KR20160114102A

KR20160114102A - 피코시아닌의 합성에서의 개선

Info

Publication number: KR20160114102A
Application number: KR1020167023096A
Authority: KR
Inventors: 첼시 마리에 브레인; 게리 스티븐 칼드웰
Original assignee: 유니버시티 오브 뉴캐슬 어폰 타인
Priority date: 2014-01-27
Filing date: 2015-01-27
Publication date: 2016-10-04
Also published as: US20160333059A1; CA2937075A1; EP3134478A1; AU2015208884A1; PL3134478T3; US10336795B2; AU2015208884B2; NZ754652A; KR102344650B1; US10072052B2; CN105940112A; ES2915054T3; US20180155401A1; CA2937075C; JP6694820B2; JP2017503516A; NZ722277A; WO2015110844A1; EP3134478B1

Abstract

본 발명은 생물학적 안료의 증가된 세포 및 배지 농도를 생성시키는 미생물 세포 배양 조건을 개시하고 있다. 본 발명은 천연 식품 착색제로서, 식품 보조 산업에서의 항산화제로서, 기능식품 산업, 제약 상업 및 약용 화장품 산업에서, 및 비-독성 잉크로서의 사용에 적용된다. 본 발명의 방법은 미생물 배양물로부터 비교적 용이하게 분리되는 안료를 생성시킨다.

Description

피코시아닌의 합성에서의 개선{IMPROVEMENTS IN THE SYNTHESIS OF PHYCOCYANINS}

다른 출원과의 관계

본 출원은 2014년 1월 27일자로 출원한 발명의 명칭 "Improvements in the Synthesis of Phycocyanin"의 미국 가특허출원 US61/931,723호 및 2014년 6월 17일자로 출원된 발명의 명칭 "Improvements in the Synthesis of Phycocyanins"의 미국 가특허출원 US62/134,479호에 대한 우선권 및 이의 이익을 주장하며, 상기 출원둘 모두는 모든 목적으로 그 전체 내용이 본원에서 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 안료의 증가된 수준 및 농도를 생성시키는 미생물 세포 배양 조건을 사용하는 것에 관한 것이다.

배경

피코시아닌(Phycocyanin: PC)는 청색 착색 담단백질(blue pigmented billiprotein), 즉, 홍조류(rhodophytes), 은편모조류(cryptomonads) 및 회색조류(glaucocystophytes)와 같은 특정의 진핵생물(eukaryotes)뿐만 아니라 원핵 시아노박테리아(prokaryotic cyanobacteria)에서 생산되는 발색단(chromophore)이다. PC는 건강 문제와 관련되는 합성 염료인 브릴리언트 블루 FCF(Brilliant Blue FCF)를 대체하는 천연 식품 착색제로서 점증적으로 개발되고 있으며; PC는 물에의 이의 높은 용해도 및 큰 pH 범위에 걸친 안정성 때문에 이러한 사용에 특히 적합하다[1]. 또한, PC는 다른 관련된 건강 이익과 함께 이의 항산화 및 항-염증 성질 때문에 고순도로 기능식품 산업, 제약 상업 및 약용 화장품 산업에서 사용된다[2-4]. 더욱 미정제된 형태로의 PC가 또한 동물 사료에 첨가제로서 사용되어 관상용 물고기 및 조류의 색상을 향상시킨다. 가장 높은 품질 및 순도로의 PC는 이의 형광 성질 때문에 실험 검정 키트에 사용된다. 일찍이 그러나 계속되고 있는 의학적 사용을 위한 PC의 치료학적 성질에 대한 연구가 또한 있다[5]. PC 시장은 초기 단계에 있다.

시아노박테리아에서, PC는 피코빌리좀(phycobillisome)으로 공지된 집광 장치(light-harvesting apparatus)로서 함께 기능하는 피코에리트린(phycoerythrin: PE) 및 알로피코시아닌(allophycocyanin: AP 또는 APC)을 포함하는 다른 담단백질(biliprotein)과 복합된 틸라코이드 막에 존재한다[6]. 피코빌리좀은 엽록소에 의해서 이용될 수 없는 광의 특정의 파장을 흡수하여, 광합성의 효율을 증가시킨다[7]. PC는 PE (540-570nm) 및 APC (650-655nm)와 함께 610-620nm에서 최대로 흡수한다[6].

시아노박테리아는 장래의 개발에 잠재성을 나타내는 진핵생물에 의한 PC 생산을 위한 수배양(aquaculture)에서 광범위하게 사용된다. 시아노박테리아 중에서, 아트로스피라 속(genus Arthrospira)(이전에는 스피룰리나(Spirulina)로서 공지되었고, 여전히 상업적으로 '스피룰리나(Spirulina)'로서 공지되어 있음)이 가장 일반적으로 배양된 속이지만; PC는 다른 속들, 예컨대, 아파니조메논(Aphanizomenon) 및 아나베나(Anabaena)로부터 추출되었다. 배양에서의 주된 종은 아트로스피라 플 라텐시스(Arthrospira platensis) 및 에이. 맥시마(A. maxima)이다. 이들은 둘 모두가 나선 모양 필라멘트 또는 분비모(trichome)를 지니는 사상 시아노박테리아(filamentous cyanobacteria)이다.

이의 높은 PC 함량 외에, 스피룰리나는 또한 많은 양의 다른 기능식품, 예컨대, 비타민 및 PUFA를 함유하며 단세포 단백질에서 높고; 그 결과, PC는 서구에서 상업적 관심이 증가하고 있다[1]. 그러나, 동양과 아프리카에서, 스피룰리나는 많은 세기 동안 식품으로서 사용되었다[9]. 스피룰리나 바이오매스는 단독으로 판매 가능한 제품이지만, 순도에 좌우되어 순수한 피코시아닌이 상당히 더 높은 시장 가격을 지닌다.

물 분자는 광의 원적외선 영역에서 흡수함에 따라서, 광합성을 위한 이러한 파장에서의 한계가 자연 조류 환경에서 발생한다[6]. 더 짧은 파장의 광 산란이 또한 자연에서의 조류에 대한 블루-그린 파장 광의 공급 편향을 생성시키는 부유 물질에 의해서 발생한다. 따라서, 환경인자가 광 이용성을 결정하며, 조류는 이용 가능한 광의 특성과 양을 이용하도록 적응할 수 있다.

PE 및 PC를 함유하는 일부 시아노박테리아는 PC:PE 비가 합성을 조절함으로써 상이한 광체계에 대한 반응으로 변경되는 보색적응(complementary chromatic adaptation)이라 일컬어지는 현상을 나타낸다[10, 11]. 최근의 연구는 에이. 플라텐시스가 특정의 광 파장의 존재하에 조작되어 PC의 생산을 증가시킬 수 있음이 밝혀졌다.

광 필터를 사용함으로써, Walter 등((2011) [12])은 적색 광(600-700nm) 하에 증가된 PC 순도를 입증하였다. Wang 등에 의한 초기의 연구는 또한 에이. 플라 텐시스 바이오매스 생산성(A. platensis biomass productivity)이 적색 광 하에 더 높은 배양을 나타냄을 밝혀냈다[13]. Wang 등에 의한 계산은, 에너지 대 바이오매스 전환(energy to biomass conversion)이 더욱 효율적임에 따라서, 적색 광의 사용이 광 독립 영양 생산(photoautotrophic production)에 경제적으로 유리할 것임을 입증하였다. Farges(2009 [19])는 또한 다색 및 단색 광원하의 에이. 플라텐시스의 성장 모델을 만들어서, 일정하게 유지되고 비교할 만한 성장 속도를 나타내면서 적색 620nm LED 하에 감소된 전기 에너지 전력 소모를 통한 배양 효율의 수학적 증가를 입증하였지만; 단색 적색 LED 광(620nm)는 화이트/다색 및 적색 + 청색 다색 LED에 비해서 에이. 플라텐시스의 PC 농도를 2-배까지 감소시키는 것으로 나타났다. 이들 연구는 광의 상이한 파장 하의 배양이 에이. 플라텐시스 배양에서의 PC 농도 및 순도에 영향을 줄 수 있음을 입증하고 있지만, 표준 적색 LED의 것 위의 파장을 이용한 시험은 수행되지 않았다.

따라서, 피코시아닌의 합성을 위한 개선되고 덜 비용 소모적인 방법에 대한 본 기술분야에서의 요구가 있다.

발명의 요약

본원에 개시된 발명은 피코시아닌의 개선된 합성에 사용될 수 있는 장치 및 방법을 제공한다. 그러한 방법은 피코시아닌 수준을 10배 초과로 증가시키며, 이는 종래 기술에 비한 명백한 개선이다. 그러한 방법은 또한 피코시아닌을 수확하는 것을 개선시킨다.

본원에 개시된 장치는 천연 식품 착색제로서, 식품 보조 산업에서의 항산화제로서, 기능식품 산업, 제약 상업 및 약용 화장품 산업에서, 및 비-독성 잉크로서의 사용을 포함하지만 이로 제한되는 것은 아닌 많은 적용에서 사용될 수 있다.

본 발명은 피코시아닌, 및 히알루로난(hyaluronan), 글루코사민(glucosamine), 그 밖의 사카라이드(saccharide) 및/또는 폴리사카라이드를 포함하지만 이로 제한되는 것은 아닌 그 밖의 생화학적 조성물, 및 알로피코시아닌(allophycocyanin), 피코에리트린(phycoerythrin), 빌린(bilin), 피코빌린(phycobilin), 프로테오글리칸(proteoglycan), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)과 같은 그러나 이로 제한되는 것은 아닌 그 밖의 피코담단백질(phycobiliprotein) 등의 합성 및 상업적 생산을 위한 개선된 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 피코시아닌을 합성할 수 있는 미생물을 제공하는 단계, 적합한 배양 및 성장 배지를 제공하는 단계, 적색 광 및/또는 근적외선 광으로 배양 중의 미생물을 조명하는 단계, 및 대안적으로 적색광 및/또는 근적외선 단색광으로 배양 중의 미생물을 조명하는 단계를 포함한다. 대안적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한 백색 광으로 배양중의 미생물을 조명하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 천연 또는 인공 에너지원으로부터의 에너지를 사용하여 탄소-기반 조성물을 광합성할 수 있는 유기체를 제공하는 단계를 포함한다. 그러한 유기체는 광합성 박테리아, 광합성 고세균류(archaean), 광합성 원생생물, 광합성 조류(alga), 광합성 이끼 또는 광합성 식물일 수 있다. 유기체는 천연종일 수 있거나, 그것은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 합성 유기체일 수 있다. 유기체는 재배된 식물종일 수 있고, 또한 또 다른 유기체로부터의 DNA를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 근적외선 광은 약 630nm 내지 약 720nm의 파장을 지니는 전자기 방사선을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 근적외선 단색광은 약 680nm의 파장을 지니는 전자기 방사선을 포함한다. 대안적인 구체예에서, 근적외선 단색광은 약 678nm의 파장을 지니는 전자기 방사선을 포함한다. 또 다른 대안적인 구체예에서, 근적외선 단색광은 약 682nm의 파장을 지니는 전자기 방사선을 포함한다. 일 구체예에서, 백색 광은 약 350nm 내지 약 760nm의 파장을 지니는 전자기 방사선을 포함한다. 또 다른 대안적인 구체예에서, 근적외선 단색광은 약 650nm의 파장을 지니는 전자기 방사선을 포함한다. 또 다른 대안적인 구체예에서, 근적외선 단색광은 약 720nm의 파장을 지니는 전자기 방사선을 포함한다. 또 다른 대안적인 구체예에서, 단색광은 약 450 내지 590nm의 파장을 지니는 전자기 방사선을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 적색광은 640nm 내지 720nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 또 다른 구체예에서, 적색광은 640nm 내지 1000nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 또 다른 구체예에서, 적색광은 680nm의 최대 파장 방출을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 대안적인 구체예에서, 적색광은 678nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 또 다른 대안적인 구체예에서, 적색광은 682nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 일 구체예에서, 백색광은 350nm 내지 760nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 합성된 피코시아닌은 미생물로부터 침출된다.

또 다른 구체예에서, 피코시아닌을 합성할 수 있는 미생물은 연못 시스템 또는 개방 수로 시스템(open raceway system)에서 배양된다. 바람직한 구체예에서, >640nm LED 로드가 연못 시스템 또는 개방 수로 시스템에 놓이며, 이는 미생물에서의 피코시아닌의 증가된 합성을 유도한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 용기와 램프를 포함하는 피코시아닌을 생성시키는 시스템으로서, 램프가 적어도 640nm 또는 그 초과의 파장을 지니는 전자기 에너지를 생성시키고, 용기가 피코시아닌을 합성할 수 있는 미생물을 추가로 포함하는 시스템을 고려한다.

도 1은 광합성에서의 에너지 전환 과정의 개략도이다. P680 및 P700은 각각 광화학계 II(Photosystem II) 및 광화학계 I의 반응 중심 Ch1 a를 나타낸다. 피코시아닌(PC)(610-620nm)은 광합성에 사용되는 빛의 특정한 파장을 흡수하는 피코빌리좀 집광 장치(phycobilisome light harvesting apparatus)를 위한 피코에리트린(PE)(540-570nm) 및 알로피코시아닌(APC)과의 복합체로 존재한다.
도 2는 상호교환 가능한 LED 재킷이 구비된 인포스 교반형 탱크 광생물반응기 시스템(Infors Stirred Tank Photobioreactor system)을 도시하고 있다.
도 3은 전형적인 백색 LED, 전형적인 적색 LED(전형적으로 약 620-640nm 주변) 및 680nm LED 광을 포함하는 전형적인 방출 스펙트럼을 도시하고 있다. 오른쪽은 680nm의 최적 방출 파장을 지니는 좁고 강한 광을 방출하는 680nm LED의 방출 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 두 개의 광 조건하에 성장에서 현저한 차이를 보이지 않으면서, 전형적인 백색 LED에 비교한 680nm LED 하의 에이. 플라텐시스(A. platensis)의 평균 성장 속도를 나타내고 있는 표로서, 에이. 플라텐시스 배양의 분리 배치 가동(separate batch run)에 대한 성장 곡선을 도시하고 있다(오차 막대는 평균표준오차를 나타낸다).
도 5는 전형적인 백색 LED와 비교한 680nm LED 하에 배양된, 678nm에서 표준화된, 에이. 플라텐시스로부터의 피코시아닌 추출물의 흡수 스펙트럼을 도시하고 있다. 가는 파선은 오차를 나타낸다(s.e.m., 평균 표준 오차). 피코시아닌을 나타내는 더 큰 흡수 피크는 680nm LED 하에 배양된 에이. 플라텐시스로부터의 추출물에서 620nm 주변에서 찾아볼 수 있다.
도 6은 전형적인 백색 LED와 비교한 680nm LED 하에 배양된 에이. 플라텐시스로부터의 평균 피코시아닌 수율(mg/g)을 도시하고 있다. 오차 바(Error bar)는 평균 표준 오차를 나타낸다. 피코시아닌 수준에서의 큰 유의한 증가는 680nm LED 하의 배양을 통한 에이. 플라텐시스에서 찾아볼 수 있다.
도 7에서는, 전형적인 백색 LED와 비교한 680nm LED 하에 배양된 에이. 플라 텐시스 배양에 대한 질량 스펙드럼이 두 가지 광 조건하에 풍부한 단백질에서의 차이를 나타내고 있다.
도 8은 왼쪽에 전형적인 백색 LED 하에 배양한 것으로부터의 에이. 플라텐시 스 배양물(상부) 및 추출물(하부)을 나타내고 있으며, 오른쪽에 680nm LED 하에 배양한 것으로부터의 에이. 플라텐시스 배양물(상부) 및 추출물(하부)을 나타내고 있다.
도 9에서는 이전의 배치(batch)로부터 접종되고 680nm LED 하에 배양된 에이. 플라텐시스의 분리된 배치에 대한 평균 피코시아닌 수율(mg/g)이 각각의 후속 진행에 의해서 피코시아닌 수율이 증가함을 나타내고 있으며, 이는 에이. 플라텐시스가 광합성에서 680nm 광을 더욱 효율적으로 이용하는 것을 가능하게 하게 위해 계속 적응중임을 나타내는 것으로 예상된다.
도 10은 680nm 광하의 에이. 플라텐시스 배치 배양에 대한 성장 곡선을 나타낸다. 파선은 680nm 광의 이용에 대한 순응(acclimatization)을 진행하고 있는 에이. 플라텐시스를 나타내고 있다. 순응이 발생하고 있는 지연 상(lag phase)은 14일까지 존재한다.
도 11은 상부 좌측에 680nm LED 하에 배양된 더 높은 피코시아닌-생성 에이. 플라텐시스의 응집을 나타내고 있다. 현미경 이미지는, 비-응집 배양물에는 부재하는, 가능하게는 스트레스 반응으로써 세포외 폴리사카라이드의 증가를 나타내는 응집된 배양물 중의 에이. 플라텐시스 모상체(A. platensis trichome) 상의 결정의 존재를 나타내고 있다.

일반적인 개시

본 문서에서 개시되고 있는 구체예는 예시적이며 전형적인 것이고, 본 발명을 제한하는 것을 의미하지 않는다. 그 밖의 구체예가 이용될 수 있으며, 구조적인 변화가 본 발명의 청구범위를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다.

본원 및 청구범위에서 사용된 단수형은 문맥이 명확하게 달리 나타내지 않는한 복수의 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "입자"의 언급은 복수의 그러한 입자를 포함하고, "표면"의 언급은 하나 이상의 표면 및 이의 균등물에 대한 언급이며, 그러한 등등이다.

전자기 방사선의 파장의 문맥에서 사용되는 때의 기호 "≥"은 같거나 더 큼을 의미하며; 용어 "≥640nm"는 적어도 640nm 또는 그 보다 더 큰 파장, 예를 들어, 640 또는 641nm을 지니는 전자기 방사선을 의미한다.

전자기 방사선 파장의 문맥에서 사용되는 때의 용어 "약"은 기재된 파장의 2nm 이내의 파장을 의미하고; 따라서, "약 640nm의 파장"은 638nm 내지 642nm의 전자기 파장을 의미한다.

발명의 상세한 설명

본원에 개시된 발명은 피코시아닌의 합성에 사용될 수 있는 장치 및 방법을 제공한다. 그러한 방법은 피코시아닌 수준에서 4.5-배 초과의 증가를 유도하며, 이는 종래 기술에 비한 명확한 개선이다. 본원에 개시된 장치는 천연 식품 착색제로서, 식품 보조 산업에서의 항산화제로서, 기능식품 산업, 제약 산업 및 약용 화장품 산업에서, 및 비-독성 잉크로서의 사용을 포함하지만 이로 제한되는 것은 아닌 많은 적용에서 사용될 수 있다. 본 발명은 피코시아닌의 합성 및 상업적 생산을 위한 개선된 방법을 제공한다.

예시적인 구체예에서, 그러한 방법은 피코시아닌을 합성할 수 있는 미생물을 제공하는 단계, 적합한 배양 및 성장 배지를 제공하는 단계, 적색 광 및/또는 근적외선 광으로 배양 중의 미생물을 조명하는 단계, 및 대안적으로 적색광 및/또는 근적외선 단색광으로 배양 중의 미생물을 조명하는 단계를 포함한다. 대안적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한 백색 광으로 배양중의 미생물을 조명하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 적색광은 약 640nm 내지 약 720nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 또 다른 구체예에서, 적색광은 640nm 내지 1000nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 또 다른 구체예에서, 적색광은 680nm의 최대 파장 방출을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 대안적인 구체예에서, 적색광은 678nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 또 다른 대안적인 구체예에서, 적색광은 682nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 또 다른 대안적인 구체예에서, 적색광은 690nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 또 다른 대안적인 구체예에서, 적색광은 670nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 대안적인 구체예에서, 적색광은 파장이 640-720nm의 95% 신뢰 구간내에 있는 680nm의 평균 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다. 일 구체예에서, 백색광은 350nm 내지 760nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어져 있다.

백색과 비교한 적색 680nm LED 광 하의 배양은 에이. 플라텐시스에서 평균 5-배까지 PC 생산을 증가시키는 것을 나타났고, 이들 효과는 배양물에서 시각적으로 나타날 수 있다. 질량 스펙트럼 분석은 두 가지의 상이한 광원 하의 배양을 통한 단백질 수준에서 일부 주된 차이 및 변화를 보였다. 두 광원하에서의 성장률에서의 유의한 차이는 나타나지 않았다.

본 발명은 본 발명을 제한하는 것이 아니라 단지 본 발명의 특정의 양태 및 구체예의 예시 목적으로 포함되는 하기 실시예를 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 것이다.

실시예

실시예 I: 배치 배양

2.5 g/l NaN0₃ (pH 8)로 보충된 F/2 살균 배지(CCAP[Culture Collection of Algae and Protozoa] 레시피)에 대수 생장기(logarithmic growth phase)에 있는 아 트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis)(CCMP [Culture Collection of Marine Phytoplankton] 1295/ Bigelow Laboratory US) (OD 0.11-0.12)로 20 % (v/v)를 무균 조건하에 접종하였다. 백색(Lumitronix Barre LED High-Power SMD 600 mm, 12 V) 또는 680nm 적색 LED(도 2 및 도 3)를 구비한 교반 탱크 광생물반응기(stirred tank photobioreactor: STPBR)(Infors Labfors 4 benchtop modified bioreactor)를, 거어즈를 댄 고리형 스파저(gauzed ring sparger)를 통해서 0.08 LPM(VVM(volume of air per volume of culture per minute: 분당 배양물의 체적당 공기의 체적)에서 ~0.03의 분당 배지 리터 당 공기 리터(litres air per litres medium per minute: LPM)로 공급되는 압축된 천연 공기(~0.03 % C0₂)와 함께, 2.75 ℓ의 배양물을 사용하여 30℃ 및 45 μmol^-1m^-2 광 세기에서 18:6의 주:야 주기 및 200rpm의 임펠러 속도로 작동시켰다. pH 및 용존 산소를 10분 간격(Mettler Toledo probes)으로 온라인 기록하였다. 8ml의 샘플을 분석을 위해서 1일(접종), 3, 6, 7, 10, 13, 및 14일에 무균적으로 채취하였다.

실시예 II: 성장 측정

광학 밀도(Optical density: OD)를 성장에 대한 프록시(proxy)로서 엽록소 자가형광(chlorophyll autofluorescence: CF) 및 직접적인 세포 계수와 함께 사용하였다. OD는 F/2 배지로 보정된 Cary 100 UV/Vis Spectrophotometer(Varian)를 사용하여 750nm에서 삼중으로 측정하였다(Griffiths et al. (2011) [14]). CF를 검은 96 웰 플레이트의 각각의 웰로 분할된 세 개의 삼중 300㎕ 샘플에서 분석하였다. 샘플을 430nm에서 여기(excite)시키고, FLUOstar OPTFMA 형광 플레이트 리더(FLUOstar OPTFMA fluorescence plate reader: BMG LAB TECH)를 사용하여 690nm에서 방출을 측정하였다. F/2 배지의 블랭크 샘플과 대조하여 판독값을 취하고 임의적인 형광 단위에서의 평균 값을 통계적 분석을 위해서 사용하였다. 세즈윅 라프터 카운팅 셀(Sedgewick rafter counting cell)을 사용하고 레이츠 다이아룩스 20 라이트 현미경(Leitz Dialux 20 light microscope)을 사용하여 세포 계수를 수행하였다. 삼중의 10개 무작위 샘플 계수를 1㎕의 배양물에 대해서 수행하였다.

실시예 III: 형태학적 평가

20개의 시아노박테리아의 나선의 전체 길이 및 폭을 측정하여 모상체의 형태학적 특징에서의 어떠한 변화를 검정하였다. 레이츠 다이아룩스 20 라이트 현미경을 사용하여 이미지를 취하고 분석 기능이 있는 이지그랩 소프트웨어(EasyGrab software)를 이미지 제이(Image J)를 사용하여 수행하엿다. 이미지 크기를 630 픽셀 mm^-1에서의 계수선을 이용하여 측정하였다.

실시예 IV: 피코시아닌 분석

PC 추출은 Zhang 및 Chen((1999) [15])의 방법을 기초로 하였다. 5mL의 샘플을 사전-칭량된 유리 튜브에서 3000g/10분에서의 원심분리(Sigma 3K18C centrifuge)에 의해서 수거하였다. 세포를 탈이온수에서 한번 세척하고, 습윤 바이오매스(biomass)를 칭량하였다. 이어서, 펠릿을 3 mL 0.05 M 소듐 포스페이트 완충액(pH7)에 재현탁시켰다. 세포를 동결/해동 사이클(-20℃)로 1 시간에 걸쳐서 파괴하고 6 마이크론 진폭(Soniprep 150, MSE)에서 3 분동안 음파파쇄하였다. 이어서, 샘플을 10,000g, 30분(Sigma 1-15 microcentrifuge)에서 원심분리하고, 상등액의 흡광도를 석영 큐벳(quartz cuvette)을 사용하는 분광광도계(Cary 100 UV-Vis spectrophotometer, Varian)에 의해서 200-800nm에 걸쳐서 스캐닝하였다. 소듐 포스페이트 완충액(0.05 M)을 블랭크로서 사용하였고, PC 농도 및 순도를 각각 Bennet 및 Bogorad((1973) [10] (방정식 1)) 및 Boussiba 및 Richmond((1979) [16] (방정식 2))에 의한 방법을 이용하여 계산하였다. 추출 수율을 방정식 3으로 이하와 같이 계산하였다. PC 농도를 세 개의 삼중으로 14일째에(또는 성장이 OD 0.33에 도달하는 때에) 분석하였다.

1. PC (mg/mL) = (A620-0.474(A655))/5.34.

2. PC 순도 = A620/A280.

3. 추출 수율(mg PC/mg 바이오매스) = (PC 농도 * 용매의 체적(mL)/바이오매스(mg)

실시예 V: 질량 분광분석(MS) 분석

매트릭스 제조: 20mg 알파-시아노-4-하이드록시신남산(HCCA)(Brucker Daltonics)을 1ml 50% 아세토니트릴:2.5% TFA 용액과 혼합하고, 초음파 수조(Grant instruments, Cambridge)에서 25℃에서 30분 인큐베이션(incubation)에 의해서 포화시키고, 15분에서 와동시켰다. 매트릭스를 원심분리(14,000g, 1 분)(Sigma 1-15K microcentrifuge)하고, 신선한 50㎕의 부분 표본을 사용을 위해서 준비하였다.

샘플 제조: 1mL의 샘플을 원심분리(14,000g, 5 분)(Sigma 1-15K microcentrifuge)하고 펠릿을 신선한 탈이온수(fdw)로 2회 세척하고, -80℃에서 동결 저장하였다. 펠릿을 얼음상에서 해동시키고, 스폿팅(spotting)전에 50㎕의 fdw에 재현탁시켰다. 샘플을 HCCA 매트릭스와 1:1로 혼합하고, 4㎕의 이중 샘플을, 보정물질(calibrant)로서 1㎕의 HCCA 매트릭스로 층화된 1㎕ 박테리아 표준(Brucker)과 함께, 스틸 타켓 플레이트(steel target plate)(MTP 384 target plate ground steel, Brucker) 상에 스폿팅하였다. 이어서, 샘플을 MS 분석을 수행하였다((Bruker ultraflex II maldi-toftof). 플렉스아날리시스 소프트웨어 패키지(flexAnalysis software package, Bruker)를 사용하여 스펙트럼을 분석하였다.

실시예 VI: 집단 분석(Population Analysis)

샘플을 집단 분석을 위해서 15% 무균 글리세롤에 동결시키고 -80℃에서 동결시켰다(Dr Andrew Free and Rocky Kindt, Edinburgh University).

실시예 VII: 통계학적 분석

Microsoft Excel 2007 및 Graphpad Prism 5를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.

실시예 VIII: 결과: 성장

백색 LED 광과 비교한 적색 680nm 하에 배양물의 성장에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 4). 배치 레드 2(batch Red 2)에서의 큰 순응 지연기(acclimatization lag period)에 주목해야 한다(도 4). 배양물은 광합성에서 적색 680nm 광을 사용할 수 있도록 순응하기 위한 기간을 필요로 하였으며(관찰로부터), 이러한 순응은 가역적이었다.

실시예 IX: 결과: PC 분석

피코시아닌은 620nm에서 흡수한다. 백색 LED에 비한 적색 680nm LED 배치의 추출물에서의 PC의 존재는 훨씬 더 높았다(도 5 및 도 6). 흥미로운 청색-이동(blue-shift)이 670-680nm 주변의 두 번째 엽록소 a 피크에서 관찰되었으며, 여기서, 피크 레드 680nm 추출물 흡수(peak red 680nm extract absorption)는 677-678nm이고 피크 화이트 추출물 흡수는 673-674nm이다(도 6)

PC 농도는 백색 LED 광에 비해서 적색 680nm하의 배양을 통해서 평균 5-배(적어도 9개의 샘플에서) 증가하였으며, 백색에 비해서 적색 680nm LED 광하에 약간 더 높은 PC 순도가 있었다(도 7 표). 가시적 색상 차이가 배양물에서 관찰되었으며, 이는 아마도 적색 680nm 광 하에 배양된 세포의 증가된 PC 함량으로부터 발생되는 듯하다(도 7).

실시예 X: 결과: MS 분석

전세포 MALDI 스펙트럼(Whole cell MALDI spectra)은 백색 LED 광에 비해서 적색 680nm 하에 배양으로부터 풍부한 단백질에서 차이를 나타냈다(도 8).

실시예 XI: 결과: 침출 차이

MS 분석을 위해서 제조된 샘플을 폐기할 때에, 고농도의 PC가 적색 680nm 샘플 중의 용액내로 침출되었다(도 9). 침출된 PC에서의 육안에 의한 색상 차이는 백색 LED 광에 비해서 적색 680nm 배양물에서 실질적으로 더 높아서, 5-배 훨씬 더 증가를 나타냈다. 이러한 결과는 적색 680nm 배양물에서의 PC 침출 특성에서의 가능한 차이를 나타냈으며, 이는 하류 처리(downstream processing: DSP)에 유익할 수 있다. 680nm 광 하의 배양은 바이오매스로부터의 PC의 침출을 증가시킬 수 있다.

실시예 XII: 결과: 배양 집합체(Culture aggregation)

680nm 광 하의 배양은 또한 배양물의 집합체를 증가시키고 DSP에 유익하게 할 수 있다. 집합체는 스트레스 반응으로서 세포외 폴리사카라이드(extracellular polysaccharide: EPS)의 증가된 생산 결과일 수 있다. 이것은 명확하게 당업자에 의해서 예상될 수 없는 예상치 못한 우수한 결과이다.

당업자는 앞서 기재된 구체예의 다양한 조정 및 변화가 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 구성될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 기술 분야에서 공지된 다른 적합한 기술 및 방법이 당업자에 의해서 많은 특이적 양상으로 그리고 본원에 기재된 본 발명의 설명을 고려하여 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명이 본원에서 특별히 기재된 바와 다르게 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 상기 설명은 예시적인 것이며 제한하고자 하는 것이 아니다. 많은 다른 구체예가 상기 설명을 검토하는 당업자에게는 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는, 첨부된 청구범위에 의해서 정해지는 전체 균등물 범위와 함께, 그러한 청구범위를 기준으로 하여 결정되어야 한다.

참고문헌

Claims

(i) 미생물을 적합한 성장 배지에서 배양하는 단계 및 (ii) 적합한 광원을 제공하는 단계를 포함하는 피코시아닌(phycocyanin)의 합성 방법으로서,
광이 약 640 내지 약 720nm의 파장을 지니는 전자기 방사선으로 이루어지고 배양 중의 미생물이 피코시아닌을 합성하는 합성 방법.
제1항에 있어서,
미생물이 아트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis) 또는 아트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)(스피룰리나(Spirulina) 또는 아트로스피라 속)인 합성 방법.
제1항에 있어서,
전자기 방사선이 680nm의 최대 파장을 지니는 합성 방법.
제3항에 있어서,
전자기 방사선이 682nm의 최대 파장을 지니는 합성 방법.
제3항에 있어서,
전자기 방사선이 678nm의 최대 파장 방출을 지니는 합성 방법.
제1항에 있어서,
제2광원을 제공하는 추가의 단계를 추가로 포함하고, 제2광원의 광이 350 내지 760nm의 파장을 지니는 전자기 방사선을 포함하는 합성 방법.
제1항에 있어서,
합성된 피코시아닌의 양이 백색 광의 존재하에 배양된 동일한 미생물에서 합성된 피코시아닌의 양보다 적어도 4-배 더 큰 합성 방법.
제7항에 있어서,
백색 광이 350nm 내지 760nm의 파장을 지니는 전자기 방사선을 포함하는 합성 방법.
제7항에 있어서,
합성된 피코시아닌이 미생물로부터 침출되는 합성 방법.
제1항에 있어서,
미생물이 또 다른 유기체로 대체되며, 다른 유기체가 광합성 박테리아, 광합성 고세균류(photosynthetic archaean), 광합성 원생생물, 광합성 조류(photosynthetic alga), 광합성 이끼(photosynthetic moss), 및 광합성 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 합성 방법.
제10항에 있어서,
유기체가 재조합 DNA를 포함하는 합성 방법.
제1항에 있어서,
방법이 생화학물질의 합성에 적합하고, 생화학물질이 히알루로난(hyaluronan), 글루코사민(glucosamine), 사카라이드(saccharide), 폴리사카라이드, 피코담단백질(phycobiliprotein), 알로피코시아닌(allophycocyanin), 피코에리트린(phycoerythrin), 빌린(bilin), 피코빌린, 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 합성 방법.
용기(vessel) 및 램프를 포함하는 피코시아닌을 생산하기 위한 시스템으로서, 램프가 적어도 640nm 또는 그 초과의 파장을 지니는 전자기 에너지를 생산하고, 용기가 피코시아닌을 합성할 수 있는 미생물을 추가로 포함하는 시스템.