができる。
　グリーンステージの光量子束密度は、細胞が増殖し、シスト化や死滅することがなければ特に限定されないが、例えば、光透過幅(直径、厚さ)が100mm以下の培養装置であれば、ピーク波長420～500nmの青色光LEDとピーク波長620～690nmの赤色光LEDがそれぞれ、5～100μmol/m2/s、好ましくは10～70μmol/m2/s、さらに好ましくは20～50μmol/m2/sで照射することで効率よくアスタキサンチンを生産することができる。また、光透過幅(直径、厚さ)が100mm～400mm以下の培養装置であれば、ピーク波長420～500nmの青色光LEDとピーク波長620～690nmの赤色光LEDがそれぞれ10～200μmol/m2/s、好ましくは20～150μmol/m2/s、さらに好ましくは30～100μmol/m2/s照射することで効率よくアスタキサンチンを生産することができる。
　温度、強光、塩などでストレスをかけてヘマトコッカス藻をシスト化させた後、レッドステージの光量子束密度は特に限定されないが、例えば、光透過幅(直径、厚さ)が70mm以下の培養装置であれば、ピーク波長420～500nmの青色光LEDとピーク波長620～690nmの赤色光LEDそれぞれが20μmol/m2/s以上、好ましくはそれぞれが50μmol/m2/s以上、さらに好ましくは100μmol/m2/s以上、150μmol/m2/s以上、300μmol/m2/s以上照射することで効率よくアスタキサンチンを生産することができる。それ以上の光透過幅の培養装置であれば、更に大きくしてもよい。すなわちレッドステージのヘマトコッカス藻を培養する場合、青色光LEDと赤色光LEDの両方を照射することで効率よくアスタキサンチンを生産することができる。光量子束密度の上限は特にないが、エネルギーコストと効果のバランスから3000μmol/m2/s以下が好ましく、1000μmol/m2/s以下が特に、好ましい。
レッドステージにおける光源は、特に指定されない。自然光や蛍光灯を用いることも可能であるが、ピーク波長420～500nmの青色光LEDとピーク波長620～690nmの赤色光LEDの光源を用いると最も効率よくアスタキサンチンを生産することができる。
　培養液からアスタキサンチンを回収する方法は特に限定されない。例えばアスタキサンチンを含む微細藻培養液をろ過、遠心処理などの固液分離手段により分離して微細藻細胞を集めたのち、乾燥（自然乾燥、ドラム乾燥、熱風式乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥など）することで微細藻の乾燥物を得ることができる。得られた微細藻の乾燥物は、アスタキサンチン（フリー体として）を1～10質量％の濃度で含む。好ましくは、4～10質量％の濃度で含む。
　アスタキサンチンを含む湿藻体または上記乾燥物を破砕処理、抽出、回収することでアスタキサンチンを含む成分を得ることができる。アスタキサンチンの抽出・回収方法に特に制限はなく、当業者が通常用いる方法が用いられる。例えば、微細藻の乾燥物を機械的に破壊した後に、アスタキサンチンが抽出される。抽出方法としては、クロロホルム、ヘキサン、アセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒や食用油脂を用いて抽出する化学的抽出方法、あるいは緑藻の乾燥物の圧搾などによる物理的抽出方法が挙げられる。あるいは、超臨界抽出法を用いて抽出・回収してもよい。抽出溶媒を留去して、アスタキサンチン含有油が得られる。
培養液へのLED光照射方式としては、リアクターに含まれる培養液の外側から照射する外照式照射とリアクターに含まれる培養液中にLEDを投入する内照式照射があるが、その方式に特に制限されず、どちらを使用することも可能である。なお、外照式照射の場合の光量子束密度は、容器の外表面で測定し、内照式照射の場合は培養液と接した容器表面で測定した値を用いる。外照式照射と内照式照射を併用しても構わない。
　アスタキサンチン生産用微細藻培養装置は、二酸化炭素が供給でき、かつピーク波長が420～500nmの青色光LEDとピーク波長が620～690nmの赤色光LEDを併用し培養液に光照射ができる装置であれば、特に制限はない。例えば、小スケールの場合は、厚さ10～50mm程度の扁平培養瓶、直径20～70mm程度のガラスチューブが好ましく用いられる。大スケールの場合は、ビニール袋、ガラス製、プラスチック製などのチューブまたは透明板で構成され、必要に応じて照明器および撹拌機を備えた培養槽が用いられる。大スケールで培養する場合、好ましくは光透過幅(直径、厚さ)が400mm以下、さらに好ましくは70mm以下にすることが好ましい。このような培養槽としては、例えば、平板培養槽(フラットパネル培養藻)、チューブ型培養槽、エアドーム型培養槽、中空円筒型培養槽、タンク型内照式培養槽などが用いられる。また、いずれの場合も、密閉容器が好ましく用いられる。例えば、特開2012-29578に開示されているようなLEDの周囲にチューブを巻きつけるタイプや特開2014-39491に開示されているようなハイブリットタイプのリアクターを用いることができる。
　アスタキサンチンの培養は屋外に設けられ太陽光を利用するタイプと室内に設けられ人工光を用いるタイプと両方を併用するタイプがある。太陽光を利用する方法はエネルギーコストがかからず安価に製造できるが、設備が粗放である場合、混雑物、混入物などにより品質が低下することがある。いずれのタイプであっても、本発明を利用することができる。自然光を利用する場合であっても、培養期間中の少なくともグリーンステージ期間に、420～500nmの青色光LEDとピーク波長が620～690nmの赤色光LEDによる照射を、青色光LEDの光量子束密度を赤色光LEDの光量子束密度よりも大きくして、併用することにより、本発明の効果を得ることができる。
　人工光のみで培養する場合は、少なくともグリーンステージ期間は420～500nmの青色光LEDとピーク波長が620～690nmの赤色光LEDを併用する。レッドステージ期間は蛍光灯等他の光源を用いてもよいが、アスタキサンチン生産培養期間と同様に青色光と赤色光を併用してもよい。
　レッドステージ期間の青色光と赤色光の光量子束密度の比は1:1～20:1が好ましく、さらに1:1～5:1、3:2～4:1が好ましい。
　具体的には、グリーンステージ期間の培養を青色光LEDと赤色光LEDの光量子束密度の比を２：３～５：１で行い、レッドステージ期間を１：１～５：１で行う。あるいは、グリーンステージ期間を３：２～５：１で行い、レッドステージ期間を３：２～５：１で行うような組合せが例示される。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　本発明において、アスタキサンチン量は以下の方法で測定した。
Luna 3μm Silicaカラムを用いたHPLCによるアスタキサンチンの定量
　試料を一定量採取し、アセトンを加え破砕する。遠心分離により上清を回収する。上清に0.05M Tris-HCl バッファーとコレステロールエステラーゼ溶液を加え、37℃で45分間反応させ、アスタキサンチンをフリー体にする。アスタキサンチンを石油エーテルにて抽出し、溶媒留去、乾燥する。それをヘキサン：アセトン＝82:18に溶解しHPLC用試料溶液とする。下記のHPLC分析条件にて、測定する。アスタキサンチンは幾何異性体を有するので、それらのピークの面積から、アスタキサンチンの含有量を解析する。
　HPLC分析条件
使用カラム：Luna 3μm Silica(2) 100A 150*4.6mm（Phenomenex社）
使用移動相溶媒：Hexane:Acetone=82:18(v/v)
装置起動用メソッド：A-JUNSOU
A-JUNSOUメソッドの設定内容
　試料注入量：20μL
　移動相流量：1.2mL/min
　カラム温度：30℃
　DAD：455nm, 467nm, 475nm
　測定時間：13min
ヘマトコッカスの培養（グリーンステージ）
　細胞数50万個/mlの浮遊細胞を含むヘマトコッカス・ラクストリス　NIES144株（国立環境研究所微生物系統保存施設保存）培養液50mlとBG11改変A培地（表1）700mlを最大外形130mm、高さ215mmのガラス製1L三角フラスコ8本にそれぞれ注入した。光量子束密度50μmol/m2/sになるように赤色LED（波長660nm）と青色LED（波長450nm）を表２に示した比率で連続光照射下、25℃ において1%二酸化炭素を含む空気を通気攪拌しつつ、5日間、培養した。
ヘマトコッカスの培養（レッドステージ）
次に、1L三角フラスコで培養した750mlの培養液を内径50mm、高さ500mmのガラス製透明培養容器8本にそれぞれ移し替えた。その後、それぞれ培養液中に2g/L濃度になるように塩化ナトリウムを添加後、光量子束密度300μmol/m2/sになるように赤色LED（波長660nm）と青色LED（波長450nm）を表２に示した比率で連続光照射下、27℃で1%二酸化炭素を含む空気を通気攪拌しつつ培養しアスタキサンチン生産を行った。実験に用いた青色光LEDと赤色光LEDのスペクトルを図１に示した。14日間の培養の後、濾過法により乾燥藻体を得た。乾燥藻体の重量を測定し、培養液あたりの乾燥藻体重量を求めた。また、逆相HPLCにより乾燥藻体中のアスタキサンチン含有量と培養液あたりのアスタキサンチン生産量を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　結果を表２に示す。表２の実施例１～５の結果と比較例１～４の結果と比較するとわかるように、グリーンステージにおいて、赤色LEDに対する青色LEDの光量子束密度の比率が大きくなるほど、乾燥藻体重量は多くならないが、乾燥藻体中のカロテノイド量が多くなり、結果として、培養液中のカロテノイドの生産量が大きくなる。
　この傾向はレッドステージの光照射によらず確認された。レッドステージに赤色LEDと青色LEDを併用するほうがより好ましい。
培養期間中のうち、グリーンステージに青色光LEDと赤色光LEDを同時照射することにより、藻体中のアスタキサンチン含有量が高まり、その結果、培養液あたりのアスタキサンチンの生産量を高めることができることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明の方法により、エネルギー使用量を低減し、かつ、培養液あたりのアスタキサンチン生産量を高めることができる。
 

 

Claims (8)

  1. 　微細藻を培養して藻体内にアスタキサンチンを生産させるアスタキサンチンの生産方法において、微細藻のグリーンステージ培養期間中の光照射を、ピーク波長が420～500nmの青色光LEDとピーク波長が620～690nmの赤色光LEDを併用し、青色光LEDと赤色光LEDの光量子束密度の比が２：３～２０：１で行うことを特徴とするアスタキサンチンの生産方法。
  2. 　青色光LEDと赤色光LEDの光量子束密度の比が３：２～２０：１である請求項１のアスタキサンチン生産方法。
  3. 　青色光LEDと赤色光LEDによる光照射をグリーンステージ培養期間中連続して行うことを特徴とする請求項１又は２のアスタキサンチン生産方法。
  4. 　青色光LEDと赤色光LED の光量子束密度がそれぞれ5～200μmol/m2/sであることを特徴とする請求項１ないし３いずれかのアスタキサンチン生産方法。
  5. 　さらに、微細藻のレッドステージ培養期間中の光照射をピーク波長が420～500nmの青色光LEDとピーク波長が620～690nmの赤色光LEDを併用して行うことを特徴とする請求項１ないし４いずれかのアスタキサンチン生産方法。
  6. 　微細藻のレッドステージ培養期間中の青色光LEDと赤色光LED の光量子束密度の比が１:１～２０:１である請求項５のアスタキサンチン生産方法。
  7. 　レッドステージ培養期間中の、青色光LEDと赤色光LED の光量子束密度がそれぞれ20～1000μmol/m2/sであることを特徴とする請求項５又は６のアスタキサンチン生産方法。
  8. 　微細藻がヘマトコッカス属であること特徴とする請求項１ないし７いずれかのアスタキサンチン生産方法。
     

     
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