WO2014119794A1 - 緑藻類生育促進方法 - Google Patents

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WO2014119794A1
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light
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irradiation
illumination light
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範子 大竹
米田　正
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昭和電工株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the present invention relates to a method for promoting the growth of green algae, and more particularly, to a method for promoting the growth of green algae that promotes the growth of green algae in migratory cells by irradiating the green algae that accumulate astaxanthin with artificial light.
  • Astaxanthin is a kind of red carotenoid and is known to have a strong antioxidant effect.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing astaxanthin-producing green algae, and a method for producing green algae containing astaxanthin at a high concentration by irradiating the green algae that have changed into cyst cells under specific conditions is disclosed. ing.
  • Green algae belonging to the genus Haematococcus are known as green algae that accumulate astaxanthin.
  • Haematococcus grows as green migrating cells under appropriate light irradiation culture conditions, and migratory cells change into cyst cells due to stress such as light environment and nutrient depletion, and accumulates a significant amount of astaxanthin in the cells It is known that there is a state to do.
  • Industrially mass culturing green algae as a raw material for health foods and pharmaceuticals is industrially useful, and so far, as in Patent Document 1, a method for increasing the accumulation of astaxanthin in cyst cells has been studied. . On the other hand, it is required to promote the growth of green algae, shorten the culture period, and improve productivity.
  • Non-Patent Document 1 discloses the influence on the growth of Haematococcus when irradiated with red LED light and blue LED light.
  • Patent Document 2 discloses a light source for cultivating plants and the like by lighting blue LED light and red LED light simultaneously or alternately.
  • JP 2007-097584 A Japanese Patent Laid-Open No. 08-103167
  • the present invention was completed by finding that the migratory cells can grow in a high density in a short time while maintaining the green stage (in the culture of green algae, the state of the culture medium being green to brown).
  • the present invention is as follows.
  • [1] A method for cultivating green algae that irradiates green algae accumulating astaxanthin with artificial light to promote growth in a state where the green algae are green migratory cells, Continuously irradiating with blue illumination light, irradiating with red illumination light intermittently, maintaining the green algae culture solution in green or brown, and promoting the growth of green algae in a liquid medium Method.
  • [2] The method for promoting the growth of green algae according to the above [1], wherein the green algae that accumulate astaxanthin are unicellular green algae belonging to the genus Haematococcus.
  • [3] The method for promoting the growth of green algae according to the above [2], wherein the unicellular green algae belonging to the genus Haematococcus is Haematococcus pluvialis or Haematococcus lactoris.
  • [4] The method of culturing green algae according to any one of [1] to [3] above, wherein the wavelength of the red illumination light is 570 nm to 730 nm and the center wavelength is 645 nm to 680 nm.
  • [5] The method of culturing green algae according to any one of [1] to [4] above, wherein the wavelength of the blue illumination light is 400 nm to 515 nm and the center wavelength is 440 nm to 460 nm.
  • the present invention in the method for promoting the growth of green algae that accumulates astaxanthin, there is provided a simple and excellent method for promoting the growth that can shorten the culture period and improve the productivity by promoting the growth in migratory cells.
  • growth of migrating cells of green algae can be promoted, and high-density cells can be produced in a short time.
  • a large amount of astaxanthin can be produced more efficiently by transferring the obtained green algae to cyst cells. it can.
  • the green algae growth promotion method irradiates the green algae accumulating astaxanthin continuously with the blue illumination light while continuously irradiating the red illumination light, thereby cultivating the green algae green stage (culture of the green algae).
  • the growth of migrating cells in a liquid medium is promoted while maintaining the culture medium in a green or brown state.
  • continuous irradiation refers to irradiation during the entire green algae growth promotion period (culture period)
  • intermittent irradiation refers to irradiation during a certain period of the culture period, and thereafter The irradiation and non-irradiation cycles are repeated such that irradiation is not performed for a certain period of time, followed by irradiation for a certain period of time and then irradiation for a certain period of time.
  • the red illumination light used in the present invention includes light having a wavelength of 570 to 730 nm, and light having a wavelength of 620 to 730 nm is preferably used. Further, red illumination light having a center wavelength of 645 to 680 nm is more preferably used, and red illumination light having a center wavelength of 660 nm is more preferable.
  • the blue illumination light used in the present invention includes light having a wavelength of 400 to 515 nm. Also, blue illumination light having a center wavelength of 440 to 460 nm is preferably used, and blue illumination light having a center wavelength of 445 to 450 nm is more preferable.
  • the red illumination light and the blue illumination light may have a predetermined wavelength range with the above wavelength as the center wavelength.
  • the wavelength range is, for example, 450 nm ⁇ 30 nm for blue illumination light, preferably 450 nm ⁇ 20 nm, more preferably 450 nm ⁇ 10 nm, and 660 nm ⁇ 30 nm, preferably 660 nm ⁇ 20 nm for red illumination light. Is 660 nm ⁇ 10 nm.
  • the amount of red irradiation light and blue irradiation light is not particularly limited as long as it is suitable for the growth of green algae that accumulates astaxanthin.
  • the amount of red irradiation light and blue irradiation light may be the same or different.
  • the “light-irradiated surface” is difficult to define strictly due to the size of the instrument for measuring PPFD, the shape of the culture vessel, and the like. Point as close as possible).
  • the light quantity ratio of the red irradiation light and the blue irradiation light is not limited as long as the effect of the present invention can be obtained, but for example, “red: blue” is set within a range of 1:20 to 20: 1. It can be set arbitrarily such as 1: 1, 5: 3, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 10: 1, 20: 1, etc.
  • the light quantity ratio of “red: blue” is preferably 1: 1 to 10: 1, more preferably 3: 2 to 7: 1, and 5: 3 to 3: 1. Is more preferable.
  • the irradiation time and non-irradiation time of the red irradiation light can be arbitrarily set as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • a preferable irradiation time is 1 hour to 24 hours per time, more preferably 1 hour to 18 hours, and further preferably 1 hour to 12 hours.
  • the irradiation time may be constant throughout the culture period, or may be extended or shortened for each irradiation.
  • the preferred non-irradiation time is 1 to 24 hours per time, more preferably 6 to 23 hours, and further preferably 12 to 23 hours.
  • the non-irradiation time may be constant throughout the culture period, or may be extended or shortened for each irradiation.
  • one cycle each of irradiation and non-irradiation is defined as one cycle of intermittent irradiation.
  • the time for one cycle can be arbitrarily set as the sum of irradiation time and non-irradiation time, and the preferable time for one cycle is 2 to 48 hours, more preferably 2 to 24 hours. It may start from irradiation or non-irradiation at the start of the culture, and may end at either.
  • the amount of red irradiation light is 62.5 ⁇ mol / m 2 / s
  • the amount of blue irradiation light is 18.8 ⁇ mol / m 2 / s
  • the irradiation time of red irradiation light is 12 hours
  • the non-irradiation time For example, it may be constant for 12 hours throughout the culture period.
  • the light amount ratio per 24 hours (red illumination light: blue illumination light) is 5: 3.
  • Irradiation device As an apparatus for irradiating red irradiation light and blue irradiation light used in the present invention, it is possible to execute each step of the step of continuously irradiating the blue irradiation light and the step of irradiating the red irradiation light intermittently in the present invention. It can be used regardless of the shape or type of light source, but the light irradiation unit that irradiates green algae with red illumination light and blue illumination light, and the control that performs intermittent illumination of red illumination light by controlling the light irradiation unit A part.
  • the light irradiation unit includes a light source that emits red light and / or blue light.
  • Conventionally known light sources can be used as the red and blue light sources.
  • the light source it is preferable to use an optical semiconductor element such as a light emitting diode (LED) or a laser diode (LD) that emits light with easy wavelength selection and a large proportion of light energy in the effective wavelength region.
  • An optical semiconductor element is small and has a long life, and emits light at a specific wavelength depending on the material, so that there is no unnecessary heat radiation. Therefore, the optical semiconductor element has high energy efficiency, and even if it is irradiated close to green algae, cells are not easily damaged. For this reason, by using an optical semiconductor element as a light source, it is possible to perform culture at a lower power cost and a smaller space than other light sources.
  • an SMD line light source in which SMD (2 Chips Surface Mount Device), which is a combination of one red light semiconductor element and one blue light semiconductor element, is linearly arranged, or a red light semiconductor element or a blue light semiconductor element.
  • SMD Chips Surface Mount Device
  • a monochromatic line light source or a monochromatic panel light source in which only one of them is arranged in a line, tube or plane can be used.
  • a red LED includes an aluminum / gallium / indium / phosphorus light emitting diode (gallium / phosphorous substrate, sold by Showa Denko KK as product number HRP-350F). Red wavelength 660 nm) and the like, and blue LEDs include light emitting diodes of the company product number GM2LR450G.
  • Examples of light sources other than light-emitting diodes include straight tube and compact fluorescent lamps and bulb-type fluorescent lamps, high-pressure discharge lamps, metal halide lamps, and laser diodes. In combination with these light sources, an optical filter for selectively using light in the above wavelength range may be used.
  • a control part maintains the light quantity and / or irradiation time of the red illumination light and blue illumination light radiated
  • the control unit can be configured using a general-purpose computer. For example, when an LED is used as the light source, the control unit adjusts the magnitude of the LED drive current based on a control pattern previously stored and stored in a memory or hard disk, and / or the amount of red illumination light and / or blue illumination light. Change the irradiation time. Moreover, a control part switches and drives several LED which radiates
  • the green algae used in the present invention can be used without particular limitation as long as it is an algae that accumulates astaxanthin.
  • unicellular green algae belonging to the genus Haematococcus are preferably used.
  • Preferred green algae include H. pluvialis, H. lacustris, H. capensis, H. droebakensi, and Hematococcus zimbabween. Examples include H. zimbabwiensis.
  • Hematococcus pluvialis examples include UTEX2505 strain and K0084 strain.
  • Examples of Hematococcus capensis include UTEX LB1023 strain.
  • Examples of Haematococcus droebakensi examples include UTEX 55 strain.
  • Hematococcus zimbabwiensis examples include UTEX LB1758 strain. Among these, Haematococcus prubiaris is preferably used.
  • the green stage in the present invention refers to a state in which the culture solution is green or brown in the culture of green algae, and this is a state in which cells in the medium grow as green migratory cells under appropriate light irradiation culture conditions. Applicable. On the other hand, migratory cells change to cyst cells due to stress such as light environment and nutrient depletion, and a state in which a significant amount of astaxanthin accumulates in the cells and the culture medium turns red is called a red stage.
  • red illumination light having a wavelength described in the specification, blue illumination light, irradiation time and non-irradiation time described in the specification, light quantity, irradiation with an irradiation device, It shows culturing with the algae, medium, culture apparatus, and culture conditions described in the specification.
  • green cells cells that maintain the state of migratory cells
  • red cells cells that have changed to cyst cells
  • the color of the culture solution Turns brown.
  • migratory cells are not seen, and a transition is made to the red stage, which accumulates a significant amount of astaxanthin.
  • migratory cells exist in the medium at the green stage, that is, the state before the culture medium turns red (including not only the green state but also the brown state of the culture medium). It is preferable to move to the red stage after promoting growth in migratory cells and producing high-density cells in a short time while maintaining the state as much as possible.
  • the growth promoting method of the present invention by realizing this, cells can be grown at high density in a short time.
  • (Culture medium) There is no particular limitation on the liquid medium used for culturing green algae. Generally, nitrogen necessary for growth, inorganic salts of trace metals (eg, phosphorus, potassium, magnesium, iron, etc.), vitamins (eg, thiamine, etc.), etc.
  • the culture medium containing it can be used suitably.
  • a medium such as AF-6 medium, BG-11 medium, C medium, MBM medium, MDM medium, VT medium (the composition of these mediums is described in the medium list on the National Institutes of Health website)
  • These modified media can also be used. These media can be appropriately selected according to the type of green algae and the purpose of culture.
  • C medium or BG-11 medium and modified medium thereof For example, for the purpose of growing green algae belonging to the genus Haematococcus, it is preferable to use C medium or BG-11 medium and modified medium thereof.
  • components such as a carbon source and a nitrogen source may be appropriately added to the medium.
  • the green algae culture device is not particularly limited in shape and size as long as it is a device capable of supplying carbon dioxide and irradiating light.
  • An equipped culture tank or the like can be used.
  • a culture tank for example, a jar type culture tank, a tube type culture tank, an air dome type culture tank, a hollow cylindrical culture tank, or the like is used. In either case, a sealed container is preferably used. You may install a stirrer in these as needed.
  • the culture conditions There are no particular limitations on the culture conditions, and temperatures, pH, and the like generally used for culturing green algae are used.
  • the culture temperature of green algae is controlled at a constant temperature of, for example, 15 to 35 ° C., preferably 20 to 25 ° C.
  • the pH of the culture solution is kept at 4 to 10, preferably 5 to 9, more preferably 6 to 8.
  • Carbon dioxide is preferably supplied for the purpose of supplying the carbon source and controlling the pH.
  • Carbon dioxide is usually supplied with mixed air containing carbon dioxide at a concentration of 1 to 10 v / v% in the medium or the upper space of the culture tank. For example, it is supplied by continuously circulating so as to be 0.2 to 2 vvm.
  • the growth state of green algae can be measured by a known method such as absorbance measurement of a culture solution, fluorescence measurement, measurement with a hemocytometer, Coulter counter, dry weight measurement and the like. Among these, it is preferable to carry out by measuring absorbance at 560 nm, measuring with a hemocytometer, and measuring dry weight.
  • Example 1 (Preparation of green algae) A modified medium of BG-11 medium was prepared. Table 1 shows the medium composition.
  • a 50 ml culture flask was charged with 20 ml of medium and inoculated with Haematococcus lactoris NIES-144 strain.
  • a white fluorescent lamp is used as the light source, and the photosynthesis effective photon density (PPED) is adjusted to 30 ⁇ mol / m 2 / s on the irradiation surface of the culture flask using a photon meter (manufactured by System Instruments), and the medium is irradiated.
  • Light irradiation was performed intermittently for a period of 12 hours and a non-irradiation time of 12 hours, and cultured at 20 ° C. for 14 days to prepare a culture solution having a cell density of 2 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • the head space was replaced in the same procedure each time.
  • the carbon dioxide concentration was adjusted so that the pH of the medium was 7.
  • the concentration of carbon dioxide to be supplied was adjusted so as to be 7 v / v% from the 0th to the 4th day and to 10 v / v% after the 4th day.
  • Sampling was performed appropriately during the measurement, and the absorbance at 560 nm (A560) and the rate of migrating cells were measured.
  • the migratory cell rate was calculated using a hemocytometer.
  • the color of the culture solution was observed.
  • Example 2 Except that the irradiation conditions of light was adjusted to red 75 ⁇ mol / m 2 / s, blue 12.5 ⁇ mol / m 2 / s were then cultured in the same manner as in Example 1. At this time, the light amount ratio of red irradiation light and blue irradiation light per 24 hours is 3: 1.
  • Example 3 Except that the irradiation conditions of light was adjusted to red 87.5 ⁇ mol / m 2 / s, blue 6.3 ⁇ mol / m 2 / s were then cultured in the same manner as in Example 1. At this time, the light amount ratio per 24 hours of the red irradiation light and the blue irradiation light is 7: 1.
  • Example 2 A white fluorescent lamp was used as the light source, the light irradiation conditions were adjusted to 50 ⁇ mol / m 2 / s, and the culture was performed in the same manner as in Example 1 except that the medium was continuously irradiated.
  • Example 1 The results of A560 on the 4th and 6th days of Example 1 and Comparative Examples 1 to 4 are shown below.
  • Example 1 A560 was higher than Comparative Examples 1 and 2, and growth was promoted.
  • the migratory cell rate was 70%, the color of the culture was green, and the green stage was maintained.
  • Examples 2 and 3 both A560 and cell density were higher than those in Comparative Examples 3 and 4, and growth was promoted.
  • the color of the culture broth was 6 days, and both Examples 2 and 3 and Comparative Examples 3 and 4 were green, and the migratory cell rate was 70% or more, and the green stage was maintained.
  • Comparative Examples 1 and 2 the color of the culture solution on the sixth day was red, and the green stage could not be maintained.
  • Comparative Examples 3 and 4 although the color of the culture solution on the 6th day maintained green, the cells aggregated to cause precipitation.

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Abstract

アスタキサンチンを蓄積する緑藻類に人工光を照射して、前記緑藻類が緑色の遊走細胞である状態での生育を促進させる緑藻類の培養方法であって、青色照明光を連続的に照射しながら、赤色照明光を断続的に照射して、前記緑藻類の培養液が緑色ないし褐色である状態を維持したまま前記緑藻類を液体培地で生育させることを特徴とする。

Description

緑藻類生育促進方法
　本発明は、緑藻類生育促進方法に関し、特に、アスタキサンチンを蓄積する緑藻類に人工光を照射して、緑藻類の遊走細胞における生育を促進させる緑藻類生育促進方法に関する。
　本願は、２０１３年２月４日に、日本に出願された特願２０１３－０１９９７５に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　アスタキサンチンは赤色のカロテノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。
　特許文献１にはアスタキサンチンを産生する緑藻の製造方法が開示されており、シスト細胞に変化した緑藻に特定条件の光照射を行うことにより、高濃度のアスタキサンチンを含む緑藻を製造する方法が開示されている。
　アスタキサンチンを蓄積する緑藻類としてヘマトコッカス属に属する緑藻が知られている。ヘマトコッカスは、適切な光照射培養条件下で緑色の遊走細胞として生育する状態と、光環境や栄養枯渇などのストレスにより遊走細胞がシスト細胞へと変化し、著量のアスタキサンチンを細胞内に蓄積する状態が存在することが知られている。
　緑藻類を、健康食品や医薬品などの原料として工業的に大量培養することは産業上有用であり、これまで、特許文献１のように、シスト細胞におけるアスタキサンチンの蓄積を増加させる方法は検討されてきた。
　一方で、緑藻類の生育を促進し、培養期間を短縮して生産性を向上させることが求められている。このように、大量の細胞を取得するための時間を短縮するためには、シスト細胞に変化する前の遊走細胞における生育を促進し、短時間で高密度の細胞を生産することが有用である。しかしながら、緑藻類の遊走細胞における生育を促進する方法は知られていなかった。
　一方、人工光を用いて光合成を促し生物を生育させる方法が知られている。
　例えば、非特許文献１には、赤色ＬＥＤ光および青色ＬＥＤ光を照射したときのヘマトコッカスの生育に対する影響について開示されている。
　また、特許文献２には、青色ＬＥＤ光と赤色ＬＥＤ光を同時または交互に点灯して植物等を栽培する光源が開示されている。
特開２００７－０９７５８４号公報 特開平０８－１０３１６７号公報
Katsuda, T., et al　Enzyme and Microbial Technology 35 (2004) 81-86
　いずれの上記文献にも、液体培地中で緑藻類の遊走細胞における生育を促進し、細胞を高密度に培養する方法は開示されておらず、知られていなかった。
　そこで、本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、アスタキサンチンを蓄積する緑藻類を工業的に大量培養するために、遊走細胞における生育を促進し、培養期間を短縮して生産性を向上させるための生育促進方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、人工光の照射による緑藻類の生育促進効果について鋭意検討を行った結果、驚くべきことに、青色照明光を連続的に照射しながら、赤色照明光を断続的に照射すると、グリーンステージ（緑藻類の培養において、培養液が緑色ないし褐色である状態）を維持したまま、遊走細胞を短時間で高密度に生育することを見出し、本発明を完成した。
　本発明は以下のとおりである。
［１］アスタキサンチンを蓄積する緑藻類に人工光を照射して、前記緑藻類が緑色の遊走細胞である状態での生育を促進させる緑藻類の培養方法であって、
　青色照明光を連続的に照射しながら、赤色照明光を断続的に照射して、前記緑藻類の培養液が緑色ないし褐色である状態を維持しながら、前記緑藻類を液体培地で生育させる緑藻類生育促進方法。
［２］前記アスタキサンチンを蓄積する緑藻類が、ヘマトコッカス（Haematococcus）属に属する単細胞緑藻類である上記［１］記載の緑藻類生育促進方法。
［３］前記ヘマトコッカス（Haematococcus）属に属する単細胞緑藻類が、ヘマトコッカス・プルビアリスまたはヘマトコッカス・ラクストリスである上記［２］記載の緑藻類生育促進方法。
［４］前記赤色照明光の波長が５７０ｎｍ～７３０ｎｍ、中心波長が６４５ｎｍ～６８０ｎｍである上記［１］～［３］のいずれか―項に記載の緑藻類培養方法。
［５］前記青色照明光の波長が４００ｎｍ～５１５ｎｍ、中心波長が４４０ｎｍ～４６０ｎｍである上記［１］～［４］のいずれか―項に記載の緑藻類培養方法。
［６］前記赤色照明光の光源がＬＥＤである上記［１］～［５］のいずれか―項に記載の緑藻類培養方法。
［７］前記青色照明光の光源がＬＥＤである上記［１］～［６］のいずれか―項に記載の緑藻類培養方法。
［８］前記赤色照明光および前記青色照明光の光量が、前記培養液の光照射面における光合成光量子束密度で１０～１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓである上記［１］～［７］のいずれか―項に記載の緑藻類生育促進方法。
［９］前記赤色照明光の照射時間が、１回当たり１時間～２４時間であり、非照射時間が１回当たり１時間～２４時間である上記［１］～［８］のいずれか―項に記載の緑藻類生育促進方法。
［１０］前記赤色照明光の照射と非照射を各１回ずつ行う断続照射の１サイクルの時間が２時間～２４時間である上記［１］～［９］のいずれか―項に記載の緑藻類生育促進方法。
　本発明によれば、アスタキサンチンを蓄積する緑藻類の生育促進方法において、遊走細胞における生育を促進することにより、培養期間の短縮および生産性の向上が可能となる簡便で優れた生育促進方法が提供される。
　また、本発明の生育促進方法によれば、緑藻類の遊走細胞における生育を促進することができ、短時間で高密度の細胞を生産することができる。そして、本発明の生育促進方法によって緑藻類を大量に取得した後（遊走細胞の生育後）に、得られた緑藻類をシスト細胞に移行させることにより、大量のアスタキサンチンをより効率的に生産することができる。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、本発明はそれらに限定されるものではなく、それらにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　本発明に係る緑藻類生育促進方法は、アスタキサンチンを蓄積する緑藻類に対して、青色照明光を連続的に照射しながら、赤色照明光を断続的に照射することによって、緑藻類のグリーンステージ（緑藻類の培養において、培養液が緑色ないし褐色である状態）を維持したまま、遊走細胞の液体培地での生育を促進する方法である。
　ここで「連続的に照射」とは、緑藻類の生育促進期間（培養期間）のすべてにおいて照射することであり、「断続的に照射」とは、培養期間のうちの一定期間において照射し、その後一定時間において照射せず、さらにその後一定時間において照射し、その後一定時間において照射せずというふうに、照射と非照射のサイクルを繰り返し行うことである。
　（波長）
　本発明に用いる赤色照明光としては、波長が５７０～７３０ｎｍの光が挙げられ、波長が６２０～７３０ｎｍの光が好適に用いられる。また、６４５～６８０ｎｍの波長を中心波長とする赤色照明光がさらに好適に用いられ、中心波長を６６０ｎｍとする赤色照明光がさらに好適である。
　本発明に用いる青色光照明光としては、波長が４００～５１５ｎｍの光が挙げられる。
また、中心波長を４４０～４６０ｎｍとする青色照明光が好適に用いられ、中心波長を４４５～４５０ｎｍとする青色照明光がさらに好適である。
　赤色照明光および青色光照明光は、上記波長を中心波長として所定の波長域を有するものとすることができる。波長域としては、例えば、青色照明光であれば４５０ｎｍ±３０ｎｍ、好ましくは４５０ｎｍ±２０ｎｍ、さらに好ましくは４５０ｎｍ±１０ｎｍであり、赤色照明光であれば６６０ｎｍ±３０ｎｍ、好ましくは６６０ｎｍ±２０ｎｍ、さらに好ましくは６６０ｎｍ±１０ｎｍである。
　（光量）
　赤色照射光および青色照射光の光量は、アスタキサンチンを蓄積する緑藻類の生育に適している範囲であれば特に限定されないが、例えば、培養液の光照射面近傍における光合成光量子束密度（Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｈｏｔｏｎ　Ｆｌｕｘ　Ｄｅｎｓｉｔｙ：ＰＰＦＤ）でそれぞれ５～２００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、好ましくは１０～１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、さらに好ましくは２０～７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓである。赤色照射光および青色照射光の光量は同じであってもよいし、異なってもよい。
　なお、「光照射面」とは、ＰＰＦＤを測定する機器の大きさや培養容器の形状などから、厳格に規定することが困難であるが、培養液のそばの限りなく近い箇所（光照射面から限りなく近い箇所）を指す。
　また、赤色照射光および青色照射光の光量比は、本発明の効果が得られる範囲であれば制限はないが、例えば「赤:青」が１：２０～２０：１の範囲で設定することができ、１：１、５：３、２：１、３：１、４：１、１０：１、２０：１などのように任意に設定され得る。この内、「赤：青」の光量比が、１：１～１０：１であることが好ましく、３：２～７：１であることがより好ましく、５：３～３：１であることがさらに好ましい。
　（照射時間及び非照射時間）
　赤色照射光の照射時間および非照射時間は本発明の効果が奏される限りにおいて任意に設定できる。好ましい照射時間は１回当たり１時間～２４時間であり、より好ましくは１時間～１８時間であり、さらに好ましくは１時間～１２時間である。照射時間は培養期間を通じて一定であってもよいし、照射毎に延長または短縮してもよい。
　好ましい非照射時間は１回当たり１時間～２４時間であり、より好ましくは６時間～２３時間であり、さらに好ましくは１２時間～２３時間である。非照射時間は培養期間を通じて一定であってもよいし、照射毎に延長または短縮してもよい。
　ここで、照射と非照射各１回ずつを断続照射の１サイクルとする。１サイクルの時間は照射時間と非照射時間の合計として任意に設定でき、好ましい１サイクルの時間は２時間～４８時間であり、より好ましくは２時間～２４時間である。培養開始時に照射と非照射のいずれから開始してもよく、いずれで終了してもよい。
　好ましい態様の一例としては、赤色照射光の光量を６２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、青色照射光の光量を１８．８μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、赤色照射光の照射時間を１２時間、非照射時間１２時間で、培養期間を通じて一定とすることが挙げられる。このとき２４時間当たりの光量比（赤色照明光：青色照明光）は５：３である。
（照射装置）
　本発明に用いる、赤色照射光および青色照射光を照射するための装置としては、本発明における青色照射光を連続照射する工程及び赤色照射光を断続的に照射する工程の各工程を実行可能なものであればその形状や光源の種類を問わず使用できるが、赤色照明光及び青色照明光を緑藻類に照射する光照射部と、光照射部を制御して赤色照明光の断続照射を行う制御部とを備える。
　光照射部には、赤色光および／または青色光を放射する光源が含まれる。赤色光および青色光の光源には、従来公知の光源を用いることができる。光源には、波長選択が容易で有効波長域の光エネルギーの占める割合が大きい光を放射する発光ダイオード（ＬＥＤ）やレーザーダイオード（ＬＤ）などの光半導体素子を用いることが好ましい。
　光半導体素子は、小型で寿命が長く、材料によって特定の波長で発光して不要な熱放射がないためエネルギー効率が良く、緑藻類に近接照射しても細胞を障害しにくい。このため、光半導体素子を光源に用いることで、他の光源と比較して低電カコストかつ省スペースで培養を行うことが可能となる。
　光源には、１つの赤色光半導体素子と１つの青色光半導体素子を組み合わせて実装したＳＭＤ（２　Ｃｈｉｐｓ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｍｏｕｎｔ　Ｄｅｖｉｃｅ）を線状に配列したＳＭＤライン光源や、赤色光半導体素子あるいは青色光半導体素子のどちらか一方のみを線状、管状あるいは面状に配列した単色ライン光源あるいは単色パネル光源などを使用できる。
　上記波長域の光を放射するＬＥＤとしては、例えば赤色ＬＥＤには、昭和電工株式会社から製品番号ＨＲＰ－３５０Ｆとして販売されているアルミニウム・ガリウム・インジウム・リン系発光ダイオード（ガリウム・リン系基板、赤色波長６６０ｎｍ）などがあり、青色ＬＥＤには同社製品番号ＧＭ２ＬＲ４５０Ｇの発光ダイオードなどがある。
　発光ダイオード以外の光源としては、例えば直管形及びコンパクト形の蛍光ランプ及び電球形蛍光ランプ、高圧放電ランプ、メタルハライドランプ、レーザーダイオードなどが挙げられる。これらの光源に組み合わせて、上記波長域の光を選択的に利用するための光学フィルタを用いてもよい。
　制御部は、光照射部から放射される赤色照明光および青色照明光の光量および／または照射時間を所定値に維持するか、あるいは所定の光量および照射時間で変化させる。
　制御部は、汎用のコンピューターを用いて構成することができる。例えば光源としてＬＥＤを用いる場合、制御部は、メモリやハードディスクに予め保持、記憶された制御パターンに基づいてＬＥＤの駆動電流の大きさを調整し、赤色照明光および青色照明光の光量および／または照射時間を変化させる。また、制御部は、制御パターンに基づいて異なる波長域の光を放射する複数のＬＥＤを切り替えて駆動し、照射される光の波長域を変化させる。
（藻類）
　本発明に用いられる緑藻類は、アスタキサンチンを蓄積する緑藻類であれば特に制限なく用いることができる。例えば、ヘマトコッカス（Haematococcus）属に属する単細胞緑藻類が好ましく用いられる。
　好ましい緑藻としては、ヘマトコッカス・プルビアリス（H. pluvialis）、ヘマトコッカス・ラクストリス（H. lacustris）、ヘマトコッカス・カペンシス（H. capensis）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（H. droebakensi）、ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（H. zimbabwiensis）などが挙げられる。
　ヘマトコッカス・プルビアリス（H. pluvialis）としては、ＵＴＥＸ２５０５株、Ｋ００８４株などが挙げられる。
　ヘマトコッカス・ラクストリス（H. lacustris）としては、ＮＩＥＳ１４４株、ＡＴＣＣ３０４０２株、ＡＴＣＣ３０４５３株、ＩＡＭ　Ｃ－３９２株、ＩＡＭ　Ｃ－３９３株、ＩＡＭ　Ｃ－３９４株、ＩＡＭ　Ｃ－３３９株、ＵＴＥＸ　１６株、ＵＴＥＸ２９４株などが挙げられる。
　ヘマトコッカス・カペンシス（H. capensis）としては、ＵＴＥＸ　ＬＢ１０２３株などが挙げられる。
　ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（H. droebakensi）としては、ＵＴＥＸ　５５株が挙げられる。
　ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（H. zimbabwiensis）としては、ＵＴＥＸ　ＬＢ１７５８株などが挙げられる。
　これらの中でも、ヘマトコッカス・プルビアリスが好ましく用いられる。
（グリーンステージ）
　本発明におけるグリーンステージとは、緑藻類の培養において培養液が緑色ないし褐色である状態のことを示し、これは培地内の細胞が適切な光照射培養条件下で緑色の遊走細胞として生育する状態に該当する。
　一方、光環境や栄養枯渇などのストレスにより遊走細胞がシスト細胞へと変化し、著量のアスタキサンチンを細胞内に蓄積して培養液が赤色となった状態のことをレッドステージと呼ぶ。
　なお、適切な光照射培養条件とは、明細書中に記載の波長を有する赤色照明光、青色照明光を、明細書中に記載の照射時間および非照射時間、光量、照射装置で照射し、明細書中に記載の藻類、培地、培養装置、培養条件で培養することを示す。
　グリーンステージからレッドステージに移行するグリーンステージの終期では、緑色の細胞（遊走細胞の状態を維持している細胞）と赤色の細胞（シスト細胞へと変化した細胞）が混在し、培養液の色が褐色に変化する。やがて遊走細胞は見られなくなり、著量のアスタキサンチンを蓄積するレッドステージに移行する。
　アスタキサンチンを大量に生産するためには、グリーンステージ、すなわち培養液が赤色となる前の状態（培養液が緑色の状態だけでなく培養液が褐色の状態も含む、培地中に遊走細胞が存在する状態）を可能な限り維持しながら、遊走細胞における生育を促進し、短時間で高密度の細胞を生産したのち、レッドステージに移行することが好ましい。本発明の生育促進方法では、これを実現させることにより細胞を短時間で高密度に生育させることができる。
（培地）
　緑藻類の培養に用いる液体培地としては特に制限はなく、一般に、増殖に必要な窒素、微量金属の無機塩（例えば、リン、カリウム、マグネシウム、鉄など）、ビタミン類（例えば、チアミンなど）などを含む培地を好適に用いることができる。例えば、ＡＦ－６培地、ＢＧ－１１培地、Ｃ培地、ＭＢＭ培地、ＭＤＭ培地、ＶＴ培地（これらの培地組成は独立行政法人国立衛生研究所ホームページの培地リストに記載されている）、などの培地およびこれらの改変培地などを用いることができる。これらの培地は緑藻類の種類や培養の目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヘマトコッカス属に属する緑藻を生育させる目的では、Ｃ培地またはＢＧ－１１培地およびこれらの改変培地を用いることが好ましい。培地には、上記組成のほか、炭素源、窒素源等の成分を適宜添加してもよい。
（培養装置）
　緑藻類の培養装置としては、二酸化炭素の供給と光照射が可能な装置であれば、特に形状や大きさの制限はない。例えば、実験室で行う場合には、扁平な培養ビン、三角フラスコ、平底フラスコ、などを用いることができる。パイロットスケールや工業生産スケールで実施する場合は、ガラス製またはプラスチック製の透明容器に、外部または内部から光を照射できる装置を備えた培養槽や、金属容器内に内部から光を照射できる装置を備えた培養槽などを用いることができる。このような培養槽としては、例えば、ジャー型培養槽、チューブ型培養槽、エアドーム型培養槽、中空円筒型培養槽などが用いられる。また、いずれの場合も密閉容器が好ましく用いられる。これらには必要に応じ、攪拌機を設置してもよい。
（培養条件）
　培養条件には特に制限はなく、一般に緑藻類の培養に用いられる温度、ｐＨなどが用いられる。緑藻類の培養温度は、例えば１５～３５℃、好ましくは２０～２５℃のうちの一定温度に制御される。培養液のｐＨは、４～１０、好ましくは５～９、さらに好ましくは６～８に保たれる。
　炭素源の供給およびｐＨを制御する目的で、二酸化炭素を供給することが好ましい。二酸化炭素は、通常１～１０ｖ／ｖ％濃度の二酸化炭素を含有する混合空気を培地中または培養槽の上部空間に供給する。例えば、０．２～２ｖｖｍとなるように連続的に流通させることで供給される。あるいは上記混合空気で培養槽の上部空間を置換して密閉し、これを繰り返すことにより間欠的に供給してもよい。二酸化炭素の濃度は緑藻類の生育に応じて適宜濃度を変えたり、流通量を変えたりすることか好ましい。好ましい培養条件の一例としては、例えば温度２０℃、ｐＨ７で、緑藻類の細胞に光が均一に照射されるように緩やかに撹拌された状態で、５ｖ／ｖ％濃度の二酸化炭素を含有する混合空気を１ｖｖｍとなるように連続的に流通させ、緑藻類の生育に応じてｐＨ７を維持するように適宜流通量を変えて供給しながら培養を行う。
（藻体量測定）
　緑藻類の生育状態の測定は、培養液の吸光度測定、蛍光測定、血球計算盤による測定、コールターカウンター、乾燥重量測定等の既知の方法で測定することができる。このうち、５６０ｎｍの吸光度測定、血球計算盤による測定、乾燥重量測定で行うことが好ましい。
　以下、実施例により本発明の効果をより明らかなものとする。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することができる。
　なお、本実施例では、ヘマトコッカス・ラクストリスＮＩＥＳ－１４４株を用いた実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に制限されない。
（実施例１）（緑藻の調製）
　ＢＧ－１１培地の改変培地を調製した。表１に培地組成を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　５０ｍｌ容培養フラスコに２０ｍｌの培地を入れ、ヘマトコッカス・ラクストリスＮＩＥＳ－１４４株を接種した。光源は白色蛍光灯を用い、光量子計（システムインスツルメンツ社製）を用いて光合成有効光量子密度（ＰＰＥＤ）が培養フラスコの照射面で３０μｍｏｌ／ｍ２／ｓになるように調整し、培地に、照射時間を１２時間、非照射時間を１２時間として断続的に光照射を行い、２０℃にて１４日間培養を行い、細胞密度が２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液を調製した。
（本培養）
　１００ｍｌ容三角フラスコに２０ｍｌの同培地を入れ、上記の培養液を２ｍｌ接種した。光源に３ｉｎ１ＬＥＤ照明（日本医科器械製、波長　赤：６６０ｎｍ、緑：５２０ｎｍ、青：４５０ｎｍ）を用い、光量子計を用いてＰＰＥＤが培養液の照射面で赤６２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、青１８．８μｍｏｌ／ｍ２／ｓになるように調整し、培地に青色照明光を連続的に照射しながら、赤色照明光の照射時間を１２時間、非照射時間を１２時間として断続的に繰り返し照射し、２０℃、ｐＨ７にて６日間培養を行った。この時、赤色照射光および青色照射光の２４時間当たりの光量比は５：３であった。
　なお、二酸化炭素の供給の際は、７～１０ｖ／ｖ％濃度で二酸化炭素を含有するガスを、滅菌フィルタを通してフラスコのヘッドスペースに通気し、十分置換させたのち、ブチルゴム栓をした。サンプリング時に開放した場合、その都度同様の手順でヘッドスペースを置換した。
　培養中、二酸化炭素濃度は培地のｐＨが７になるよう調整した。具体的には０～４日目までは７ｖ／ｖ％、４日目以降は１０ｖ／ｖ％となるよう、供給する二酸化炭素濃度を調整した。
　途中適宜サンプリングを行い、５６０ｎｍの吸光度（Ａ５６０）、遊走細胞率を測定した。遊走細胞率は血球計算盤を用いて細胞中の遊走細胞率を算出した。また、培養液の色を観察した。
（実施例２）
　光の照射条件を赤７５μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、青１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓになるように調整した以外は実施例１と同様に培養を行った。この時、赤色照射光および青色照射光の２４時間当たりの光量比は３：１である。
（実施例３）
　光の照射条件を赤８７．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、青６．３μｍｏｌ／ｍ２／ｓになるように調整した以外は実施例１と同様に培養を行った。この時、赤色照射光および青色照射光の２４時間当たりの光量比は７：１である。
（比較例１）
　光の照射条件を赤３１．３μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、青１８．８μｍｏｌ／ｍ２／ｓになるように調整し、培地に赤色照射光および青色照射光を同時に連続して照射した以外は実施例１と同様に培養を行った。この時、赤色照射光および青色照射光の２４時間当たりの光量比は５：３であった。
（比較例２）
　光源に白色蛍光灯を用い、光の照射条件を５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓになるように調整し、培地に連続して照射した以外は実施例１と同様に培養を行った。
　（比較例３）
　光の照射条件を赤３７．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、青１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓになるように調整し、培地に赤色照射光および青色照射光を同時に連続して照射し、本培養を6日間行った以外は実施例１と同様に培養を行った。この時、赤色照射光および青色照射光の２４時間当たりの光量比は３：１である。
（比較例４）
　光の照射条件を赤４３．７μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、青６．３μｍｏｌ／ｍ２／ｓになるように調整し、培地に赤色照射光および青色照射光を同時に連続して照射し、本培養を6日間行った以外は実施例１と同様に培養を行った。この時、赤色照射光および青色照射光の２４時間当たりの光量比は７：１である。
　実施例１、比較例１～４の４日目および６日目のＡ５６０の結果を以下に示す。
　実施例１では比較例１、２よりＡ５６０が高く、生育が促進していた。遊走細胞率は７０％、培養液の色は緑色で、グリーンステージを維持していた。
　実施例２，３では比較例３，４より、Ａ５６０、細胞密度ともに高く、生育が促進していた。培養液の色は６日目で実施例２，３、比較例３，４のいずれも緑色で、遊走細胞率はいずれも７０％以上であり、グリーンステージを維持していた。
　一方比較例１、２では、６日目の培養液の色が赤色となり、グリーンステージを維持することができなかった。
　一方比較例３，４では、６日目の培養液の色は緑色を維持していたものの、細胞が凝集して沈殿を生じた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (10)

  1. 　アスタキサンチンを蓄積する緑藻類に人工光を照射して、前記緑藻類が緑色の遊走細胞である状態での生育を促進させる緑藻類の培養方法であって、
    　青色照明光を連続的に照射しながら、赤色照明光を断続的に照射して、前記緑藻類の培養液が緑色ないし褐色である状態を維持しながら、前記緑藻類を液体培地で生育させる緑藻類生育促進方法。
  2. 　前記アスタキサンチンを蓄積する緑藻類が、ヘマトコッカス（Haematococcus）属に属する単細胞緑藻類である請求項１記載の緑藻類生育促進方法。
  3. 　前記ヘマトコッカス（Haematococcus）属に属する単細胞緑藻類が、ヘマトコッカス・プルビアリスまたはヘマトコッカス・ラクストリスである請求項２記載の緑藻類生育促進方法。
  4. 　前記赤色照明光の波長が５７０ｎｍ～７３０ｎｍ、中心波長が６４５ｎｍ～６８０ｎｍである請求項１に記載の緑藻類生育促進方法。
  5. 　前記青色照明光の波長が４００ｎｍ～５１５ｎｍ、中心波長が４４０ｎｍ～４６０ｎｍである請求項１に記載の緑藻類生育促進方法。
  6. 　前記赤色照明光の光源がＬＥＤである請求項１に記載の緑藻類生育促進方法。
  7. 　前記青色照明光の光源がＬＥＤである請求項１に記載の緑藻類生育促進方法。
  8. 　前記赤色照明光および前記青色照明光の光量が、前記培養液の光照射面における光合成光量子束密度で１０～１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓである請求項１に記載の緑藻類生育促進方法。
  9. 　前記赤色照明光の照射時間が、１回当たり１時間～２４時間であり、非照射時間が１回当たり１時間～２４時間である請求項１に記載の緑藻類生育促進方法。
  10. 　前記赤色照明光の照射と非照射を各１回ずつ行う断続照射の１サイクルの時間が２時間～２４時間である請求項１に記載の緑藻類生育促進方法。
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