TWI564388B - 新穎扁藻及其應用 - Google Patents

Description

新穎扁藻及其應用

本發明係關於一種新穎扁藻及其生產應用技術。更進一步而言，本發明係關於一種可生產油脂、天然色素、飼料、及食品之新穎東沙扁藻DS3(Tetraselmis sp.DS3)株。

微藻有多種的應用價值。在微藻細胞裡，色素是重要的化學物質，其功能主要是吸收光能和保護行光合作用的組織，包含主要色素-葉綠素a及b(chlorophyll a and b)和輔助色素-葉黃素(lutein)和胡蘿蔔素(beta-carotene)等。其中葉黃素和胡蘿蔔素這類由四十個碳組合而成的化學結構，左右兩端各有個烴環的色素，統稱為類胡蘿蔔素(carotenoids)。

現階段生產葉黃素的主要來源為金盞花的花瓣，其葉黃素的含量範圍約為其乾重的0.03%至0.69%之間(Fernandez-Sevilla,J.M.,Fernandez,F.G.A.,& Grima,E.M.(2010).Applied Microbiology and Biotechnology,86,27-40；Gao,Nagy,Liu,Simandi,& Wang(2009).The Journal of Supercritical Fluids,49,345-350；Piccaglia,Marotti,& Grandi,(1998).Industrial Crops and Products,8,45-51)。種植金盞花需大量的人力成本及土地；另外，金盞花的葉黃素大部分為雙酯態(diester form) (Fernandez-Sevilla,J.M.,Fernandez,F.G.A.,& Grima,E.M.(2010).Applied Microbiology and Biotechnology,86,27-40)，而微藻的葉黃素大部分為比較容易被人體吸收的游離態(free form)(Hu,C.-W.,Chuang,L.-T.,Yu,P.-C.,& Chen,C.-N.(2013).Food Chemistry,138,2071-2078)。

此外，有些藻種油脂內富含高價值脂肪酸，可作為食品、飼料、化妝品、醫療及研究等用途，因此逐漸開始有商業化開發利用。另有報告指出高經濟價值脂肪酸-長碳鏈Omega-3脂肪酸，除了可以減輕發炎免疫反應、預防癌症外，對水腫、類風溼關節炎、心血管疾病等臨床疾病亦有預防作用(Lee,J.H.,O'Keefe,J.H.,Lavie,C.J.,& Harris,W.S.(2009).Nature Reviews Cardiology,6,753-758)。其中屬於Omega-3脂肪酸的二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)，被指出具有降低膽固醇、抑制血小板凝集、減輕血栓形成等功能。而屬於Omega-6脂肪酸的花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)則有研究指出能促使胎兒腦細胞的發育。

上述提到屬於Omega-3脂肪酸的EPA和屬於Omega-6脂肪酸的AA，皆屬於高度不飽和脂肪酸(HUFA，Highly Unsaturated Fatty Acids)。根據文獻，此類高度不飽和脂肪酸主要是由海洋微藻形成，並經由攝食轉移至海洋草食性浮游動物，再經由食物鏈富集至大型魚類成為市面上販售之魚油(Volkman,Jeffrey,Nichols,Rogers,& Garland(1989).Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,128,219-240)。然而海洋裡的汙染日趨嚴重(例如汞重金屬汙染)，經由食物鏈的生物累積效應，累積於大型魚類的重金屬亦會存在於市售的魚 油內。

為了減低重金屬汙染的疑慮並符合素食者的攝取需求，身為生產者的海洋微藻是Omega-3和Omega-6不飽和脂肪酸較好的來源。為了商業化量產，有較長日照時間和較穩定溫度的熱帶地區，對於戶外大量養殖微藻而言，是較好的選擇。但熱帶地區的高光強和高溫，對於養殖微藻而言是一大考驗。

微藻之培養具有與耕作類似的限制，即溫度和光照強度。耐熱性是微藻在熱帶氣候下，尤其使用光生物反應器下，是否能夠生長的一個關鍵因素。與低光強度相比，高光強度提供進行光合作用所需之更多太陽能。另一方面，如不提供冷卻，高光強度也導致物體的溫度升高。光照強度可利用便宜的遮光網控制，然而利用工程手段人工冷卻大型水體的溫度，其成本相當可觀。因此，在熱帶和亞熱帶地區使用微藻生產生物分子之可行解決方案為開發可適應環境之新穎微藻品種，篩選可在熱帶條件下合成高價油脂及色素的微藻。

本發明提供一新穎之扁藻，其篩選自熱帶地區的小潟湖之中，為一可生合成油脂及色素之扁藻，且可在40℃中生長，而可成為熱帶地區生產高價值產物的優勢海水藻種，可廣泛用於油脂、食品及飼料等之生產。

本發明提供一種微生物之生物培養物，其中該微生物為東沙扁藻DS3(Tetraselmis sp.DS3)株，該東沙扁藻株寄存於中華民國台灣食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC980036。

本發明之東沙扁藻DS3株係從臺灣西南方的東沙環礁國家公園小潟湖中篩選分離出一種新的海洋綠藻。其命名的根據為外部形態及其rDNA序列。將其18S rDNA和ITS1-5.8S-ITS2 rDNA的核酸序列與GenBank上與其相似的藻種進行比對，其結果如圖1所示，此藻種於親緣關係樹上被歸為與扁藻(Tetraselmis)同一群。因此，根據形態的特徵和rDNA序列的相似性，命名為東沙扁藻DS3(Tetraselmis sp.DS3)。根據本發明之東沙扁藻DS3株，該藻體呈略扁平橢圓體，頂端前部凹陷，鞭毛4條由凹陷處生出，有一紅色眼點；細胞長約10-15μm，寬約5-9μm，厚約3-5μm，如圖2A、2B所示。

由於日夜循環的緣故，在熱帶地區戶外養殖每日高溫持續時間不會超過10小時。為了確認該扁藻細胞是否在高溫下亦可維持生長，本發明設計了每12小時轉換一次溫度的耐熱測試，監測三日內的生長狀況。結果顯示Tetraselmis sp.DS3這株微藻細胞，在40℃的高溫下亦可穩定生長。

本發明亦提供一種生產油脂之方法，其包含使用前述之培養物生產油脂，其中該油脂包含二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)。本發明比較不同鹽度和缺乏氮的條件下，細胞內脂肪酸含量。結果顯示EPA在總油脂裡所佔的比例最高可達約10%。在所有培養條件下Omega-3脂肪酸在總油脂裡所佔的比例，皆高達約30%；多元不飽和脂肪酸在總油脂裡所佔的比例，則皆高達約50%。

本發明再提供一種生產色素之方法，其包含使用前述之培養物生產色素，其中該色素包含葉黃素(lutein)、β-胡蘿蔔素(β-carotene) 或其組合。本發明比較葉黃素佔藻類的乾重約0.48%；而β-胡蘿蔔素最高可高達6.3%。

本發明又提供一種生產飼料之方法，其包含使用如前述之培養物生產飼料。

本發明另提供一種生產食品之方法，其包含使用如前述之培養物生產食品。

本發明再提供一種色素組合物，其包含如前述之培養物。

本發明又提供一種飼料，其包含如前述之培養物。

本發明另提供一種食品，其包含如前述之培養物。

圖1A為Tetraselmis sp.DS3 18S rDNA的親緣關係樹；圖1B為Tetraselmis sp.DS3 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA的親緣關係樹；圖2A為Tetraselmis sp.DS3在光學顯微鏡下的照片；圖2B為Tetraselmis sp.DS3在掃描式電子顯微鏡下的照片；圖3為Tetraselmis sp.DS3兩階段式生長曲線；圖4為Tetraselmis sp.DS3經SYTOX Green染色後的螢光顯微鏡照片；圖5為Tetraselmis sp.DS3在不同溫度處理下24小時內葉綠素的變化；圖6為Tetraselmis sp.DS3在每12小時變換溫度培養下的生長曲線；圖7為Tetraselmis sp.DS3經尼羅紅(Nile Red)染色之螢光顯微鏡照片；圖8為Tetraselmis sp.DS3色素萃取液的HPLC圖譜。

下列實施例僅代表本發明之各種態樣與特徵，並非限制本發明之範圍。熟悉此技藝者可依照需要，在不背離本發明之範疇及精神之下做適當的變更。

微藻樣本、養殖方法及逆境處理條件

微藻樣本係於東沙環礁國家公園裡的小潟湖中篩選出來，實驗所用培養基是以0.3μm濾紙(ADVANTEC GF-75，Japan)過濾的天然海水添加營養成分配置而成的2f培養液，內含3.53mM NaNO₃，0.15mM NaH₂PO₄，並添加生長所需之微量礦物質。

微藻液態培養於200mL血清瓶，於室溫(30℃)下以一般空氣打氣培養，以強度為150μmol/m²s之光源持續進行單面照光，實驗光照所用燈管為T5日光燈管。在培養過程中以吸光值OD₆₈₂監測其生長情況。

逆境實驗中，Tetraselmis sp.DS3先於正常情況下培養(stage I)。實驗組與對照組stage I的起始濃度皆為OD₆₈₂=0.25，在此階段實驗組不作任何逆境處理。當生長進入停滯期(約七天)，將光照強度從原先的150μmol/m²s提高至300μmol/m²s，並進行以下處理：對照組-再次補充2f培養液之營養成分；高鹽處理實驗組：補充2f培養液之營養成分、分別添加NaCl使鹽度至5%及9%；缺氮處理實驗組：將微藻細胞移至無添加氮的2f培養液。接著繼續培養，直到Tetraselmis sp.DS3的生長再次進入停滯期(stage II，約第14天)，微藻細胞即收穫並進行分析。

生長曲線如圖3所示。雖然在逆境處理下的實驗組生長情況皆較對照組差，但依然是處於穩定生長的情況。

掃描式電子顯微鏡(Scanning electron microscopy,SEM)

微藻細胞加入2.5%戊二醛後，於4℃存放4小時以上進行固定。固定完成之樣本加入去離子水以超音波震盪的方式清洗三次後，將藻液滴落於孔徑0.45μm的Nylon濾紙上。將有藻液的濾紙依序加入30、50、70、85、95、100%的酒精各放置10分鐘進行脫水，接著置於100%的丙酮保存。處理過的樣本使用臨界點乾燥機(Emitech K-850)，利用液態二氧化碳作為轉換液，以轉換液在臨界點達到氣液相並存的特性，將樣本於此狀態下乾燥。乾燥後的樣本使用離子覆膜機(Hitachi E-1010)鍍上金離子，便以掃描式電子顯微鏡(Hitachi S-3000N)觀察微藻細胞及成像。

藻體呈略扁平橢圓體，頂端前部凹陷，鞭毛4條由凹陷處生出，有一紅色眼點；細胞長約10-15μm，寬約5-9μm，厚約3-5μm，如圖2A、2B所示。

DNA萃取

微藻細胞以3000g(Eppendorf 5810R)常溫離心5分鐘的方式收穫下來。收穫下來的微藻細胞加入0.5ml核酸萃取液(內含有0.3M NaCl、50mM Tris-HCl(pH 8)、20mM EDTA、0.34mM N-十二烷基肌氨鈉(N-Lauroylsarcosine Sodium)及1.75M尿素)，再加入0.5g的玻璃珠(Sigma G-9268,425-600μm)後，以微珠震盪器(mini beadbeater)破碎細胞。所得混合物在65℃水浴槽浸泡10分鐘，並於常溫下以16000g(Eppendorf 5415R)離心5分鐘。將上清液移至新的離心管，並加入0.5mL的苯酚/氯仿(1：1)混勻約5分鐘。混合後使蛋白質變性，並以上述條件再次離心；將所得之上清液轉移至新管，並加入體積為上清液0.8倍的異丙醇混勻約5分鐘。以上述條件再次離心，去除上清液，並以70%酒精潤洗底部的沉澱物兩次，再將其置於室溫下乾燥，使酒精完全揮發。最後將沉澱物溶解於50μL內含50μg/mL RNase的TE緩衝液。

PCR(聚合酶鏈鎖反應，Polymerase Chain Reaction)擴增及rDNA定序

18S rDNA使用下列的引子進行PCR來增輻：18S正向「TGATGGTACCTACTACTCGGA」(SEQ ID NO.1)及18S反向「ACGGGCGGTGTGTACAAA」(SEQ ID NO.2)。ITS1-5.8S-ITS2 rDNA使用下列的引子進行PCR來增輻：ITS正向1：「ACCTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAA」(SEQ ID NO.3)及ITS反向1：「TTCCTCCGCTTATTGATATGC」(SEQ ID NO.4)。

將成功增輻之PCR產物進行定序。定序完成之18S rDNA和ITS1-5.8S-ITS2 rDNA的核酸序列，上傳至NCBI上GenBank，序列代號分別為KP100528和KP100529(訂於2017年公開)。以此二核酸序列於GenBank上進行對比，選擇最類似的9個序列，進行親緣關係分析。分析的方法為MEGA 5(Tamura K.,Peterson D.,Peterson N.,Stecher G.,Nei M.,Kumar S.(2011).Molecular Biology and Evolution,28：2731-2739)軟 體裡的Maximum Likelihood，來建立親緣關係樹，並利用500次自展值重複取樣方法來檢測親緣關係樹之可信度

親緣關係研究之結果如圖1所示，此藻種於親緣係樹上被歸為與Tetraselmis同一群。圖1A為Tetraselmis sp.DS3 18S rDNA的核酸序列與在GenBank比對下和其相似的藻種分析而作成的親緣關係樹。圖1B為Tetraselmis sp.DS3 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA的核酸序列與在GenBank比對下和其相似的藻種分析而作成的親緣關係樹。

Tetraselmis sp.DS3於高溫處理下的死亡率測試

微藻細胞先以常溫(30℃)於1000mL液態培養至對數生長期的中期，再以初始濃度為OD₆₈₂=0.8，稀釋分瓶培養於200mL中，以照度150μmol/m²s單面照光的方式打氣培養，分別以35℃、40℃、45℃的高溫進行24小時的耐熱測試。處理前後分別取樣染色計算死亡率。

使用SYTOX Green來將微藻細胞染色(最終濃度5μM；Molecular Probes Inc.,Eugene,OR,USA)(Pan.Y.Y.,S.T.,Chuang,L.T.,Chang,Y.W.,& Chen,C.N.N.(2011).Bioresource Technology,102,10510-10517)，染色時間為20分鐘。利用照射藍光(485nm)所激發的螢光，以螢光顯微鏡作檢測。如圖4所示，發散紅色螢光的是活細胞的葉綠素；死亡細胞則會表現出綠色螢光。

實驗結果顯示在35℃時微藻的死亡率很低，維持在1.3%左右，而上升至40℃後死亡率仍然維持在2.8%左右；45℃以上的 高溫，則會造成Tetraselmis sp.DS3的細胞有較大幅度的死亡率。由此試驗得知Tetraselmis sp.DS3可良好適應至40℃的高溫，而不會導致細胞大量死亡。

Tetraselmis sp.DS3葉綠素含量測試

葉綠素的含量，對於行光合作用的細胞健康與否，是個很重要的指標。在嚴苛的環境逆境下，細胞體內的機制和位於類囊體的電子傳遞鏈，其調節能力會下降。所以在此情況下，這些膜上有葉綠素的類囊體較易產生超氧化物和其他自由基。若行光合作用的細胞無法承受逆境，膜上的葉綠素便會因此造成損壞(Hu,C.-W.,Chuang,L.-T.,Yu,P.-C.,& Chen,C.-N.(2013).Food Chemistry,138,2071-2078)。

微藻細胞先以常溫(30℃)於1000mL液態培養至對數生長期的中期，再以初始濃度為OD₆₈₂=0.8，稀釋分瓶培養於200mL中，以照度150μmol/m²s單面照光的方式打氣培養，分別以35℃、40℃、45℃的高溫各進行24小時的耐熱測試，每8小時取樣一次。溫度轉換的部份是直接由常溫轉換至耐熱測試的溫度。

微藻細胞以3000g(Eppendorf 5810R)常溫離心5分鐘的方式收穫下來。收穫下來的微藻細胞在避光的環境下，加入80%冰丙酮和0.5g的玻璃珠(Sigma G-9268,425-600μm)以微珠震盪器擊碎細胞，將葉綠素提取出來。使用分光光度計以波長647和664nm去測量上清液的吸光值。葉綠素含量以下列公式做計算：總葉綠素(μg/mL)=17.76(A₆₄₇)+7.34(A₆₆₄)；葉綠素a=12.25(A₆₆₄)-2.55(A₆₄₇)；葉綠素b =20.31(A₆₄₇)-4.91(A₆₆₄)。

結果如圖5所示，Tetraselmis sp.DS3的葉綠素含量在35℃的處理下，在24小時培養過程中穩定的增加，第24小時的葉綠素含量與第0小時的含量相比有顯著性增加，表示在此溫度下Tetraselmis sp.DS3可正常生長；在40℃培養的24小時中，葉綠素含量沒有顯著增加的趨勢，與第0小時的含量相比，僅於第8小時略微增加，表示細胞在24小時之間雖沒有顯著成長，但依然維持穩定。由此實驗可進一步證實，Tetraselmis sp.DS3可承受40℃的高溫。45℃的處理造成這些細胞的葉綠素含量持續下降，顯示已到達耐熱極限。

Tetraselmis sp.DS3的雙相變溫養殖

由於日夜循環的緣故，在熱帶地區戶外養殖每日高溫持續時間不會超過10小時。為了確認微藻細胞是否在高溫下除了能維持穩定的存活率，亦可維持生長，因此設計了每12小時轉換一次溫度的耐熱測試，監測三日內的生長狀況。

細胞先以常溫(30℃)於1000mL液態培養至對數生長期的中期，再以初始濃度為OD₆₈₂=0.8，稀釋分瓶培養於200mL中，以照度150μmol/m²s單面照光的方式打氣培養，分別以35/40℃、35/45℃，以12小時轉換一次溫度的方式，進行72小時的耐熱測試。在每12小時轉換溫度的時候，使用分光光度計以波長為682nm測水體之吸光值，來記錄其生長狀況。

結果如圖6所示，35/40℃這組耐熱測試，在三日內細胞穩 定的成長；而35/45℃這組耐熱測試的生長，在第一次轉換溫度即被抑制。此實驗結果與前兩項耐熱實驗相互證實Tetraselmis sp.DS3這株微藻細胞，在40℃的高溫下，不只存活率穩定，若每日連續高溫高達40℃的情況下培養，亦可穩定生長。

另外，Tetraselmis sp.DS3也可在熱帶地區的台灣高雄，以18公升的透明塑膠桶進行戶外密閉式養殖，此養殖方法進一步支持了以上的實驗結果，證明此株藻種確實有耐熱的能力。因此Tetraselmis sp.DS3確實擁有可於熱帶地區進行戶外大量培養的優勢。

總油脂的提取和油脂組成分析

為了檢測Tetraselmis sp.DS3的生物量、脂質含量及脂肪酸組成，是否會受到環境逆境的影響，在細胞的生長進入停滯期(約七天)後，進行逆境處理。當其生長再次進入停滯期，即收穫進行生物量之定量、油脂萃取及脂肪酸分析。

活細胞裡的油體可使用尼羅紅(Nile Red)染劑染色，利用照射藍光(485nm)所激發的螢光，以螢光顯微鏡做觀察。圖7為Tetraselmis sp.DS3經過7天缺氮培養，透過螢光染劑尼羅紅染色後，以螢光顯微鏡做觀察的照片，其中黃色螢光的部分為其油脂的部分。由於缺氮培養的細胞會促使油體的生成(Pan.Y.Y.,S.T.,Chuang,L.T.,Chang,Y.W.,& Chen,C.N.(2011).Bioresource Technology,102,10510-10517)，因此其油脂含量略高於正常情況下培養及其他逆境下培養的細胞。

如表1所示，Tetraselmis sp.DS3在不同情況下培養的脂肪酸 組成比例略有不同。高價值EPA的部分，在總油脂裡所占的比例最高可達約10%，最高值出現在經過缺氮培養至停滯期的細胞；另外，在正常情況下培養的細胞，EPA在總油脂裡所占的比例亦可高達9.3%。而可轉換成EPA的SDA在各個條件下於總油脂裡所占的比例也可高達5.7%。可合成EPA的前驅物ALA在總油脂裡所占的比例最高值可高達16.7%。

色素分析

已知微藻裡用來作為感光因子的橘紅色眼點，其中含有大量的類胡蘿蔔素，而除了眼點外，微藻裡的類囊體膜上也有很多類胡蘿蔔素，若此含有大量EPA的微藻含有類胡蘿蔔素，將更能提升其價值。因此Tetraselmis sp.DS3在生長進入停滯期後，進行逆境處理。當 其生長再次進入停滯期即收穫進行色素提取及色素分析(Hu,C.-W.,Chuang,L.-T.,Yu,P.-C.,& Chen,C.-N.(2013).Food Chemistry,138,2071-2078)。

利用HPLC及現有的色素標準品所分析出來的已知色素有葉綠素a、葉綠素b、葉黃素及β-胡蘿蔔素。如圖8所示，各個峰型所代表的色素分別為：1-葉黃素、2-葉綠素b、3-葉綠素a、4-β-胡蘿蔔素。

現階段生產葉黃素的主要來源為金盞花的花瓣，其葉黃素的含量範圍約為其乾重的0.03%至0.69%之間。但種植金盞花需大量的人力及土地。金盞花的葉黃素大部分為雙酯態，而微藻葉黃素大部分為大部分為易被人體吸收的游離態。而Tetraselmis sp.DS3裡的葉黃素含量與其他微藻相似。因此，Tetraselmis sp.DS3確實擁有可生產類胡蘿蔔素的能力。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

中華民國財團法人食品工業發展研究所、104年3月25日、BCRC 980036。

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

<110> 國立中山大學

<120> 新穎扁藻及其應用

<130> 2415-NCSU-TW

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> 18S rDNA順向引子

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> 18S rDNA反向引子

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> ITS1 rDNA順向引子

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<221> misc_feature

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<400> 3

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<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> ITS1 rDNA反向引子

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<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<400> 4

Claims (10)

1. 一種微生物之生物培養物，其中該微生物為東沙扁藻DS3(Tetraselmis sp.DS3)株，該東沙扁藻株寄存於中華民國台灣食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC980036。
2. 一種生產油脂的方法，其包含使用根據請求項1之培養物生產油脂。
3. 如請求項2之方法，其中該油脂包含二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)。
4. 一種生產色素的方法，其包含使用根據請求項1之培養物生產色素。
5. 如請求項4之方法，其中該色素包含葉黃素(lutein)、β-胡蘿蔔素(β-carotene)或其組合。
6. 一種生產食品的方法，其包含使用根據請求項1之培養物生產食品。
7. 一種生產飼料的方法，其包含使用根據請求項1之培養物生產飼料。
8. 一種色素組合物，其包含根據請求項1之培養物。
9. 一種食品，其包含根據請求項1之培養物。
10. 一種飼料，其包含根據請求項1之培養物。