ES2915054T3 - Mejoras en la síntesis de ficocianinas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para sintetizar ficocianina a partir de cianobacterias, comprendiendo el procedimiento los pasos de: (i) cultivar una cianobacteria en un medio de crecimiento adecuado; y (ii) proporcionar una fuente de luz adecuada, donde la luz consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de entre 670 y 690 nm.

Description

DESCRIPCIÓN

Mejoras en la síntesis de ficocianinas

Relación con otras solicitudes

Esta solicitud reivindica la prioridad y los beneficios de las siguientes: solicitud de patente provisional de los Estados Unidos Número US61/931,723 presentada el 27 de enero de 2014, intitulada "Mejoras en la síntesis de ficocianina" y solicitud de patente provisional de los Estados Unidos número US62/134,479 presentada el 17 de junio de 2014, intitulada "Mejoras en la síntesis de ficocianinas".

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de condiciones de cultivo celular que dan como resultado mayores niveles y concentraciones de pigmentos como la ficocianina de las cianobacterias.

Antecedentes

La ficocianina (PC) es una biliproteína pigmentada de azul, un cromóforo producido en las cianobacterias procariotas, así como en ciertas eucariotas, como las rodofitas, las criptofitas y las glaucocistofitas. La PC se explota cada vez más como colorante alimentario natural, reemplazando al colorante sintético Brilliant Blue FCF que se ha asociado con problemas de salud; PC es particularmente adecuada para este uso debido a su alta solubilidad en agua y estabilidad en un amplio rango de pH [1]. Además, la PC se usa en las industrias nutracéutica, farmacéutica y cosmecéutica en purezas más altas por sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias, junto con otros beneficios para la salud asociados [2-4]. La PC en su forma más cruda también se usa como aditivo en los alimentos para animales para realzar el color de los peces y aves ornamentales. En su máxima calidad y pureza, la PC se utiliza en kits de ensayo de laboratorio por sus propiedades fluorescentes. También hay una investigación temprana, pero en curso sobre las propiedades terapéuticas de la PC para uso médico [5]. El mercado de PC está en su infancia.

En las cianobacterias, la PC está presente en la membrana tilacoide en forma de complejo con otras biliproteínas, incluidas la ficoeritrina (PE) y la aloficocianina (AP o APC), que juntas funcionan como un aparato captador de luz conocido como ficobilisoma [6]. El ficobilisoma absorbe longitudes de onda de luz específicas que la clorofila no puede utilizar, lo que aumenta la eficiencia de la fotosíntesis [7]. PC absorbe al máximo a 610-620 nm con PE (540-570 nm) y APC (650-655 nm) [6].

Las cianobacterias se utilizan ampliamente en la acuicultura para la producción de PC y los eucariotas muestran potencial para la explotación futura. Entre las cianobacterias el género Artrospira (anteriormente conocido como espirulina y aún conocido comercialmente como 'Spirulina') es el género más comúnmente cultivado; sin embargo, PC se ha extraído de otros géneros como Afanizomenón y Anabaena. Las principales especies en cultivo son Arthrospira platensis y A. máxima. Ambas son cianobacterias filamentosas con tricomas o filamentos en forma de espiral.

Además de su alto contenido de PC, la espirulina también contiene grandes cantidades de otros nutracéuticos, como vitaminas y PUFA, y tiene un alto contenido de proteínas unicelulares; como resultado, la PC se está convirtiendo en un interés comercial cada vez mayor en occidente [1]. Sin embargo, en oriente y África, la espirulina se ha utilizado como alimento durante muchos siglos [9]. La biomasa de espirulina es un producto vendible solo, sin embargo, la ficocianina pura, dependiendo de la pureza, tiene un precio de mercado considerablemente más alto.

A medida que las moléculas de agua se absorben en la región de la luz que es roja, lejana, se producen limitaciones en esta longitud de onda para la fotosíntesis en el entorno natural de las algas [6]. La dispersión de la luz de longitudes de onda más cortas también se produce por el material en suspensión, lo que da como resultado un sesgo de suministro de luz de longitud de onda azul-verde a las algas en la naturaleza. Por lo tanto, los factores ambientales determinan la disponibilidad de luz y las algas pueden adaptarse para utilizar la calidad y cantidad de luz disponible.

Algunas cianobacterias que contienen PE y PC exhiben un fenómeno llamado adaptación cromática complementaria donde la relación PC:PE se altera en respuesta a diferentes regímenes de luz mediante la modulación de la síntesis [10,11]. Investigaciones recientes han demostrado que A. platensis puede manipularse en presencia de ciertas longitudes de onda de luz para aumentar la producción de PC.

Mediante el uso de filtros de luz Walter et al. (2011) [12] demostraron una mayor pureza de PC bajo luz roja (600-700 nm). Investigaciones anteriores de Wang et al. también encontraron que la productividad de biomasa de A. platensis era mayor cultivando bajo luz roja [13]. Los cálculos de Wang et al. demostraron que el uso de luz roja sería económicamente beneficioso para la producción fotoautótrofa, ya que la conversión de energía en biomasa es más eficiente. Farges, 2009 [19] también modeló el crecimiento de A.platensis bajo fuentes de luz policromática y monocromática, demostrando aumentos matemáticos en la eficiencia de cultivo bajo LED rojos de 620 nm a través de un menor consumo de energía eléctrica con tasas de crecimiento comparables y mantenidas; sin embargo, se demostró que la luz LED roja monocromática (620 nm) disminuye la concentración de PC de A.platensis por el doble, en comparación con los LED blancos/policromáticos y policromáticos rojo azul. Estos estudios han demostrado que el cultivo bajo diferentes longitudes de onda de luz puede afectar la concentración y pureza de PC en cultivos de A.platensis; sin embargo, no se han realizado pruebas usando longitudes de onda superiores a las de los LED rojos normales.

Bryant et al (Eur. J. Biochem., 119(2) 425-429) exploran una serie de cepas de cianobacterias, incluidas las cepas de cianobacterias "no cromáticamente adaptadas" y "cromáticamente adaptadas". Los autores concluyen que no se observa ninguna diferencia en la expresión de PC bajo luz roja en comparación con la luz verde en las cepas de cianobacterias probadas 'sin adaptación cromática'.

Takano et al (App. Microbiol and Biotech, 43(6) 1014-1018) investiga una cianobacteria, que se adapta cromáticamente, que produce ficoeritrina usando luz roja.

Dai et al (J. Microbiol and Biotech, 23 (4) 534-538) miran el efecto de la luz de diferentes longitudes de onda en el crecimiento de Nostoc Flageliforme, usando luz roja de longitud de onda no especificada.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de procedimientos mejorados y menos costosos para la síntesis de ficocianinas.

Resumen de la invención

La invención aquí divulgada proporciona dispositivos y procedimientos que pueden usarse para la síntesis mejorada de ficocianinas. El procedimiento da como resultado un aumento de más de 10 veces en los niveles de ficocianina, una clara mejora con respecto a la técnica anterior. El procedimiento también da como resultado una mejora para la recolección de ficocianinas.

Los dispositivos divulgados en este documento se pueden utilizar en muchas aplicaciones, incluido, entre otros, el uso como colorante alimentario natural, como antioxidante en las industrias de complementos alimenticios, en las industrias nutracéutica, farmacéutica y cosmecéutica, y como tinta no tóxica.

La invención proporciona procedimientos mejorados para la síntesis y la producción comercial de ficocianinas y otras composiciones bioquímicas naturales, incluidos, entre otros, hialuronanos, glucosaminas, otros sacáridos y/o polisacáridos, otras ficobiliproteínas tales como, entre otros, aloficocianina, ficoeritrina, bilina, ficobilina, proteoglicanos, glicosaminoglicanos y similares.

En una forma de realización, el procedimiento incluye proporcionar una cianobacteria capaz de sintetizar ficocianinas, proporcionar un medio de crecimiento y cultivo adecuado, iluminar el microorganismo en cultivo con luz roja y/o infrarroja cercana, donde la luz consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de entre 670 y 690 nm. En una forma de realización alternativa, el procedimiento también prevé iluminar las cianobacterias en cultivo con luz blanca.

En otra forma de realización, el procedimiento incluye proporcionar una cianobacteria capaz de realizar la fotosíntesis de composiciones a base de carbono usando energía de una fuente de energía natural o artificial. El organismo es una bacteria fotosintética.

En una forma de realización, la luz del infrarrojo cercano comprende radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de aproximadamente 680 nm. En una forma de realización alternativa, la luz monocromática del infrarrojo cercano comprende radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de aproximadamente 678 nm. En otra forma de realización alternativa, la luz monocromática del infrarrojo cercano comprende radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de aproximadamente 682 nm. En una forma de realización, la luz blanca comprende radiación electromagnética que tiene longitudes de onda entre aproximadamente 350 nm y aproximadamente 760 nm.

En otra forma de realización, la luz roja consiste en radiación electromagnética que tiene una emisión de longitud de onda máxima de 680 nm. En una forma de realización alternativa, la luz roja consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de 678 nm. En otra forma de realización alternativa, la luz roja consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de 682 nm. En una forma de realización, la luz blanca consiste en radiación electromagnética que tiene longitudes de onda entre 350 nm y 760 nm.

En otra forma de realización preferida, la ficocianina sintetizada se filtra de las cianobacterias.

En otra forma de realización, la cianobacteria capaz de sintetizar ficocianinas se cultiva en un sistema de estanque o en un sistema de canal abierto. En una divulgación preferida, se colocan varillas de LED de >640 nm en el sistema de estanque o en el sistema de canal abierto lo que da como resultado una síntesis aumentada de ficocianinas en el microorganismo.

Breve descripción de los dibujos

FIGURA 1. Esquema del proceso de conversión de energía en la fotosíntesis. P680 y P700 representan el centro de reacción Chl a del Fotosistema II y el Fotosistema I respectivamente. La ficocianina (PC) (610-620 nm) está presente en un complejo con ficoeritrina (PE) (540-570 nm) y aloficocianina (APC) para el aparato de recolección de luz de ficobilisoma que absorbe longitudes de onda de luz específicas para su uso en la fotosíntesis.

FIGURA 2. El sistema de fotobiorreactor de tanque agitado de Infors con una cubierta de LED intercambiable.

FIGURA 3. Espectros de emisión típicos que comparan el LED blanco típico, el LED rojo típico (normalmente alrededor de 620-640 nm) y la luz LED de 680 nm. La derecha muestra los espectros de emisión de un LED de 680 nm que emite una luz estrecha e intensa con una longitud de onda de emisión óptima de 680 nm.

FIGURA 4. Curvas de crecimiento para lotes separados de cultivo de A. platensis (las barras de error representan el error estándar de la media) con una tabla que muestra la tasa de crecimiento promedio de A. platensis bajo LED de 680 nm en comparación con los LED blancos típicos, sin diferencias significativas en el crecimiento bajo las dos condiciones de luz.

FIGURA 5. Espectros de absorbancia de extractos de ficocianina de A. platensis, normalizados a 678 nm, cultivada bajo LED de 680 nm en comparación con los LED blancos típicos. Las líneas discontinuas claras representan el error (s.e.m., error estándar de la media). Se puede ver un pico de absorción más grande que representa la ficocianina a alrededor de 620 nm en el extracto de A.platensis cultivada bajo LED de 680 nm.

FIGURA 6. Rendimiento medio de ficocianina (mg/g) de A. platensis cultivada bajo LED de 680 nm en comparación con los LED blancos típicos. Las barras de error representan el error estándar de la media. Se puede observar un gran aumento significativo en los niveles de ficocianina en A. platensis mediante cultivo bajo LED de 680 nm.

FIGURA 7. Espectros de masas para cultivos de A. platensis cultivada con LED de 680 nm en comparación con los LED blancos típicos muestran diferencias en la abundancia de proteínas en las dos condiciones de luz.

FIGURA 8. A la izquierda se muestra el cultivo de A. platensis (arriba) y el extracto del cultivo (abajo) bajo LED blanco típico. A la derecha se muestra cultivo de A. platensis (arriba) y extracto del cultivo (abajo) bajo l Ed de 680 nm.

FIGURA 9. Rendimiento promedio de ficocianina (mg/g) para lotes separados de A. platensis, inoculada a partir del lote anterior, cultivada bajo LED de 680 nm muestra un rendimiento creciente de ficocianina con cada ejecución posterior, lo que probablemente indica que A. platensis está experimentando una adaptación continua para permitir la utilización de la luz de 680 nm de manera más eficiente en la fotosíntesis.

FIGURA 10. Curvas de crecimiento para cultivos de lotes de A. platensis bajo luz de 680 nm. La línea discontinua muestra cultivo de A. platensis sometido a aclimatación para la utilización de luz de 680 nm. Una fase de retraso donde se está produciendo la aclimatación, está presente hasta el día 14.

FIGURA 11. Arriba a la izquierda: Floculación de mayor rendimiento de ficocianina de A. platensis cultivada bajo LED de 680 nm. Las imágenes del microscopio muestran la presencia de cristales en tricomas de A. platensis en cultivos floculados (abajo), ausentes en cultivos no floculados, lo que indica un aumento de polisacáridos extracelulares, posiblemente como respuesta al estrés

Divulgaciones generales

Como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" o "la" incluyen una referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia a "una partícula" incluye una pluralidad de dichas partículas, y una referencia a "una superficie" es una referencia a una o más superficies y equivalentes de las mismas, y así sucesivamente.

El símbolo ">" cuando se usa en el contexto de la longitud de onda de la radiación electromagnética, significa "mayor que o igual a"; el término ">640 nm" significa una radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de al menos o superior a 640 nm, por ejemplo, 640 o 641 nm.

El término "aproximadamente", cuando se usa en el contexto de la longitud de onda de la radiación electromagnética, significa una longitud de onda dentro de los 2 nm de la longitud de onda escrita; por lo tanto, el término "una longitud de onda de aproximadamente 640 nm" significa que la longitud de onda electromagnética está entre 638 nm y 642 nm.

Descripción detallada de la invención

La invención aquí divulgada proporciona dispositivos y procedimientos que pueden usarse para la síntesis de ficocianinas. El procedimiento da como resultado un aumento de más de 4.5 veces en los niveles de ficocianina, una clara mejora con respecto a la técnica anterior. Los dispositivos divulgados en este documento se pueden usar en muchas aplicaciones que incluyen, entre otras, el uso como colorante alimentario natural, como antioxidante en las industrias de complementos alimenticios, en las industrias nutracéutica, farmacéutica y cosmecéutica, y como tinta no tóxica. La invención proporciona procedimientos mejorados para la síntesis y producción comercial de ficocianinas.

En una forma de realización ejemplar, el procedimiento incluye proporcionar una cianobacteria capaz de sintetizar ficocianinas, proporcionar un medio de cultivo y crecimiento adecuado, iluminar el microorganismo en cultivo con luz roja y/o luz infrarroja cercana, donde la luz consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de entre 670 y 690 nm. En una forma de realización alternativa, el procedimiento también proporciona iluminar el microorganismo en cultivo con luz blanca.

En una forma de realización, la luz roja consiste en radiación electromagnética que tiene una emisión de longitud de onda máxima de 680 nm. En una forma de realización alternativa, la luz roja consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de 678 nm. En otra forma de realización alternativa, la luz roja consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de 682 nm. En otra forma de realización alternativa, la luz roja consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de 690 nm. En otra forma de realización alternativa, la luz roja consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de 670 nm. En una forma de realización alternativa, la luz roja consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda media de 680 nm, donde la longitud de onda está dentro de un intervalo de confianza del 95 % de 640-720 nm.

Se demostró que el cultivo con luz LED roja de 680 nm en comparación con la blanca aumenta la producción de PC en A.platensis en un promedio de 5 veces y estos efectos se pudieron ver visualmente en los cultivos. El análisis de espectro de masas ha mostrado algunas diferencias y cambios importantes en el nivel de proteína a través del cultivo bajo las dos fuentes de luz diferentes. No se observaron diferencias significativas en la tasa de crecimiento bajo las dos fuentes de luz.

La invención se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con fines ilustrativos de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención y no como limitaciones.

Ejemplos

Ejemplo I: Cultivos por lotes

Un medio estéril F/2 (receta CCAP [Culture Collection of Algae and Protozoa]) suplementado con 2.5 g/l de NaNO3 (pH 8) se inoculó en condiciones asépticas al 20 % (v/v) con Arthrospira platensis (CCMP [Culture Collection of Marine Phytoplankton] 1295/ Bigelow Laboratory US) (OD 0.11-0.12) en fase de crecimiento logarítmico. Se hizo funcionar un fotobiorreactor de tanque agitado (STPBR) (biorreactor modificado de mesa Infors Labfors 4) con LED blancos (Lumitronix Barre LED High-Power Sm D 600 mm, 12 V) o LED rojos de 680 nm (Figuras 2 y 3) con 2.75 l de cultivo a 30 °C y 45 jmoMm-2 intensidad de luz con ciclo de 18:6 luz:oscuridad y velocidad del impulsor 200 rpm con aire comprimido natural (~0.03 % CO2) suministrado a 0.08 LPM (VVM (volumen de aire por volumen de cultivo por minuto) ~0.03 litros de aire por litros de medio por minuto, LPM) a través de un rociador de anillo con malla. El pH y el oxígeno disuelto se registraron en línea en períodos de 10 minutos (sondas Mettler Toledo). Se tomaron asépticamente muestras de 8 ml los días 1 (inoculación), 3, 6, 7, 10, 13 y 14 para su análisis.

Ejemplo II: Medición del crecimiento

La densidad óptica (OD) se utilizó junto con la autofluorescencia de clorofila (CF) y los recuentos celulares directos como indicador del crecimiento. La OD se midió por triplicado a 750 nm Griffiths et al. (2011) [14] utilizando un espectrofotómetro Cary 100 UV/Vis (Varian) corregido con medio F/2. CF se analizó en tres muestras por triplicado de 300 j l divididas en pocillos individuales de una placa negra de 96 pocillos. Las muestras se excitaron a 430 nm y la emisión se midió a 690 nm utilizando un lector de placas de fluorescencia FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH). Se tomaron lecturas frente a muestras en blanco de medio F/2 y los valores promedio en unidades de fluorescencia arbitrarias se usaron para el análisis estadístico. Los recuentos de células se realizaron usando una celda de conteo Sedgewick rafter y usando un microscopio óptico Leitz Dialux 20. Se tomaron 10 recuentos de muestras aleatorias por triplicado para 1 j l de cultivo.

Ejemplo III: Evaluación morfológica

Se midió el largo y ancho total de las espirales de 20 cianobacterias para evaluar cualquier cambio en las características morfológicas de los tricomas. Las imágenes se tomaron usando el microscopio óptico Leitz Dialux 20 y el software EasyGrab con análisis realizado usando Image J. El tamaño de la imagen se calibró usando cuadrículas a 630 píxeles mm'1.

Ejemplo IV: Análisis de ficocianina

La extracción de PC se basó en el procedimiento de Zhang y Chen (1999) [15]. Se recogieron muestras de 5 ml mediante centrifugación a 3000 g/10 minutos (centrífuga Sigma 3K18C) en tubos de vidrio previamente pesados. Las células se lavaron una vez en agua desionizada y se pesó la biomasa húmeda. A continuación, se resuspendió la pella en 3 ml de regulador de fosfato de sodio de 0.05 M (pH 7). Las células se rompieron mediante un ciclo de congelación/descongelación (-20 °C) durante 1 hora y se sometieron a ultrasonido durante 3 minutos a una amplitud de 6 micras (Soniprep 150, MSE). A continuación, las muestras se centrifugaron a 10,000 g, 30 minutos (microcentrífuga Sigma 1-15) y se analizó la absorbancia del sobrenadante a 200-800 nm por medio de un espectrofotómetro (espectrofotómetro Cary 100 UV-Vis, Varian) utilizando una cubeta de cuarzo. Se utilizó regulador de fosfato de sodio (0.05 M) como blanco y se calculó la concentración y la pureza de PC usando el procedimiento de Bennet y Bogorad (1973) [10] (Ecuación 1) y Boussiba y Richmond (1979) [16] (Ecuación 2) respectivamente. El rendimiento de extracción se calculó como se indica a continuación en Ecuación 3. La concentración de PC se analizó el día 14 (o cuando el crecimiento alcanzó una OD de 0.33) en tres réplicas.

1. PC (mg/mL) = (A620-0.474 (A655))/5.34.

2. Pureza de PC = A620/A280.

3. Rendimiento de extracción (mg de PC/g de biomasa) = (concentración de PC * volumen de disolvente (mL)/biomasa húmeda (g)

Ejemplo V: Análisis de espectrometría de masas (MS)

Preparación de la matriz: Se mezclaron 20 mg de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA) (Brucker Daltonics) con 1 ml de acentonitrilo al 50 %: Solución de TFA al 2.5 % y saturación mediante incubación de 30 minutos a 25 °C en un baño de agua ultrasónico (Grant Instruments, Cambridge), agitado en remolinos durante 15 minutos. La matriz se centrifugó (14,000 g, 1 minuto) (microcentrífuga Sigma 1-15K) y se prepararon alícuotas frescas de 50 pl para su uso.

Preparación de la muestra: Se centrifugaron muestras de 1 ml (14,000 g, 5 minutos) (microcentrífuga Sigma 1-15K) y la pella se lavó dos veces en agua desionizada fresca (fdw) y se almacenó congelada a -80 °C. Las pellas se descongelaron en hielo y se resuspendieron en 50 pl de fdw antes de colocarlas. Las muestras se mezclaron 1:1 con matriz HCCA y 4 pl de muestras duplicadas y se colocaron en una placa objetivo de acero (MTP 384 acero templado de placa objetivo, Brucker) junto con 1 pl de estándar bacteriano (Brucker) en capas con 1 pl de matriz HCCA como calibrante. A continuación, las muestras se sometieron a análisis MS (Bruker ultraflex II maldi-tof/tof). Los espectros se analizaron usando el paquete de software flexAnalysis (Bruker).

Ejemplo VI: Análisis de población

Las muestras se congelaron en glicerol estéril al 15 % y se congelaron a -80 °C para el análisis de la población (Dr. Andrew Free y Rocky Kindt, Universidad de Edimburgo).

Ejemplo VII: análisis estadístico

El análisis de datos se realizó usando Microsoft Excel 2007 y Graphpad Prism 5.

Ejemplo VIII: Resultados: Crecimiento

No se observaron diferencias significativas en el crecimiento de los cultivos bajo la luz roja de 680 nm en comparación con la luz LED blanca (Figura 4). Téngase en cuenta el gran período de retraso de la aclimatación en el lote Rojo 2 (Figura 4). El cultivo requirió un período de aclimatación para poder utilizar la luz roja de 680 nm en la fotosíntesis (a partir de la observación), y esta aclimatación fue reversible.

Ejemplo IX: Resultados: análisis de PC

La ficocianina se absorbe a 620 nm. La presencia de PC en los extractos de los lotes de LED rojos de 680 nm en comparación con los LED blancos fue mucho mayor (Figuras 5 y 6). Se observó un desplazamiento azul interesante en el segundo pico de clorofila alrededor de 670-680 nm, donde la absorción máxima del extracto rojo a 680 nm es 677-678 nm y la absorción máxima del extracto blanco es 673-674 (Figura 6).

La concentración de PC aumentó 5 veces en promedio (al menos nueve muestras) mediante el cultivo bajo luz LED roja de 680 nm en comparación con luz LED blanca y hubo una pureza de PC ligeramente mayor bajo luz LED roja de 680 nm en comparación con la blanca (tabla de la Figura 7). Se observaron diferencias visuales de color en el cultivo, probablemente como resultado del aumento del contenido de PC de las células cultivadas bajo luz roja de 680 nm (Figura 7).

Ejemplo X: Resultados: análisis de MS

Los espectros MALDI de células enteras mostraron diferencias en las proteínas abundantes del cultivo con luz roja de 680 nm en comparación con la luz LED blanca (Figura 8).

Ejemplo XI: Resultados: Diferencias de lixiviación

Al descartar las muestras preparadas para el análisis de MS, una alta concentración de PC se había lixiviado a la solución en las muestras de rojo de 680 nm (Figura 9). A simple vista, la diferencia de color en la PC lixiviada fue sustancialmente mayor en el cultivo de rojo de 680 nm en comparación con la luz LED blanca, con un aspecto mucho mayor que un aumento de 5 veces. Esto indicó una posible diferencia en las características de lixiviación de PC en el cultivo de rojo de 680 nm, lo que puede ser beneficioso para el procesamiento posterior (DSP). El cultivo bajo una luz de 680 nm puede aumentar la lixiviación de PC de la biomasa.

Ejemplo XII: Resultados: Agregación cultural.

Cultivar bajo luz de 680nm también puede aumentar la agregación del cultivo, con beneficios para DSP. La agregación puede ser el resultado de una mayor producción de polisacáridos extracelulares (EPS) como respuesta al estrés. Este es claramente un resultado inesperadamente superior que no podría haber sido predicho por un experto en la técnica. Referencias

[1] Vonshak, A. 1997. Spirulina Platensis Arthrospira: Physiology, Cell-Biology And Biotechnology. CRC Press, London.

[2] Gonzalez, R. et al. 1999. Anti-inflammatory activity of phycocyanin extract in acetic acid-induced colitis in rats. Pharmacological Research 39(1): 55-59.

[3] Romay, C. et al. 1998. Antioxidant and anti-inflammatory properties of C-phycocyanin from blue-green algae. Inflammation Research 47: 36-41.

[4] Pinero Estrada, J.E., Bermejo Bescos, P., and Villar del Fresno, A.M. 2001. Antioxidant activity of different fractions of Spirulina platensis protean extract. Il Farmaco 56: 497-500.

[5] Belay, A. 2002. The Potential Application of Spirulina (Arthrospira) as a Nutritional and Therapeutic Supplement in Health Management. The Journal of the American Nutraceutical Association 5(2): 27-48.

[6] Kirk, J.O.T. 2000. Light & Photosynthesis in Aquatic Systems. Second ed. Cambridge University Press, Cambridge.

[7] Wang, R.T., Stevens, C.L.R., and Myers, J. 1977. Action spectra for photoreactions i and ii of photosynthesis in the blue-green alga anacystis nidulans. Photochemistry and Photobiology 25(1): 103-108.

[8] Johnson, J.D. 2006. The Manganese-calcium oxide cluster of Photosystem II and its assimilation by the Cyanobacteria. 2006 (Last accessed 20th July 2012). Available at: http://www.chm.bris.ac.uk/motm/oec/motmc.htm.

[9] Habib, M.A.B., Parvin, M., Huntington, T.C., and Hasan, M.R. 2008. A review on culture, production and use of spirulina as food for humans and feeds for domestic animals and fish. FAO Fisheries and Aquaculture: Rome.

[10] Bennett, A., Bogorad, L. 1973. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology 58(2): 419-435.

[11] Bogorad, L. 1975. Phycobiliproteins and complementary chromatic adaptation. Annual Review of Plant Physiology 26: 369-401.

[12] Walter, A. et al. 2011. Study of phycocyanin production from Spirulina platensis under different light spectra. Brazilian Archives of Biology and Technology 54: 675-682.

[13] Wang, C.-Y., Fu, C.-C., and Liu, Y.-C. 2007. Effects of using light-emitting diodes on the cultivation of Spirulina platensis. Biochemical Engineering Journal 37(1): 21-25.

[14] Griffiths, M.J., Garcin, C., van Hille, R.P., and Harrison, S.T.L. 2011. Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density. Journal of Microbiological Methods 85(2): 119-123.

[15] Zhang, Y.-M. and Chen, F. 1999. A simple method for efficient separation and purification of c-phycocyanin and allophycocyanin from Spirulina platensis. Biotechnology Techniques 13(9): 601-603.

[16] Boussiba, S. and Richmond, A.E. 1979. Isolation and characterization of phycocyanins from the blue-green alga Spirulina platensis. Archives of Microbiology 120(2): 155-159.

[17] Sudhir et al. 2005. The Effects of Salt Stress on Photosynthetic Electron Transport and Thylakoid Membrane Proteins in the Cyanobacteium Spirulina platensis. Journal of Biochemistry and Molecular Biology 38: 481-485.

[18] Verma, K., Mohanty, P. 2000. Changes of the photosynthetic apparatus in Spirulina cyanobacterium by sodium stress. Z Naturforsch C 55: 16-22.

[19] Farges, B., Laroche, C., Cornet, J.F., and Dussap, C.G. 2009. Spectral kinetic modeling and long-term behavior assessment of Arthrospira platensis growth in photobioreactor under red (620 nm) light illumination. Biotechnol Prog 25(1): 151-62.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para sintetizar ficocianina a partir de cianobacterias, comprendiendo el procedimiento los pasos de:

(i) cultivar una cianobacteria en un medio de crecimiento adecuado; y

(ii) proporcionar una fuente de luz adecuada, donde la luz consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de entre 670 y 690 nm.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la cianobacteria es Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, Spirulina platensis o Spirulina maxima.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la radiación electromagnética comprende una longitud de onda de emisión máxima de 680 nm.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la radiación electromagnética consiste en una longitud de onda de 682 nm.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la radiación electromagnética consiste en una longitud de onda de 678 nm.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha luz es una luz LED de 680 nm.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los niveles de ficocianina sintetizados mediante los pasos (i) y (ii) son al menos 4.5 veces mayores que los niveles de ficocianina sintetizada a partir de la misma cianobacteria que se ha cultivado por separado en un medio de crecimiento adecuado en presencia de una fuente de luz blanca, en donde la luz blanca consiste en radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de entre 350 nm y 760 nm.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la ficocianina sintetizada por las cianobacterias se filtra de las cianobacterias.

9. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en donde el procedimiento también es adecuado para la síntesis de un bioquímico, en donde el bioquímico se selecciona del grupo que consiste en hialuronanos, glucosaminas, sacáridos, polisacáridos, ficobiliproteínas, aloficocianina, ficoeritrina, bilina, ficobilina, proteoglicanos, y glicosaminoglicanos.