CN109642246A

CN109642246A - 虾青素的生产方法

Info

Publication number: CN109642246A
Application number: CN201780050531.3A
Authority: CN
Inventors: 泉田仁; 大桥英治; 沼沢彻
Original assignee: BIOLOGICAL GENE KKOF JAPAN; Nippon Suisan Kaisha Ltd
Current assignee: BIOLOGICAL GENE KKOF JAPAN; Nissui Corp
Priority date: 2016-09-21
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2019-04-16
Also published as: WO2018056160A1; JPWO2018056160A1; US20210010049A1

Abstract

提高通过培养微藻来生产虾青素的生产方法的效率。在培养微藻而使藻体内生产虾青素的虾青素的生产方法中，并用峰值波长为420～500nm的蓝光LED和峰值波长为620～690nm的红光LED，以蓝光LED的光通量密度与红光LED的光通量密度之比为2:3～20:1的方式进行微藻的绿色阶段培养期间中的光照射。蓝光LED的光通量密度优选为5～200μmol/m²/s，红光LED的光通量密度优选为5～200μmol/m²/s。

Description

虾青素的生产方法

技术领域

本发明涉及虾青素的有效的生产方法。更详细而言，涉及在对生产虾青素的微藻进行培养时的绿色阶段培养期间中的光照射。

背景技术

虾青素是橙红色的类胡萝卜素中的一种，是主要大量包含于虾或蟹等甲壳类、鲑鱼、鲑鱼子、鲷鱼、藻类等海洋生物中的色素。已知该虾青素具有强大的抗氧化作用，被用作食用色素、化妆品、健康食品、医药品等。

虾青素通过化学合成或者对细菌、酵母、微藻等进行培养而生产。每单位干燥重量的细菌、酵母中的虾青素含量为2重量％以下，与此相对，对微藻中红球藻属(Haematococcus属)的微藻(以下称为红球藻)进行培养而得到的虾青素而言，能够以2重量％以上的高含量进行培养，并且由于其安全性，所以在世界范围内进行生产。在利用红球藻等进行光合作用的微藻的虾青素的生产中需要适合其生长的光照射。

虾青素例如利用红球藻、小球藻、栅藻等微藻而生产。特别是红球藻，其通过外部环境的变化应力而成囊化，在藻体内积累虾青素。为了积累虾青素，需要阳光或人造光的照射。作为人造光的光源，利用荧光灯、LED(light emitting diode：发光二极管)等。

已知生产虾青素的微藻类存在以下状态：在适宜的光照射培养条件下，呈绿色，具备两条式游动孢子，具有运动性且细胞增殖繁盛的浮游细胞的状态(绿色阶段：greenstage)；以及因温度、强光、盐、营养枯竭等的应力，浮游细胞变化为成囊细胞，使虾青素在细胞内积累的状态(红色阶段：red stage)。在浮游细胞中几乎不含有虾青素，但在成囊细胞的期间使虾青素积累成高浓度。

在仅利用阳光进行培养的情况下，由于受到气温变化、日照时间变化的影响，因此难以进行稳定且有效的生产。因此，以往尝试了使用作为人造光之一的荧光灯进行培养。

代替荧光灯，已知有LED，其为低功耗且发热量小的光源，研究了使用LED来生产虾青素。

本发明人们在专利文献1中，报道了在培养微藻而生产虾青素的情况下，在成囊化后的红色阶段的培养期间，并用蓝光LED和红光LED，由此能够提高虾青素的生产效率。

关于成囊化前的绿色阶段的培养期间中的光照射，根据与叶绿素的吸收波长的关系，并用蓝光和红光已被研究，存在专利文献2～5等的报道。他们均通过并用蓝光和红光，来提高藻类的生长，增加培养液中的藻体量(浮游细胞数)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:WO2015/151577

专利文献2:WO2014/119789

专利文献3:WO2014/119792

专利文献4:WO2014/119794

专利文献5:CN102766578

发明内容

技术问题

课题在于，提供一种进一步提高使用了低功耗且发热量少的LED的虾青素培养方法的生产效率的方法。

技术方案

本发明的目的在于，使用省电且能够抑制透过光的部分的温度上升的LED，进行高效的虾青素的生产。

在专利文献2～5中，公开了通过在绿色阶段的培养期间中照射蓝光和红光，使培养液中的藻体量增加，但还没有对于虾青素的产量是否也增加的研究。因此，仅仅是公开了在蓝光的光通量密度与红光的光通量密度同等或红光的光通量密度强的条件下进行培养。

然而，本申请发明人们发现在绿色阶段的培养中，增大蓝光相对于红光的光通量密度，由此虽然藻体量的增加变小，但藻体中的虾青素的积累量变多，结果培养液中的虾青素产量增加，完成了本申请发明。

为了实现上述目的进行了深入的研究，结果发现通过在微藻的培养的绿色阶段，与现有技术相比增大蓝光LED的光通量密度，同时一边照射峰值波长为420～500nm的蓝光LED和峰值波长为620～690nm的红光LED，一边进行培养，从而高效地生产虾青素。特别是，优选连续进行光照射。即，这是因为照射的光量越多，在红色阶段的虾青素含量就变得越多，因此与使光交替照射相比，结果虾青素生产效率变高。

本发明的主旨是以下的(1)～(8)的虾青素的生产方法。

(1)一种培养微藻而使藻体内生产虾青素的虾青素的生产方法，其特征在于，并用峰值波长为420～500nm的蓝光LED和峰值波长为620～690nm的红光LED，以蓝光LED的光通量密度与红光LED的光通量密度之比为2:3～20:1的方式进行微藻的绿色阶段培养期间中的光照射。

(2)根据(1)的虾青素的生产方法，其中，蓝光LED的光通量密度与红光LED的光通量密度之比为3:2～20:1。

(3)根据(1)或(2)的虾青素的生产方法，其特征在于，在绿色阶段培养期间中连续进行使用了蓝光LED和红光LED的光照射。

(4)根据(1)～(3)中任一项的虾青素的生产方法，其特征在于，蓝光LED的光通量密度为5～200μmol/m²/s，红光LED的光通量密度为5～200μmol/m²/s。

(5)根据(1)～(4)中任一项的虾青素的生产方法，其特征在于，进一步并用峰值波长为420～500nm的蓝光LED和峰值波长为620～690nm的红光LED来进行微藻的红色阶段培养期间中的光照射。

(6)根据(5)的虾青素的生产方法，其特征在于，微藻的红色阶段培养期间中的蓝光LED的光通量密度与红光LED的光通量密度之比为1:1～20:1。

(7)根据(5)或(6)的虾青素的生产方法，其特征在于，红色阶段培养期间中的蓝光LED的光通量密度为20～1000μmol/m²/s，红色阶段培养期间中的红光LED的光通量密度为20～1000μmol/m²/s。

(8)根据(1)～(7)中任一项的虾青素的生产方法，其特征在于，微藻为红球藻属。

发明效果

通过本发明，能够在不大幅改变现有的虾青素的制造方法和/或装置的情况下高效地生产虾青素。

附图说明

图1是示出在实施例中使用了蓝光LED和红光LED的光谱的图。

具体实施方式

本发明涉及利用了微藻的虾青素生产方法，其特征是在微藻的培养中，在绿色阶段(呈绿色，具备两条式游动孢子，具有运动性且细胞增殖繁盛的浮游细胞的状态，在成囊化之前)的培养时，以使蓝光LED的光通量密度与红光LED的光通量密度之比为2:3～20:1的方式对微藻照射峰值波长为420～500nm的蓝光LED和峰值波长620～690nm的红光LED。

在本发明中，可以使用能够生产虾青素的微藻。这里所说的微藻限定于进行光合作用的微藻。作为微藻，已知有蓝藻、红藻、褐藻、绿藻、硅藻、真眼点藻等，但本发明的微藻限定于能够生产虾青素的微藻。作为生产虾青素的微藻，通常使用属于红球藻属的微藻(红球藻)。

在红球藻中，可以使用湖生红球藻(Haematococcus lacustris)、雨生红球藻(H.pluvialis)、H.capensis、H.droebakensi、H.zimbabwiensis等。其中，可优选使用湖生红球藻和雨生红球藻。

除红球藻属以外还可以使用生产虾青素的微藻。例如，可举出作为小球藻属的Chlorella zofingiensis、单针藻属(Monoraphidium sp.)的微藻，除此以外，还可以举出Vischeria helvetica、Coelastrella、Scenedesmus、Chlamydomonas nivalis、Protosiphon botryoides、Neochloris wimmeri等。

作为微藻的培养所使用的培养基，没有特别限制，但为了防止杂菌污染培养基，优选使用不含有碳源的独立营养培养基。通常，可以使用含有增殖所需要的氮、微量金属的无机盐、维生素类等的独立营养培养基。例如，可以使用VT培养基、C培养基、MC培养基、MBM培养基、MDM培养基等培养基(参照藻类研究法千原光雄、西泽一俊编，共立出版(1979))、BG-11培养基和它们的改性培养基等。

另外，在培养基中培养微藻时，优选通入含有二氧化碳的空气。虽然通入不含有二氧化氧的空气也能够进行培养，但是微藻的生长会变慢，由此通入含有0.1～5％的二氧化碳，优选0.5～3％的二氧化碳的空气进行培养。虽然不通气也能够培养，但是为了进行良好的生长，将通气量设为0.01～3.0vvm，优选为0.015～1vvm，另外，将pH设为5～10，优选设为6～9。

作为培养温度，以利用湖生红球藻和雨生红球藻的情况为例，例如在10～45℃的范围，优选在18～38℃的范围。另外，将培养基的pH调节到5.0～9.5的范围，优选在6.0～9.0的范围。

对于用于生产虾青素的绿色阶段中的光照射而言，对微藻并用峰值波长为420～500nm的蓝光LED和峰值波长为620～690nm的红光LED。需要在微藻的绿色阶段培养期间中、整个期间、或者一定期间，照射蓝光LED和红光LED这两者。在照射蓝光LED与红光LED这两者的情况下，通过同时照射，能够最高效地生产虾青素，但在24小时以内，交替照射蓝光LED与红光LED的方法也能够高效地生产虾青素。或者也可以使用交替闪烁蓝光LED和红光LED这样的照射方法。也可以以设置间隔的方式间歇性照射。这里的“间歇性照射”包括利用脉冲光进行的照射。如果间歇性地进行光的照射，则能够减少耗电。但是，为了提高生产效率，优选连续进行光照射。即，由于照射的光量越多则在红色阶段的虾青素含量变得越多，因此与使光交替照射相比，结果虾青素生产效率变高。在此，连续照射并不是指24小时内完全不中断，而是表示在一天内至少照射蓝光和红光这两者12小时以上，优选15小时以上，进一步优选18小时以上、21小时以上，最优选24小时。

作为光照射工序中的光源，可以使用LED、电灯泡、荧光灯等，但由于除LED以外的光源所使用的光源的光的波长光谱宽，需要去除不需要的光，因此效率差。如果使用LED，则可以在不需要去除一部分的光之类的特别手段的情况下进行限定波长区域的光的照射，因此能够以少的照射能量高效地生产虾青素。作为LED，可以使用有机EL照明。

优选具备多个LED芯片，以进行有效的照射。在使用多个光源的情况下，为了能够尽可能照射均匀的光，优选使各光源配置为彼此隔开均等的间隔。另外，可以采用将蓝光LED和红光LED的多个芯片独立设置而成的面板来进行照射，也可以使用以一定比例在同一面板内埋入蓝光LED和红光LED的多个芯片而成的面板进行照射。

所照射的蓝光LED的波长的峰值波长为420～500nm范围，优选为430～490nm，红光LED的波长为620～690nm范围，优选为630～680nm。

蓝光LED、红光LED均可以使用峰值波长不同的2种以上的光。例如可以使用峰值波长为430nm和470nm的蓝光LED与630nm和660nm的红光LED进行照射。

蓝光LED、红光LED均优选使用波长宽度窄的光。这是因为通过仅选择适于虾青素生产的波长区域的光进行照射，能够进行更有效的虾青素生产。

在绿色阶段培养中，同时照射微藻的蓝光LED与红光LED之比以光通量密度计为2:3～20:1，优选为1:1～20:1、3:2～20:1、3:2～10:1、2:3～3:1、2:1～10:1、2:1～5:1、2:1～4:1，进一步地，特别优选为2:3～5:1、2:3～3:1、2:1～3:1。

湖生红球藻和雨生红球藻等红球藻存在如下状态：具有运动性且细胞增殖繁盛的绿色的浮游细胞的状态；以及因温度、强光、盐、水分量、营养状态等的极端的环境变化的应力而成囊化的成囊细胞的状态。如果发生成囊化，则在藻体内积累虾青素，变成红色。

使用了峰值波长420～500nm的蓝光LED和峰值波长620～690nm的红光LED的光照射也可以在使虾青素在细胞内积累的成囊细胞的状态(红色阶段)下使用。红色阶段可以使用自然光、白色色、红光等，但优选并用蓝光LED和红光LED。进一步优选在该情况下也加强蓝光(参照专利文献1)。

由于在红球藻的绿色阶段，具有运动性的浮游细胞多且细胞密度低，因此光通量密度即使在20μmol/m²/s以下也能够良好地增殖。

绿色阶段的光通量密度只要是细胞进行增殖，不发生成囊化和/或死亡，就没有特别限定，例如，只要是光透过宽度(直径、厚度)为100mm以下的培养装置，就能够通过峰值波长420～500nm的蓝光LED和峰值波长620～690nm的红光LED分别以5～100μmol/m²/s，优选以10～70μmol/m²/s，进一步优选以20～50μmol/m²/s进行照射，从而高效地生产虾青素。另外，只要是光透过宽度(直径、厚度)为100mm～400mm以下的培养装置，就能够通过峰值波长420～500nm的蓝光LED和峰值波长620～690nm的红光LED分别以10～200μmol/m²/s，优选以20～150μmol/m²/s，进一步优选以30～100μmol/m²/s进行照射，从而高效地生产虾青素。

因温度、强光、盐等施加应力而使红球藻囊化之后，红色阶段的光通量密度没有特别限定，例如只要是光透过宽度(直径、厚度)为70mm以下的培养装置，就能够通过峰值波长420～500nm的蓝光LED和峰值波长620～690nm的红光LED分别以20μmol/m²/s以上，优选分别以50μmol/m²/s以上，进一步优选以100μmol/m²/s以上、150μmol/m²/s以上、300μmol/m²/s以上进行照射，从而高效地生产虾青素。如果是光透过宽度为上述范围以上的培养装置，则也可以设得更大。即，在培养红色阶段的红球藻的情况下，通过照射蓝光LED与红光LED这两者，能够高效地生产虾青素。光通量密度的上限没有特别限定，但从能量成本和效果的平衡考虑，优选为3000μmol/m²/s以下，特别优选为1000μmol/m²/s以下。

红色阶段中的光源没有特别指定。可以使用自然光和/或荧光灯，但如果使用峰值波长420～500nm的蓝光LED和峰值波长620～690nm的红光LED的光源，则能够最高效地生产虾青素。

从培养液回收虾青素的方法没有特别限定。例如通过将含有虾青素的微藻培养液过滤，利用离心处理等固液分离方法分离而收集到微藻细胞之后，进行干燥(自然干燥、鼓风干燥、热风式干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等)，从而能够得到微藻的干燥物。得到的微藻的干燥物以1～10质量％的浓度含有虾青素(游离体的形式)。优选以4～10质量％的浓度含有虾青素(游离体的形式)。

通过对含有虾青素的湿藻体或上述干燥物进行粉碎处理、提取、回收，从而能够得到含有虾青素的成分。对于虾青素的提取和回收方法，没有特别限制，可以使用本领域技术人员通常使用的方法。例如，在机械性地破坏微藻的干燥物之后提取虾青素。作为提取方法，可举出使用氯仿、己烷、丙酮、甲醇、乙醇等有机溶剂、食用油脂进行提取的化学提取方法，或者通过压榨绿藻的干燥物等的物理提取方法。或者，可以使用超临界提取法进行提取和回收。馏出提取溶剂而得到含有虾青素的油。

作为LED光对培养液的照射方式，存在从反应器所含有的培养液的外侧照射的外照式照射和向反应器所含有的培养液中投入LED的内照式照射，但不特别限制于其方式，都可以使用。应予说明，在外照式照射的情况下的光通量密度采用在容器的外表面测得的值，在内照式照射的情况下的光通量密度采用在与培养液接触的容器表面测得的值。也可以并用外照式照射与内照式照射。

用于虾青素生产的微藻培养装置只要是能够供给二氧化碳，且能够并用峰值波长为420～500nm的蓝光LED与峰值波长为620～690nm的红光LED对培养液进行光照射的装置，就没有特别限制。例如，在小规模的情况下，优选使用厚度10～50mm程度的扁平培养瓶、直径20～70mm程度的玻璃管。在大规模的情况下，可以使用由塑料袋、玻璃制、塑料制等管或透明板构成，且根据需要具备照明器和搅拌机的培养槽。在大规模培养的情况下，优选光透过宽度(直径、厚度)为400mm以下，进一步优选为70mm以下。作为这样的培养槽，例如可以使用平板培养槽(平板培养藻)、管型培养槽、充气型培养槽、中空圆筒型培养槽、箱型内照式培养槽等。另外，在任一情况下，均优选使用密闭容器。例如，可以使用如日本特开2012-29578所公开的在LED的周围卷绕管的类型和/或如日本特开2014-39491所公开的混合型的反应器。

虾青素的培养有并用设置在室外的利用阳光的类型、设置于室内的使用人造光的类型、以及并用这两者的类型。利用阳光的方法不耗费能量成本，能够低廉地制造，但在设备摆放稀疏的情况下，有时因混杂物、混入物等而导致品质降低。任一类型均可以利用本发明。在利用自然光的情况下，通过在培养期间中的至少绿色阶段期间，以使蓝光LED的光通量密度大于红光LED的光通量密度的方式并用利用420～500nm的蓝光LED与峰值波长为620～690nm的红光LED进行的照射，能够得到本发明的效果。

在仅利用人造光进行培养的情况下，至少在绿色阶段期间并用420～500nm的蓝光LED和峰值波长为620～690nm的红光LED。在红色阶段期间可以使用荧光灯等其他光源，但也可以与虾青素生产培养期间同样地并用蓝光和红光。

红色阶段期间的蓝光的光通量密度与红光的光通量密度之比优选为1:1～20:1，进一步优选为1:1～5:1、3:2～4:1。

具体来说，以蓝光LED的光通量密度与红光LED的光通量密度之比为2:3～5:1来进行绿色阶段期间的培养，以蓝光LED的光通量密度与红光LED的光通量密度之比为1:1～5:1来进行红色阶段期间的培养。或者，可示例以3:2～5:1来进行在绿色阶段期间的培养且以3:2～5:1来进行红色阶段期间的培养这样的组合。

以下，使用实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例限定。

在本发明中，虾青素量利用以下的方法测定。

使用了Luna 3μm Silica柱的HPLC对虾青素的定量

采取一定量的试样，加入丙酮并粉碎。通过离心分离回收上清。向上清中加入0.05M的Tris-HCl缓冲液和胆固醇酯酶溶液，在37℃下反应45分钟，使虾青素成为游离体。用石油醚提取虾青素，馏出溶剂，进行干燥。将其溶于己烷:丙酮＝82:18，作为HPLC用试样溶液。按照下述的HPLC分析条件进行测定。由于虾青素具有几何异构体，所以根据这些峰的面积解析虾青素的含量。

HPLC分析条件

使用柱：Luna 3μm Silica(2)100A 150*4.6mm(Phenomenex公司)

使用流动相溶剂：己烷:丙酮＝82:18(v/v)

装置启动用方法：A-JUNSOU

A-JUNSOU方法的设定内容

试样注入量：20μL

流动相流量：1.2mL/min

柱温：30℃

DAD：455nm,467nm,475nm

测定时间：13分钟

实施例

红球藻的培养(绿色阶段)

将含有细胞数50万个/ml的浮游细胞的湖生红球藻NIES144株(国立环境研究所微生物系统保存施设保存)培养液15ml与BG11改性A培养基(表1)700ml分别注入到8个最大外形130mm、高度215mm的玻璃制1L锥形瓶。在以使光通量密度成为50μmol/m²/s的方式按表2示出的比率连续照射红色LED(波长660nm)和蓝色LED(波长450nm)的光的情况下，在25℃下通入含有1％的二氧化碳的空气并进行搅拌，同时培养5天。

红球藻的培养(红色阶段)

接着，将在1L锥形瓶培养出的750ml的培养液分别转移到8个内径50mm、高度500mm的玻璃制透明培养容器。然后，分别在培养液中添加氯化钠，使浓度成为2g/L之后，在以使光通量密度成为300μmol/m²/s的方式按照表2示出的比率连续照射红色LED(波长660nm)和蓝色LED(波长450nm)的光的情况下，在27℃下通入含有1％二氧化碳的空气并搅拌，同时进行培养，由此进行虾青素生产。实验中使用的蓝光LED和红光LED的光谱如图1所示。在培养14天之后，利用过滤法得到了干燥藻体。测定干燥藻体的重量，求出每单位培养液的干燥藻体重量。另外，利用反相HPLC求出干燥藻体中的虾青素含量和每单位培养液的虾青素产量。

[表1]

将结果示于表2。如果将表2的实施例1～5的结果与比较例1～4的结果进行比较可知，在绿色阶段，蓝色LED相对于红色LED的光通量密度的比率变得越大，干燥藻体重量虽然不会变得越多，但干燥藻体中的类胡萝卜素量变得越多，结果培养液中的类胡萝卜素的产量变得越大。

已确认该倾向与红色阶段的光照射无关。更加优选在红色阶段并用红色LED和蓝色LED。

已确认在培养期间，通过在绿色阶段同时照射蓝光LED和红光LED，使得藻体中的虾青素含有量提高，结果能够提高每单位培养液的虾青素的产量。

[表2]

工业上的可利用性

通过本发明的方法，能够降低能量使用量，并且，提高每单位培养液的虾青素的产量。

Claims

1.一种虾青素的生产方法，其培养微藻而使藻体内生产虾青素，其特征在于，并用峰值波长为420～500nm的蓝光LED和峰值波长为620～690nm的红光LED，以蓝光LED的光通量密度与红光LED的光通量密度之比为2:3～20:1的方式进行微藻的绿色阶段培养期间中的光照射。

2.根据权利要求1所述的虾青素的生产方法，其特征在于，蓝光LED的光通量密度与红光LED的光通量密度之比为3:2～20:1。

3.根据权利要求1或2所述的虾青素的生产方法，其特征在于，在绿色阶段培养期间中连续进行使用了蓝光LED和红光LED的光照射。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的虾青素的生产方法，其特征在于，蓝光LED的光通量密度为5～200μmol/m²/s，红光LED的光通量密度为5～200μmol/m²/s。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的虾青素的生产方法，其特征在于，进一步并用峰值波长为420～500nm的蓝光LED和峰值波长为620～690nm的红光LED来进行微藻的红色阶段培养期间中的光照射。

6.根据权利要求5所述的虾青素的生产方法，其特征在于，微藻的红色阶段培养期间中的蓝光LED的光通量密度与红光LED的光通量密度之比为1:1～20:1。

7.根据权利要求5或6所述的虾青素生产方法，其特征在于，红色阶段培养期间中的蓝光LED的光通量密度为20～1000μmol/m²/s，红色阶段培养期间中的红光LED的光通量密度为20～1000μmol/m²/s。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的虾青素的生产方法，其特征在于，微藻为红球藻属。