JP2017503516A - フィコシアニン合成の改善 - Google Patents
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Abstract
生物色素の細胞及び培地濃度が上昇する微生物細胞培養条件を開示する。天然の食品着色料、栄養補助食品業界、機能性食品業界、医薬品業界及び薬用化粧品業界における酸化防止剤並びに非毒性インクとしての用途を有する。微生物培養物から比較的分離し易い色素が得られる。【選択図】なし
Description
本願は、あらゆる目的のために参照により全て本願に援用される、以下の２０１４年１月２７日に出願の米国仮特許出願番号第６１／９３１７２３号“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ”（特許文献１）及び２０１４年６月１７日に出願の米国仮特許出願番号第６２／１３４４７９号“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎｓ”（特許文献２）の優先権及び利益を主張するものである。
本発明は、色素のレベル及び濃度が上昇する微生物細胞培養条件を用いることに関する。
本発明は、色素のレベル及び濃度が上昇する微生物細胞培養条件を用いることに関する。
フィコシアニン（ＰＣ）は、原核生物であるシアノバクテリア及び特定の真核生物、例えば紅藻、クリプトモナド及び灰色藻（ｇｌａｕｃｏｃｙｓｔｏｐｈｙｔｅ）で産生される発色団である青色のビリタンパク質である。健康問題と関連づけられている合成着色料のブリリアントブルーＦＣＦに置き換わる天然の食品着色料としてのＰＣの利用は増加しつつある。水におけるその高い溶解度及び広いｐＨ範囲にわたる安定性から、ＰＣは特に食品着色料としての使用に適している［非特許文献１］。加えて、ＰＣは、その酸化防止及び抗炎症特性から、他の関連する健康上の効用も相まって、機能性食品、医薬品及び薬用化粧品業界において高純度で使用されている［非特許文献２〜４］。より精製度が低いＰＣも、観賞用の魚及び鳥の色を良くするために動物飼料用の添加物として使用されている。最高品質及び純度のＰＣは、その蛍光特性から、検査キットで使用されている。また、医療で使用するために、ＰＣの治療効果について、始まったばかりながら研究が続けられている［非特許文献５］。ＰＣ市場はその揺籃期にある。
シアノバクテリアにおいて、ＰＣはチラコイド膜内に存在し、フィコエリトリン（ＰＥ）及びアロフィコシアニン（ＡＰ又はＡＰＣ）を含めた他のビリタンパク質と複合体を形成し、これらが一緒になってフィコビリソームとして知られる集光性器官として機能する［非特許文献６］。フィコビリソームはクロロフィルが利用できない特定の波長の光を吸収することで光合成の効率を上昇させる［非特許文献７］。ＰＣは最大で６１０〜６２０ｎｍで吸収し、ＰＥは５４０〜５７０ｎｍ、ＡＰＣは６５０〜６５５ｎｍで吸収する［非特許文献６］。
シアノバクテリアはＰＣ生産用に水産養殖で広く用いられており、将来的には真核生物も活用される可能性がある。シアノバクテリアの中では、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属（以前はＳｐｉｒｕｌｉｎａ属として知られ、商業的には依然として「スピルリナ」として知られる）が最も一般的に培養されている属であるが、ＰＣは他の属、例えばＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ及びＡｎａｂａｅｎａからも抽出されている。主な培養種はＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ及びＡ．ｍａｘｉｍａである。これらの種は共に、螺旋形の糸状体又はトリコームを有する糸状のシアノバクテリアである。
その高いＰＣ含有量に加えて、スピルリナは多量の他の栄養補助成分、例えばビタミン及びＰＵＦＡも含有し、また単細胞タンパク質が豊富である。そのため、欧米におけるＰＣへの商業的な関心は高まりつつある［非特許文献１］。しかしながら、東洋及びアフリカにおいて、スピルリナは何世紀にもわたって食品として用いられている［非特許文献９］。スピルリナ生物有機体はそれだけでも売れる製品であるが、純粋なフィコシアニンは、純度によっては市場価値が極めて高くなる。
水分子は遠赤領域の光を吸収するため、自然の藻類環境においては、光合成に関してこの波長で制限が生じる［非特許文献６］。浮遊物質により短い波長の光も散乱するため、自然界では青−緑の波長の光ばかりが藻類に供給される。したがって、利用可能な光は環境因子によって決定され、藻類は適応により、利用可能な光の質及び量を活用できるようになる。
ＰＥ及びＰＣを含有する一部のシアノバクテリアは補色適応と呼ばれる現象を示し、ＰＣ：ＰＥ比は、異なる光状況に応答して、合成の調節により変化する［非特許文献１０、１１］。最近の研究から、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓを特定の波長の光の存在下で操作することでＰＣの生産量を増やせることが判明している。
光フィルタの使用により、Ｗａｌｔｅｒら（２０１２）［非特許文献１２］は、赤色光（６００〜７００ｎｍ）下ではＰＣの純度が上昇することを実証した。Ｗａｎｇらの以前の研究でも、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ生物有機体の生産性が赤色光下での培養で高くなると判明している［非特許文献１３］。Ｗａｎｇらによる計算は、エネルギーの生物有機体への変換がより効率的であることから、赤色光の使用が光独立栄養的な生産にとって経済的に有益になり得ることを実証した。Ｆａｒｇｅｓ（２００９）［非特許文献１９］も、多色及び単色光源下でのＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの成長をモデル化し、電気的エネルギー消費量の低下及び変わらぬ同等の成長速度の結果としての、赤色６２０ｎｍＬＥＤ下での培養効率における数学的上昇を実証している。しかしながら、単色の赤色ＬＥＤ光（６２０ｎｍ）ではＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＰＣ濃度が、白色／多色及び赤色＋青色多色ＬＥＤと比較して２倍低下することが判明している。これらの研究は、異なる波長の光の下での培養がＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ培養物におけるＰＣ濃度及び純度に影響し得ることを実証している。しかしながら、通常の赤色ＬＥＤのものを超えた波長を使用した試験は行われていない。
したがって、フィコシアニンを合成するための改善された、より低コストの方法が当該分野で必要とされている。
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Ｈａｂｉｂ，Ｍ．Ａ．Ｂ．，Ｐａｒｖｉｎ，Ｍ．，Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ，Ｔ．Ｃ．，ａｎｄ Ｈａｓａｎ，Ｍ Ｒ．２００８．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ａｓ ｆｏｏｄ ｆｏｒ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｆｅｅｄｓ ｆｏｒ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌｓ ａｎｄ ｆｉｓｈ．ＦＡＯ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ ａｎｄ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ：Ｒｏｍｅ
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Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｇａｒｃｉｎ，Ｃ，ｖａｎ Ｈｉｌｌｅ，Ｒ．Ｐ．，ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．Ｌ．２０１１．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｐｉｇｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ ｂｉｏｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８５（２）：１１９−１２３
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Ｖｅｒｍａ，Ｋ．，Ｍｏｈａｎｔｙ，Ｐ．２０００．Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｉｎ Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｙ ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｒｅｓｓ．Ｚ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ Ｃ ５５：１６−２２
Ｆａｒｇｅｓ，Ｂ．，Ｌａｒｏｃｈｅ，Ｃ，Ｃｏｒｎｅｔ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ Ｄｕｓｓａｐ，Ｃ．Ｇ．２００９．Ｓｐｅｃｔｒａｌ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｕｎｄｅｒ ｒｅｄ（６２０ｎｍ）ｌｉｇｈｔ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２５（１）：１５１−６２
本明細書で開示の発明は、フィコシアニンの改善された合成に使用し得る装置及び方法を提供する。本方法ではフィコシアニンレベルの１０倍を超える上昇という、従来技術からの明白な改善がみられる。本方法では、フィコシアニンの収穫についても改善がみられる。
本明細書で開示の装置は数多くの用途で使用し得て、用途には、以下に限定するものではないが、天然の食品着色料、栄養補助食品業界、機能性食品業界、医薬品業界及び薬用化粧品業界における酸化防止剤並びに非毒性インクとしての使用が含まれる。
本発明は、フィコシアニン並びに、以下に限定するものではないが、ヒアルロナン、グルコサミン、他のサッカライド及び／又は多糖、他のフィコビリタンパク質、例えば、以下に限定するものではないが、アロフィコシアニン、フィコエリトリン、ビリン、フィコビリン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどを含めた他の天然の生化学的組成物を合成及び商業的に生産するための改善された方法を提供する。
一実施形態において、本方法は、フィコシアニンを合成可能な微生物を用意し、適切な培養／成長培地を用意し、培養中の微生物に赤色及び／又は近赤外光を照射し、あるいは、培養中の微生物に赤色及び／又は近赤外単色光を照射することを含む。代替の実施形態において、本方法は、培養中の微生物に白色光を照射することも提供する。
別の実施形態において、本方法は、天然又は人工のエネルギー源由来のエネルギーを用いて炭素系組成物を光合成可能な生物を用意することを含む。この生物は光合成細菌、光合成古細菌（ａｒｃｈａｅａｎ）、光合成原生生物、光合成藻類、光合成蘚類又は光合成植物になり得る。この生物は天然の種になり得る。あるいは、この生物は組み換えＤＮＡ技術を用いて作り出された合成生物になり得る。この生物は栽培植物化した植物種になり得て、また別の生物由来のＤＮＡも含み得る。
一実施形態において、近赤外光は、約６３０〜約７２０ｎｍの波長を有する電磁放射線を含む。別の実施形態において、近赤外単色光は、約６８０ｎｍの波長を有する電磁放射線を含む。代替の実施形態において、近赤外単色光は、約６７８ｎｍの波長を有する電磁放射線を含む。別の代替の実施形態において、近赤外単色光は、約６８２ｎｍの波長を有する電磁放射線を含む。一実施形態において、白色光は、約３５０〜約７６０ｎｍの波長を有する電磁放射線を含む。別の代替の実施形態において、近赤外単色光は、約６５０ｎｍの波長を有する電磁放射線を含む。さらに別の代替の実施形態において、近赤外単色光は、約７２０ｎｍの波長を有する電磁放射線を含む。さらに別の代替の実施形態において、単色光は、約４５０〜５９０ｎｍの波長を有する電磁放射線を含む。
別の実施形態において、赤色光は、６４０〜７２０ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。別の実施形態において、赤色光は、６４０〜１０００ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。別の実施形態において、赤色光は、６８０ｎｍの最大波長発光を有する電磁放射線から成る。代替の実施形態において、赤色光は、６７８ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。別の代替の実施形態において、赤色光は、６８２ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。一実施形態において、白色光は、３５０〜７６０ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。
別の好ましい実施形態において、合成されたフィコシアニンは、微生物から浸出する。
別の実施形態において、フィコシアニンを合成可能な微生物は、池系又は開放水路系において培養される。好ましい実施形態においては、＞６４０ｎｍＬＥＤ管を池系又は開放水路系に設置し、これによって微生物におけるフィコシアニンの合成量が増加する。
別の実施形態において、本発明はフィコシアニンを生産するためのシステムを考えており、このシステムは容器とランプとを備え、ランプは少なくとも６４０ｎｍ以上の波長を有する電磁エネルギーを発生し、容器はフィコシアニンを合成可能な微生物をさらに含む。
一般開示事項
本文書で開示の実施形態は説明のための例にすぎず、本発明を限定するためのものではない。本発明の請求項の範囲から逸脱することなく他の実施形態も利用でき、また構造的な変更も加えることができる。
本文書で開示の実施形態は説明のための例にすぎず、本発明を限定するためのものではない。本発明の請求項の範囲から逸脱することなく他の実施形態も利用でき、また構造的な変更も加えることができる。
明細書本文及び添付の請求項で使用の単数形には、文脈に明らかに反する場合を除き、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ある粒子」と言う場合は複数のそのような粒子が含まれ、「ある表面」と言う場合は１つ以上の表面及びその均等物に言及している等である。
電磁放射線の波長との関連で使用する記号「≧」は「〜以上」を意味し、「≧６４０ｎｍ」という記載は、少なくとも６４０ｎｍ又はそれを超える波長、例えば６４０又は６４１ｎｍを有する電磁放射線を意味する。
電磁放射線の波長との関連で使用する語「約」は、記載の波長の２ｎｍ以内の波長を意味する。したがって、「約６４０ｎｍの波長」という記載は、電磁波波長が６３８〜６４２ｎｍであることを意味する。
本明細書で開示の発明は、フィコシアニンの合成に使用し得る装置及び方法を提供する。本方法ではフィコシアニンレベルの４．５倍を超える上昇という、従来技術からの明白な改善がみられる。本明細書で開示の装置は数多くの用途で使用し得て、用途には、以下に限定するものではないが、天然の食品着色料、栄養補助食品業界、機能性食品業界、医薬品業界及び薬用化粧品業界における酸化防止剤並びに非毒性インクとしての使用が含まれる。本発明は、フィコシアニンを合成及び商業的に生産するための改善された方法を提供する。
実施形態例において、本方法は、フィコシアニンを合成可能な微生物を用意し、適切な培養／成長培地を用意し、培養中の微生物に赤色及び／又は近赤外光を照射し、あるいは、培養中の微生物に赤色及び／又は近赤外単色光を照射することを含む。代替の実施形態において、本方法は、培養中の微生物に白色光を照射することも提供する。
一実施形態において、赤色光は、約６４０〜約７２０ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。別の実施形態において、赤色光は、６４０〜１０００ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。別の実施形態において、赤色光は、６８０ｎｍの最大波長発光を有する電磁放射線から成る。代替の実施形態において、赤色光は、６７８ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。別の代替の実施形態において、赤色光は、６８２ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。別の代替の実施形態において、赤色光は、６９０ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。別の代替の実施形態において、赤色光は、６７０ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。代替の実施形態において、赤色光は６８０ｎｍの平均波長を有する電磁放射線から成り、この波長は６４０〜７２０ｎｍの９５％信頼区間内にある。一実施形態において、白色光は、３５０〜７６０ｎｍの波長を有する電磁放射線から成る。
赤色６８０ｎｍＬＥＤ光下での培養は、白色光と比較して、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓにおけるＰＣ産生を平均で５倍増加させることが判明しており、その効果は培養物において視覚的に確認できた。質量スペクトル分析は、２種の異なる光源下での培養で生じた幾つかの大きな違い及びタンパク質レベルに関する変化を示している。２種の光源下での成長速度に有意な差はみられなかった。
本発明は、以下の実施例を参照することでより速やかに理解できる。実施例は本発明の特定の態様及び実施形態を説明する目的で含めたにすぎず、限定を目的としたものではない。
実施例Ｉ：バッチ培養物
２．５ｇ／１のＮａＮＯ3（ｐＨ８）を補充したＦ／２滅菌培地（ＣＣＡＰ［Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｚｏａ］レシピ）に、無菌条件下、２０％（ｖ／ｖ）で、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（ＣＣＭＰ［Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ］１２９５／Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国）（ＯＤ０．１１〜０．１２）を対数増殖期に接種した。白色（Ｌｕｍｉｔｒｏｎｉｘ Ｂａｒｒｅ ＬＥＤハイパワーＳＭＤ６００ｍｍ、１２Ｖ）又は６８０ｎｍ赤色ＬＥＤを備えた撹拌槽型フォトバイオリアクタ（ｓｔｉｒｒｅｄ ｔａｎｋ ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ：ＳＴＰＢＲ）（Ｉｎｆｏｒｓ Ｌａｂｆｏｒｓ ４ベンチトップモディファイドバイオリアクタ）（図２、３）に２．７５ｌの培養物を装填し、３０℃、４５μｍｏｌ-1ｍ-2光強度、１８：６明暗サイクル、インペラ速度２００ｒｐｍで、０．０８ＬＰＭ（ＶＶＭ（ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ａｉｒ ｐｅｒ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ：１分あたりの培養物１体積あたりの空気の体積）約０．０３リットル空気／リットル培地／分、ＬＰＭ（Ｌｉｔｒｅｓ ａｉｒ ｐｅｒ ｌｉｔｒｅｓ ｍｅｄｉｕｍ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ））で金網付きリングスパージャ（ｇａｕｚｅｄ ｒｉｎｇ ｓｐａｒｇｅｒ）を通して天然圧縮空気（約０．０３％ＣＯ2）を供給して作動させた。ｐＨ及び溶解した酸素をオンラインで１０分間隔で記録した（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏプローブ）。８ｍｌの試料を無菌で１（接種）、３、６、７、１０、１３及び１４日目に分析のために採取した。
２．５ｇ／１のＮａＮＯ3（ｐＨ８）を補充したＦ／２滅菌培地（ＣＣＡＰ［Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｚｏａ］レシピ）に、無菌条件下、２０％（ｖ／ｖ）で、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（ＣＣＭＰ［Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ］１２９５／Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国）（ＯＤ０．１１〜０．１２）を対数増殖期に接種した。白色（Ｌｕｍｉｔｒｏｎｉｘ Ｂａｒｒｅ ＬＥＤハイパワーＳＭＤ６００ｍｍ、１２Ｖ）又は６８０ｎｍ赤色ＬＥＤを備えた撹拌槽型フォトバイオリアクタ（ｓｔｉｒｒｅｄ ｔａｎｋ ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ：ＳＴＰＢＲ）（Ｉｎｆｏｒｓ Ｌａｂｆｏｒｓ ４ベンチトップモディファイドバイオリアクタ）（図２、３）に２．７５ｌの培養物を装填し、３０℃、４５μｍｏｌ-1ｍ-2光強度、１８：６明暗サイクル、インペラ速度２００ｒｐｍで、０．０８ＬＰＭ（ＶＶＭ（ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ａｉｒ ｐｅｒ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ：１分あたりの培養物１体積あたりの空気の体積）約０．０３リットル空気／リットル培地／分、ＬＰＭ（Ｌｉｔｒｅｓ ａｉｒ ｐｅｒ ｌｉｔｒｅｓ ｍｅｄｉｕｍ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ））で金網付きリングスパージャ（ｇａｕｚｅｄ ｒｉｎｇ ｓｐａｒｇｅｒ）を通して天然圧縮空気（約０．０３％ＣＯ2）を供給して作動させた。ｐＨ及び溶解した酸素をオンラインで１０分間隔で記録した（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏプローブ）。８ｍｌの試料を無菌で１（接種）、３、６、７、１０、１３及び１４日目に分析のために採取した。
実施例ＩＩ：成長測定
成長の尺度として、光学濃度（ＯＤ）を、クロロフィルの自家蛍光（ＣＦ）及び直接細胞計数と共に用いた。ＯＤを７５０ｎｍ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（２０１１）［非特許文献１４］で、Ｃａｒｙ １００紫外線／可視光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）（Ｆ／２培地で補正）を用いて３重で測定した。ＣＦを、黒色の９６ウェルプレートの各ウェルに分割した３つの３重３００μｌ試料において分析した。試料を４３０ｎｍで励起させ、発光を６９０ｎｍでＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ蛍光プレートリーダ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して測定した。示度をＦ／２培地のブランク試料に対して読み取り、任意の蛍光単位の平均値を統計分析に使用した。細胞計数を、Ｓｅｄｇｅｗｉｃｋ ｒａｆｔｅｒカウンティングセル及びＬｅｉｔｚ Ｄｉａｌｕｘ ２０光学顕微鏡を使用して行った。３重の１０のランダムな試料の計数を１μｌの培養物について行った。
成長の尺度として、光学濃度（ＯＤ）を、クロロフィルの自家蛍光（ＣＦ）及び直接細胞計数と共に用いた。ＯＤを７５０ｎｍ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（２０１１）［非特許文献１４］で、Ｃａｒｙ １００紫外線／可視光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）（Ｆ／２培地で補正）を用いて３重で測定した。ＣＦを、黒色の９６ウェルプレートの各ウェルに分割した３つの３重３００μｌ試料において分析した。試料を４３０ｎｍで励起させ、発光を６９０ｎｍでＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ蛍光プレートリーダ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して測定した。示度をＦ／２培地のブランク試料に対して読み取り、任意の蛍光単位の平均値を統計分析に使用した。細胞計数を、Ｓｅｄｇｅｗｉｃｋ ｒａｆｔｅｒカウンティングセル及びＬｅｉｔｚ Ｄｉａｌｕｘ ２０光学顕微鏡を使用して行った。３重の１０のランダムな試料の計数を１μｌの培養物について行った。
実施例ＩＩＩ：形態学的アセスメント
２０のシアノバクテリアの螺旋の全長及び幅を測定することで、トリコームの形態学的な特徴における変化を評価した。画像をＬｅｉｔｚ Ｄｉａｌｕｘ ２０光学顕微鏡及びＥａｓｙＧｒａｂソフトウェアを用いて撮影し、分析をＩｍａｇｅ Ｊを使用して行った。画像のサイズは、計数線を用いて６３０ピクセルｍｍ-1でキャリブレートした。
２０のシアノバクテリアの螺旋の全長及び幅を測定することで、トリコームの形態学的な特徴における変化を評価した。画像をＬｅｉｔｚ Ｄｉａｌｕｘ ２０光学顕微鏡及びＥａｓｙＧｒａｂソフトウェアを用いて撮影し、分析をＩｍａｇｅ Ｊを使用して行った。画像のサイズは、計数線を用いて６３０ピクセルｍｍ-1でキャリブレートした。
実施例ＩＶ：フィコシアニン分析
ＰＣの抽出はＺｈａｎｇ及びＣｈｅｎ（１９９９）［非特許文献１５］の方法に基づいた。５ｍＬの試料を、事前に計量したガラス管に、３０００ｇ／１０分（Ｓｉｇｍａ ３Ｋ１８Ｃ遠心分離機）での遠心分離により収穫した。細胞を脱イオン水で一度洗浄し、湿潤した生物有機体の計量を行った。次に、ペレットを３ｍＬの０．０５Ｍリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７）に再懸濁させた。細胞を１時間かけて凍結／融解サイクル（−２０℃）により破壊し、３分間にわたって６ミクロンの振幅（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ １５０、ＭＳＥ）で超音波処理した。次に、試料を１００００ｇでの３０分間にわたる遠心分離に供し（Ｓｉｇｍａ １−１５マイクロ遠心分離機）、上清の吸光度を、２００〜８００ｎｍで、分光光度計（Ｃａｒｙ １００紫外線−可視光分光光度計、Ｖａｒｉａｎ）により石英キュベットを使用してスキャンした。リン酸ナトリウムバッファ（０．０５Ｍ）をブランクとして使用し、ＰＣ濃度及び純度を、Ｂｅｎｎｅｔ及びＢｏｇｏｒａｄ（１９７３）［非特許文献１０］（等式１）並びにＢｏｕｓｓｉｂａ及びＲｉｃｈｍｏｎｄ（１９７９）［非特許文献１６］（等式２）の方法を用いてそれぞれ計算した。抽出率を、下の等式３にしたがって計算した。ＰＣ濃度は１４日目（又は成長がＯＤ０．３３に達した時）に３重で分析した。
ＰＣの抽出はＺｈａｎｇ及びＣｈｅｎ（１９９９）［非特許文献１５］の方法に基づいた。５ｍＬの試料を、事前に計量したガラス管に、３０００ｇ／１０分（Ｓｉｇｍａ ３Ｋ１８Ｃ遠心分離機）での遠心分離により収穫した。細胞を脱イオン水で一度洗浄し、湿潤した生物有機体の計量を行った。次に、ペレットを３ｍＬの０．０５Ｍリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７）に再懸濁させた。細胞を１時間かけて凍結／融解サイクル（−２０℃）により破壊し、３分間にわたって６ミクロンの振幅（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ １５０、ＭＳＥ）で超音波処理した。次に、試料を１００００ｇでの３０分間にわたる遠心分離に供し（Ｓｉｇｍａ １−１５マイクロ遠心分離機）、上清の吸光度を、２００〜８００ｎｍで、分光光度計（Ｃａｒｙ １００紫外線−可視光分光光度計、Ｖａｒｉａｎ）により石英キュベットを使用してスキャンした。リン酸ナトリウムバッファ（０．０５Ｍ）をブランクとして使用し、ＰＣ濃度及び純度を、Ｂｅｎｎｅｔ及びＢｏｇｏｒａｄ（１９７３）［非特許文献１０］（等式１）並びにＢｏｕｓｓｉｂａ及びＲｉｃｈｍｏｎｄ（１９７９）［非特許文献１６］（等式２）の方法を用いてそれぞれ計算した。抽出率を、下の等式３にしたがって計算した。ＰＣ濃度は１４日目（又は成長がＯＤ０．３３に達した時）に３重で分析した。
１．ＰＣ（ｍｇ／ｍＬ）＝（Ａ６２０−０．４７４（Ａ６５５））／５．３４
２．ＰＣ純度＝Ａ６２０／Ａ２８０
３．抽出率（ｍｇＰＣ／ｍｇ生物有機体）＝（ＰＣ濃度＊溶媒体積（ｍＬ）／生物有機体（ｍｇ）
２．ＰＣ純度＝Ａ６２０／Ａ２８０
３．抽出率（ｍｇＰＣ／ｍｇ生物有機体）＝（ＰＣ濃度＊溶媒体積（ｍＬ）／生物有機体（ｍｇ）
実施例Ｖ：質量分析（ＭＳ）
マトリックス調製：２０ｍｇのアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＨＣＣＡ）（Ｂｒｕｃｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を１ｍｌの５０％アセトニトリル：２．５％ＴＦＡ溶液と混合し、２５℃での超音波水浴（Ｇｒａｎｔ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ケンブリッジ）における３０分間のインキュベーションにより飽和させ、１５分間にわたってボルテックスした。マトリックスを遠心分離に供し（１４０００ｇ、１分間）（Ｓｉｇｍａ １−１５Ｋマイクロ遠心分離機）、５０μｌのアリコートを使用のために新しく準備した。
マトリックス調製：２０ｍｇのアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＨＣＣＡ）（Ｂｒｕｃｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を１ｍｌの５０％アセトニトリル：２．５％ＴＦＡ溶液と混合し、２５℃での超音波水浴（Ｇｒａｎｔ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ケンブリッジ）における３０分間のインキュベーションにより飽和させ、１５分間にわたってボルテックスした。マトリックスを遠心分離に供し（１４０００ｇ、１分間）（Ｓｉｇｍａ １−１５Ｋマイクロ遠心分離機）、５０μｌのアリコートを使用のために新しく準備した。
試料の準備
１ｍｌの試料を遠心分離に供し（１４０００ｇ、５分間）（Ｓｉｇｍａ １−１５Ｋマイクロ遠心分離機）、ペレットを２回、新しい脱イオン水（ｆｄｗ：ｆｒｅｓｈ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ）で洗浄し、−８０℃で冷凍保存した。ペレットを氷上で解凍し、スポッティングに先立って５０μｌのｆｄｗに再懸濁させた。試料を１：１でＨＣＣＡマトリックスと混合し、４μｌの２重試料をスチールのターゲットプレート（ＭＴＰ３８４ターゲットプレートグラウンドスチール、Ｂｒｕｃｋｅｒ）上に、キャリブラントとしての１μｌのＨＣＣＡマトリックスを重ねた１μｌの細菌スタンダード（Ｂｒｕｃｋｅｒ）と共にスポットした。次に、試料をＭＳ分析にかけた（ＢｒｕｋｅｒウルトラフレックスＩＩ ｍａｌｄｉ−ｔｏｆｔｏｆ）。スペクトルを、ｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアパッケージ（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して分析した。
１ｍｌの試料を遠心分離に供し（１４０００ｇ、５分間）（Ｓｉｇｍａ １−１５Ｋマイクロ遠心分離機）、ペレットを２回、新しい脱イオン水（ｆｄｗ：ｆｒｅｓｈ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ）で洗浄し、−８０℃で冷凍保存した。ペレットを氷上で解凍し、スポッティングに先立って５０μｌのｆｄｗに再懸濁させた。試料を１：１でＨＣＣＡマトリックスと混合し、４μｌの２重試料をスチールのターゲットプレート（ＭＴＰ３８４ターゲットプレートグラウンドスチール、Ｂｒｕｃｋｅｒ）上に、キャリブラントとしての１μｌのＨＣＣＡマトリックスを重ねた１μｌの細菌スタンダード（Ｂｒｕｃｋｅｒ）と共にスポットした。次に、試料をＭＳ分析にかけた（ＢｒｕｋｅｒウルトラフレックスＩＩ ｍａｌｄｉ−ｔｏｆｔｏｆ）。スペクトルを、ｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアパッケージ（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して分析した。
実施例ＶＩ：個体数分析
試料を１５％滅菌グリセロール中で凍結させ、個体数分析のために−８０℃で凍結させた（Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｆｒｅｅ及びＲｏｃｋｙ Ｋｉｎｄｔ、エジンバラ大学）。
試料を１５％滅菌グリセロール中で凍結させ、個体数分析のために−８０℃で凍結させた（Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｆｒｅｅ及びＲｏｃｋｙ Ｋｉｎｄｔ、エジンバラ大学）。
実施例ＶＩＩ：統計分析
データ分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００７及びＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用して行った。
データ分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００７及びＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用して行った。
実施例ＶＩＩＩ：結果：成長
白色ＬＥＤ光と比較して、赤色６８０ｎｍ下での培養物の成長に顕著な違いは観察されなかった（図４）。バッチ赤色２における大きな順化遅延期間に注目されたい（図４）。培養物は、順化して光合成において赤色６８０ｎｍ光を利用できるようになるまでに時間を必要とし（観察結果より）、この順化は可逆的であった。
白色ＬＥＤ光と比較して、赤色６８０ｎｍ下での培養物の成長に顕著な違いは観察されなかった（図４）。バッチ赤色２における大きな順化遅延期間に注目されたい（図４）。培養物は、順化して光合成において赤色６８０ｎｍ光を利用できるようになるまでに時間を必要とし（観察結果より）、この順化は可逆的であった。
実施例ＩＸ：結果：ＰＣ分析
フィコシアニンは６２０ｎｍで吸収する。赤色６８０ｎｍＬＥＤバッチの抽出物におけるＰＣの存在は、白色ＬＥＤよりずっと多かった（図５、６）。６７０〜６８０ｎｍ付近の第２クロロフィルａピークにおいて興味深い青色シフトが観察され、ピーク赤色６８０ｎｍ抽出物吸収は６７７〜６７８ｎｍであり、ピーク白色抽出物吸収は６７３〜６７４である（図６）。
フィコシアニンは６２０ｎｍで吸収する。赤色６８０ｎｍＬＥＤバッチの抽出物におけるＰＣの存在は、白色ＬＥＤよりずっと多かった（図５、６）。６７０〜６８０ｎｍ付近の第２クロロフィルａピークにおいて興味深い青色シフトが観察され、ピーク赤色６８０ｎｍ抽出物吸収は６７７〜６７８ｎｍであり、ピーク白色抽出物吸収は６７３〜６７４である（図６）。
ＰＣ濃度は、赤色６８０ｎｍ下での培養を経て白色ＬＥＤ光より平均で５倍（少なくとも９個の試料）上昇し、赤色６８０ｎｍＬＥＤ光下では、白色光と比較して、ＰＣ純度が若干上昇した（図７表）。培養物においては視覚的な色の違いが観察され、これは赤色６８０ｎｍ光下で培養した細胞のＰＣ含有量の上昇に起因する可能性が最も高い（図７）。
実施例Ｘ：結果：ＭＳ分析
ホールセルＭＡＬＤＩスペクトルは、白色ＬＥＤ光と比較した、赤色６８０ｎｍ下での培養による豊富なタンパク質における違いを示した（図８）。
ホールセルＭＡＬＤＩスペクトルは、白色ＬＥＤ光と比較した、赤色６８０ｎｍ下での培養による豊富なタンパク質における違いを示した（図８）。
実施例ＸＩ：結果：浸出差
ＭＳ分析用に準備した試料を廃棄する際、赤色６８０ｎｍ試料においては高濃度のＰＣが溶液となって浸出した（図９）。浸出したＰＣにおける色の変化は、白色ＬＥＤ光と比較して、赤色６８０ｎｍ培養物において目視ではるかに大きく、５倍上昇をはるかに超えるように見えた。これは赤色６８０ｎｍ培養物ではＰＣ浸出特性が異なる可能性を示しており、下流側の加工（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ＤＳＰ）にとって有益になり得る。６８０ｎｍ光下での培養は、生物有機体からのＰＣの浸出を増加させ得る。
ＭＳ分析用に準備した試料を廃棄する際、赤色６８０ｎｍ試料においては高濃度のＰＣが溶液となって浸出した（図９）。浸出したＰＣにおける色の変化は、白色ＬＥＤ光と比較して、赤色６８０ｎｍ培養物において目視ではるかに大きく、５倍上昇をはるかに超えるように見えた。これは赤色６８０ｎｍ培養物ではＰＣ浸出特性が異なる可能性を示しており、下流側の加工（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ＤＳＰ）にとって有益になり得る。６８０ｎｍ光下での培養は、生物有機体からのＰＣの浸出を増加させ得る。
実施例ＸＩＩ：結果：培養物の凝集
６８０ｎｍ光下での培養は培養物の凝集も増大させ得て、ＤＳＰにとっては利点がある。凝集は、ストレス反応としての細胞外多糖（ＥＰＳ）の産生の増加の結果になり得る。これは明らかに、当業者が予測し得なかった、予期せぬ優れた結果である。
６８０ｎｍ光下での培養は培養物の凝集も増大させ得て、ＤＳＰにとっては利点がある。凝集は、ストレス反応としての細胞外多糖（ＥＰＳ）の産生の増加の結果になり得る。これは明らかに、当業者が予測し得なかった、予期せぬ優れた結果である。
当業者ならば、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、これまで説明してきた実施形態を様々に改造したり改変を加えたりできる。当該分野で公知の他の適切な技法及び方法が、当業者により数々の特定の様式でもって、本明細書に記載の本発明の内容を踏まえて適用可能である。したがって、本発明は本明細書で具体的に説明したものとは異なる形で実践し得る。これまでの記載内容は説明のためのものにすぎず、限定的ではない。上記の内容を検討すれば、数多くの他の実施形態が当業者には明白となる。したがって、本発明の範囲は、添付の請求項に、そのような請求項が享受できる均等物の全範囲と併せて準拠することで決定される。
本願は、あらゆる目的のために参照により全て本願に援用される、以下の２０１４年１月２７日に出願の米国仮特許出願番号第６１／９３１７２３号“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ”を優先権とする２０１５年１月２７日出願のＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５０１８３７（特許文献１）及び２０１４年６月１７日に出願の米国仮特許出願番号第６２／０１３４７９号“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎｓ”（特許文献２）の優先権及び利益を主張するものである。
本発明は、色素のレベル及び濃度が上昇する微生物細胞培養条件を用いることに関する。
本発明は、色素のレベル及び濃度が上昇する微生物細胞培養条件を用いることに関する。
Claims (13)
- （ｉ）微生物を適切な成長培地において培養するステップと、
（ｉｉ）適切な光の供給源を用意するステップとを含み、
前記光が約６４０〜約７２０ｎｍの波長を有する電磁放射線から成り、前記培養中の微生物がフィコシアニンを合成する
ことを特徴とするフィコシアニン合成方法。 - 前記微生物がＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ又はＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ又はＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属）である
請求項１に記載の方法。 - 前記電磁放射線が６８０ｎｍの最大波長を有する
請求項１に記載の方法。 - 前記電磁放射線が６８２ｎｍの最大波長を有する
請求項３に記載の方法。 - 前記電磁放射線が６７８ｎｍの最大波長発光を有する
請求項３に記載の方法。 - 第２の光の供給源を用意する追加ステップを含み、
前記光が３５０〜７６０ｎｍの波長を有する電磁放射線を含む
請求項１に記載の方法。 - 前記合成されたフィコシアニンのレベルが、白色光の存在下で培養した同一微生物において合成されたフィコシアニンのレベルより少なくとも４倍高い
請求項１に記載の方法。 - 前記白色光が、３５０〜７６０ｎｍの波長を有する電磁放射線を含む
請求項７に記載の方法。 - 前記合成されたフィコシアニンが前記微生物から浸出する
請求項７に記載の方法。 - 前記微生物が別の生物と置き換えられ、前記別の生物が、光合成細菌、光合成古細菌、光合成原生生物、光合成藻類、光合成蘚類及び光合成植物から成る群から選択される
請求項１に記載の方法。 - 前記生物が組み換えＤＮＡを含む
請求項１０に記載の方法。 - 生化学物質の合成に適し、前記生化学物質が、ヒアルロナン、グルコサミン、サッカライド、多糖、フィコビリタンパク質、アロフィコシアニン、フィコエリトリン、ビリン、フィコビリン、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンから成る群から選択される
請求項１に記載の方法。 - 容器とランプとを備え、前記ランプが少なくとも６４０ｎｍ以上の波長を有する電磁エネルギーを発生し、前記容器がフィコシアニンを合成可能な微生物を含む
ことを特徴とするフィコシアニン生産システム。
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