JP2020536571A - 良好な抗酸化特性を有しかつ動物またはヒトの消費のための食品の調製において有用である、高いルテイン含量と低い金属含量をもつバイオマスを生産するための、微細藻類ムリエロプシスsp(Muriellopsis属の種)の屋外培養のための方法 - Google Patents
良好な抗酸化特性を有しかつ動物またはヒトの消費のための食品の調製において有用である、高いルテイン含量と低い金属含量をもつバイオマスを生産するための、微細藻類ムリエロプシスsp(Muriellopsis属の種)の屋外培養のための方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は藻類から抗酸化物質を生産するための方法に関する。好ましくは、本発明は、2017年10月2日付のスパニッシュ・バンク・オブ・アルジー(Spanish Bank of Algae)の受託番号BEA_IDA_0063Bの微細藻類ムリエロプシスsp(Muriellopsis属の種)からの、高いルテイン含量および低い金属含量をもつバイオマスの生産と、および動物飼料またはヒトの飲食のための調製におけるその使用とに関する。
Description
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は微細藻類からの抗酸化物質の生産のための方法に関する。好ましくは、本発明は、2017年10月2日付のスパニッシュ・バンク・オブ・シーウィード(Spanish Bank of Seaweed)の受託番号BEAJDA 0063Bの微細藻類ムリエロプシスsp(Muriellopsis属の種)からの、高いルテイン含量と低い金属含量をもつバイオマスの生産と、および動物飼料またはヒトの飲食のための調製におけるその使用とに関する。
世界的な傾向は、生産プロセスにおける化学物質、染料、抗体などの有機的生産および置換に関連する。この意味において微細藻類は、それらが生み出す広範囲な天然産物を考慮すれば、高度に多様な適用によって、多種多様な生物工学的応用のための良好な可能性を示している。
微細藻類は、食品から化学物質およびバイオ燃料まで、ヒトにとり有用な種々の化合物の潜在的な供給源として、長年にわたり想定されてきた。しかしながら、現在それらを入手することはそれほど経済的ではなく、それ故その実行の可能性は、生産されるべき目標製品のその生産コストに対する最低価格によって示される。こうした状況において、抗酸化物質の生産は、ともに微細藻類をベースとする操作を支持することも可能な、その市場の成長と魅力的な価格とを考慮すれば、良好な機会を示している。
この傾向において、微細藻類ムリエロプシスspから入手可能なルテインは、変性疾患、特に、黄斑変性、白内障、および動脈硬化症の防止および治療におけるその有益な治療効果に関し、北米FDAによって推奨された10の「健康な」物質の1つとして登録されている。ムリエロプシスspは、多量のルテイン(乾燥重量の0.5と1%の間)を生産する能力をもつ単細胞緑藻である。
一方、近年の加速的な人口増加においては、その加齢および関連する疾患は、今日、世界においてますます増加する懸念である。その結果として、育てやすく、収益性が高く、かつ持続可能である食品の代用源の探索を通して、栄養上の需要に備えることが必要である。この点については、微細藻類の培養の応用に関する研究は、養殖産業のためまたは商業的価値の高い化合物の生産のためにかなり増加しており、該化合物の中でも多価不飽和脂肪酸およびカロテノイド色素を見出すことができる。これらの色素は、魚の餌に混入するため、およびヒトの食事における栄養補助食品として使用されてきた。
特許文献1は、緑藻ルテインを、特にクロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)(受託番号CCAP21 1−32、英国カルチャーコレクション・オブ・アルジー・アンド・プロトゾア(Culture Collection of Algae and protozoa)において寄託)から得るためのプロセスを開示しており、これは、20mMから60mMまでの酢酸塩中で育てられかつおよそ200から1.500μl(Em2s1)の光を放射された場合、全カロテノイドの少なくとも約90重量%を産生し、その後、それは収穫物からルテインを得るべく収穫される。抗酸化剤、例えばアルファ−トコフェロールが、収穫の前または後に付加的に添加され得る。また、ルテインが富化された製品を調製するための方法が開示され、これは、微細藻類クロレラ・ソロキニアナを20から60mMの酢酸塩中で培養すること、および約200から1,500μ/(Em2s1)の光を放射すること、および収穫して濃縮された懸濁液を生成すること、ならびに任意でかつ付加的に、濃縮懸濁液の細胞を破壊すること、およびそれらを乾燥させてルテインまたはルテインが富化された製品を得ることを含む。この藻類は約20から約40℃の間の温度で増殖し、かつ光照射、化学的ストレス、塩、温度、または酸化ストレスというストレス条件の下に行われ得る。製品は、5を超えるルテイン/ゼアキサンチン比、および10未満のクロロフィルA/ルテイン比を有する。かくて緑藻からのルテインの高生産が得られる。ルテイン、およびルテインが富化された製品は、栄養補助食品および/または食品添加物、または化粧品もしくは医薬品の原料としての使用に適する。
特許文献2は、微細藻類バイオマスからのルテイン富化組成物の調製であって、前記バイオマスの細胞溶解物を調製すること、およびそれを、15重量%を超える乾物含量まで濃縮すること、該溶解物を極性溶媒で処理すること、およびルテインおよび脂質を含有する油性樹脂を得ること、該油性樹脂を25MPaおよび40MPaの圧力および35℃から90℃の温度においてCO2の超臨界液の形態にある非極性溶媒で抽出して、トリグリセリドを含有する非極性脂質画分とルテインに富む不溶性画分とを得、そして前記不溶性画分を回収することによる、該調製を開示している。極性溶媒は、メタノール、エタノール、n−プロパノールおよびイソプロパノール、ブタノールおよびイソブタノール、エステルおよびケトンから、単独でまたは組合せて選択される。該微細藻類は、クロレラ科に属する。ルテインに富む画分は、医薬組成物、栄養補助食品、および食品において有用である。
特許文献3は、微細藻類においてルテインを蓄積するための方法であって、培養物の希釈後に光により誘導可能な従属栄養培養物を調製すること、および任意で、藻類を収穫して、細胞密度0.1−10g/リットルの従属栄養藻類から希釈されたアルギン酸塩(alginate)の溶液を用いてルテインを分離および抽出する、該方法を教示する。培養は有機炭素を含まず、かつpH4.0−9.0において実施される。微細藻類は、クロレラ・ピレノイドーサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、およびクロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)から選択され得る。培養は光によって誘導され、かつ微細藻類の希釈溶液を含む。培養温度は5−50℃の間であり、強度0.1−150klxの連続光または間欠光を用いて、1から150時間にわたり培養される。この方法はさらに、藻類の乾燥粉末または生物活性物質の混合後に、ルテインを含む藻類色素を、分離および抽出によって取り出すことを含む。このように、それは、光により誘導される微細藻類の従属栄養培養においてルテインの迅速な蓄積を可能にする方法を教示し、またそれにより、産業化され得る方法を提供する。
特許文献4は、収集された細胞を破壊すること、およびそれらを乾燥させてルテインまたはルテインが富化された組成物を得ることにより、より生物学的利用能の高いルテインをいかに入手するかを記載することに加えて、ビーズを使用し、これにおいてマス懸濁液が適当な抗酸化剤の存在下に水を分解してルテインの酸化を防止する。乾燥後、小径粒子の粉末化された生成物が得られ、これを直接ヒトの飲食のための食品用途において、または他の成分と混合してアクアフィード用に使用し得る。ルテインは、栄養補助食品または医薬品を調合する目的で、非極性溶媒または超臨界溶媒を用いた抽出により濃縮され得る。それ故、本発明の技術的問題は、高いルテイン含量および低い金属含量をもつバイオマスを、スパニッシュ・バンク・オブ・アルジー(Spanish Bank of Algae)の受託番号BEAJDA 0063Bの微細藻類ムリエロプシス(Muriellopsis)種から生産するための代替え法、および動物飼料またはヒトの飲食のための調製におけるその使用を提供することである。
非特許文献1は、屋外の管状光バイオリアクタにおける単細胞緑藻ムリエロプシスspの希釈率、混合、ならびに、ルテインおよびバイオマス産生の毎日の太陽サイクルについての研究である。ルテインの生産性の最高値は、1日当たり約180mg/m2であり、バイオマスは、1日当たり約40g(ドライベース)/m2であった。最適な希釈率は、最低値0.06/hから最大値0.09/hまでの範囲であった。約4%の光合成効率に類似した値が記録され、培養条件の最適化が確認された。毎日の太陽サイクルは、1日の最初の数時間の間は、照射に応答してムリエロプシスspのルテイン含量に迅速な増加を示し、最大ルテイン含量は、正午に乾燥重量で約6mg/gであった。細胞増殖における増加は、最大のクロロフィル・ルテイン比の達成後に確認され、そのことは、ルテインが細胞の光障害からの防御に関与していることを示唆するものであろう。
非特許文献2は、15株の微細藻類のカロテノイドプロフィールを調べている。ルテイン、ベータ−カロテン、およびビオラキサンチンが全ての株に存在し、全般的にはルテインが最も豊富であった。カンタキサンチンおよびアスタキサンチンは、いくつかの株にのみ見出された。クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)SAG 211−8b、クロロコックム・シトリフォルメ(Chlorococcum citriforme)SAG 62.80、ムリエロプシスsp、ネオスポンギオコックム・ゲラチノスム(Neospongiococcum gelatinosum)SAG B 64.80、およびクロレラ・ゾフィンギエンシス(Chlorella zofingiensis)CCAP 21 1/14は、高レベルのルテインを示した。クロレラ・ゾフィンギエンシスCCAP 21 1/14はまた、高レベルのアスタキサンチンも示した。ムリエロプシスspは、35mg/リットル培養物までの高いルテイン含量、0.17−0.23/hまでの高い増殖速度、および8x1010細胞/リットル培養物までの細胞密度を示した。ルテインレベルは、ヘマトコッカス(Haematococcus)におけるアスタキサンチン、およびカロテノイドを生産するために興味が認められた微細藻類、ドナリエラ(Donaliella)におけるベータ−カロテンについて報告されたものの範囲内にある。ムリエロプシスspのルテイン含量は、対数増殖期の間増加し、定常期初期には高い値が記録された。収穫物ムリエロプシスspにおけるルテインの最大レベル。それらは、20−40mM NaNO3、2−100mM NaCl、460マイクロモルの光子/m2s1、pH6.5、および28℃において記録され、一般に細胞増殖にも最適な条件であった。増殖制限条件は、6または9のpH値、および33℃の温度であり、またムリエロプシスspにおけるカロテノイド生成も刺激した。この研究は、該株が、養殖および家禽における応用のため、ならびに癌および網膜の変性に関連する疾患の予防のための、商業的興味のカロテノイドであるルテインの、潜在的な供給源を意味することを示している。非特許文献3は、攪拌された開放池における微細藻類の増殖、およびそのカロテノイドを蓄積する能力を研究し、開放系における細胞増殖が主たるカロテノイドとして遊離ルテインを有していたこと、またそこにはビオラキサンチン、β−カロテン、およびネオキサンチンも存在したことを結論付けた。乾燥バイオマスのルテイン含量は、増殖条件および環境に依存して、0.4から0.6%の範囲内である。加えて、ムリエロプシスspのバイオマスは、高いタンパク質および脂質含量を有しており、約半分が多価不飽和脂肪酸で、ほぼ30%がα−リノレン酸であった。半連続的な系の下で生産的作物を維持するための開放池における培養の性能と、バイオマスおよびルテインの収量とを決定するパラメータの影響は、閉鎖された管状光バイオリアクタにおいて得られたものよりも高くはなく、かつ夏季には約100mgルテイン/m2日1を含有する、20gの乾燥バイオマスという生産性の値に達していた。それ故この研究は、ルテインを生産するための、開放プールにおけるムリエロプシスspの屋外培養の可能性を確証している。したがって、本発明は、スパニッシュ・バンク・オブ・アルジー(Spanish Bank of Algae)の受託番号BEAJDA 0063Bの微細藻類ムリエロプシスspの、海水中での安定な培養系であって、高いルテイン含量および低い金属含量をもつバイオマスを微細藻類ムリエロプシスspから生産することを可能にする該系と、その動物飼料またはヒトの飲食のための調製における使用とを提供する。
Lutein production by Muriellopsis sp. in an outdoor tubular photobioreactor(屋外管状光バイオリアクタにおけるムリエロプシスspによるルテイン生産)「Journal of Biotechnology」、2001年2月23日、第85巻、第3号、P.289−295
Carotenoid content of chlorophycean microalgae:Factors determining lutein accumulation in Muriellopsis sp.(Chlorophyta(緑藻類に属する微細藻類のカロテノイド含量:ムリエロプシスsp(緑藻植物門)におけるルテイン蓄積を決定する因子)「J.Biotechnol.」、2000年1月7日、第76巻、第1号、P.51−9
Outdoor cultivation of lutein−rich cells of Muriellopsis sp. in open ponds(開放池でのムリエロプシスspのルテイン富化細胞の屋外培養)「Applied Microbiology and Biotechnology」、2007年1月、第73巻、第6号、P.1259−1266
本発明は、アタカマ砂漠に固有の淡水株を使用する。この株は、2017年10月2日付のスパニッシュ・バンク・オブ・アルジー(Spanish Bank of Algae)の受託番号BEAJDA 0063Bのムリエロプシスsp(Muriellopsis属の種)であり、カロテノイド色素、特にルテインの天然供給源として可能性をもち、これにおいて得られる濃度は0.3乾燥重量%から0.6乾燥重量%の範囲内である。これらの値は、0.03%というそのルテイン産生が報告されているこの色素の現在の供給源、花卉タゲテス・エレクタ(Tagetes erecta)、一般名カレンデュラ(Calendula)の花弁から得られたものよりも10倍から20倍の間を示す。
UMA5培地を加えた海水における、ムリエロプシスsp(MCH−35、BEAJDA 0063B)株。研究室分析は、様々なバッチで得られたいくつかのバイオマスの近似の含量(灰分、タンパク質、脂質、ルテイン)のために実施された。灰分含量についての結果は、7.15%および11.88%の範囲内であり、全てのサンプル間の平均値は10.06%であった。タンパク質含量は、8.70から12.09の範囲内であり、平均は10.31であった。炭水化物含量は、65.00%から74.25%の範囲内であり、平均値は68.37%であった。脂質含量は、8.95%から13.48%の範囲内であり、平均値は11.26であった。水分は、17.58%から31.52%の範囲内であり、平均値は25.93%であった。ルテインのパーセントは、0.37%から0.66%の範囲内であり、平均値は0.54%であった。クロロフィルa、b、および総カロテノイドの測定は、7日間にわたる、4バッチまたは複数のバッチの平均として実施され、それぞれ0.06%;0.10%;および0.09%の範囲内の値であった。平均の7日の、4バッチのルテインのパーセント含量は、0.53%であった。得られた結果によれば、14m3の水路において7日間にわたり戸外で培養された、スパニッシュ・バンク・オブ・アルジーの受託番号BEAJDA 0063Bの微細藻類ムリエロプシスspは、高い、抗酸化能、ポリオレフィンおよびルテイン含量をもち、良好な栄養素量と抗酸化特性とをもつ農産食品における使用への可能性を示す、バイオマスの生産を可能にする。
このカロテノイドの最高のパーセントが得られている、セネスデムス・アルメリエンシス(Scenesdemus almeriensis)株から得られた参考値は、0.55%ルテインである。現在、抽出によってルテインを入手するための一般的な供給源は、タゲテス・エレクタ(チャイニーズカーネーションまたはマリーゴールド)の花であり、その0.03%が得られている(Sanchezら、2008年)。それ故、本発明は、ムリエロプシスspのための、良好な抗酸化特性をもちかつ動物飼料またはヒトの飲食のための調製に有用である、高いルテイン含量および低い金属含量をもつバイオマスを生産する目的のために有望な方法である。
スパニッシュ・バンク・オブ・アルジーの受託番号BEA_IDA_0063Bの、UMA5培地を用いた海水中の、チリ産のムリエロプシスsp株(MCH−35)。様々なバッチで得られた微細藻類のいくつかの培養物の、近似の含量(灰分、タンパク質、脂質、ルテイン)の研究室分析が実施された。灰分含量についての結果は、7.15%および11.88%の範囲内であり、全てのサンプル間の平均値は10.06%であった。タンパク質含量は、8.70から12.09の範囲内であり、平均は10.31%であった。炭水化物含量は、65.00%から74.25%の範囲内であり、平均値は68.37%であった。脂質含量は、8.95%から13.48%の範囲内であり、平均値は11.26%であった。水分は、17.58%から31.52%の範囲内であり、平均値は25.93%であった。ルテインの含量は、0.37%から0.66%の範囲内であり、平均値は0.54%であった。クロロフィルa、b、および総カロテノイドの測定は、7日間の、4バッチまたは複数のバッチの平均として実施され、それぞれ以下の値:0.06%;0.10%、および0.09%を得た。7日の、4バッチまたは複数のバッチのルテインパーセントの平均含量は、0.53%であった。表3から7を参照。
得られた結果によれば、14m3の水路において7日間にわたり、屋外において海水中で培養された、スパニッシュ・バンク・オブ・アルジーの受託番号BEA_D01_11の微細藻類ムリエロプシスspは、高い抗酸化能と、ポリフェノールおよびルテインの高い含量とを示しており、それは結果として、良好な栄養素量と抗酸化特性とをもつ潜在的な農産食製品を生じる。
この培養方法は14m3の水路プールにおいて実施され、凍結乾燥されたサンプルは、繊維分析に加えて、重金属分析(ヒ素、カドミウム、水銀、および鉛)に供された。分析の結果を、動物飼料向けの供給品における不純物の最大限度を規定するもの、例えば、重金属では、特にヒ素:40ppm;鉛:15ppm;水銀:0.3−0.5ppm、およびカドミウム:1ppmに比較した場合、サンプルは結果として、最も使用されている基準による許容値を下回る値、すなわち、以下の値:ヒ素:1.823ppm;鉛:0.2ppm;水銀:0.111ppm、およびカドミウム:0.20ppmを生じた。さらに、微細藻類バイオマス中に含有された生繊維の量は4.43g/100gであった。
7日の微細藻類培養物の総ポリフェノール(フェノール化合物)含量は、322mg EAG/100g試料の値を示す。一方14日では、その値は254mg EAG/100g試料である。抗ラジカル活性は、7日および14日についてORAC法を用いて評価され、以下の値:8.974および6.316μmol ET/100gを得た。このことは、7日の培養物が、14日に比較して30%多い抗酸化活性をもつことを示す。ORACアッセイが、抗酸化活性に対する、所与の食品中に含有されるポリフェノールおよび非ポリフェノール化合物のいずれかによる貢献力発揮の測定を含むことに言及することは重要である。ウェブサイトwww.portalantioxidantes.comにより提供された、果実における抗酸化活性および総ポリフェノール含量のデータベースのORAC値によって述べられたように、7日について得られた結果は、調べられたいくつかの果実と同様か、またはより優れている。報告された全147の果実から、MCH−35は99位に位置されることとなる。
実施例1:海水および淡水中での種々の株の増殖
スパニッシュ・バンク・オブ・アルジー(Spanish Bank of Algae)の受託番号BEAJDA 0063Bのチリ産ムリエロプシスspの株の増殖挙動を、任意に命名された(MCH35)を海水中で、および任意に命名された(MCHO)を淡水中で評価した。スペイン産ムリエロプシスspの株、(ME35)および(MEO)もまた評価した。培養は、バイオマス濃度の増加に関する挙動を測定する目的で、2つの培地中で実施し、それにより屋外作物において使用されるべき培地を確認することが可能となった。
スパニッシュ・バンク・オブ・アルジー(Spanish Bank of Algae)の受託番号BEAJDA 0063Bのチリ産ムリエロプシスspの株の増殖挙動を、任意に命名された(MCH35)を海水中で、および任意に命名された(MCHO)を淡水中で評価した。スペイン産ムリエロプシスspの株、(ME35)および(MEO)もまた評価した。培養は、バイオマス濃度の増加に関する挙動を測定する目的で、2つの培地中で実施し、それにより屋外作物において使用されるべき培地を確認することが可能となった。
かくて、20リトルボトルに、淡水および海水と、かつまた以下の2つの培地、F/2およびUMA5とを用いて、チリ産およびスペイン産の株を接種した。培養物を、以下のようにコードした:
培地F/2
MCH35 F/2(海水および培地F/2における、ムリエロプシスspのチリ産株(BEA_IDA_0063B));
MCHO F/2(淡水および培地F/2における、ムリエロプシスspのチリ産株(BEA_IDA_0063B)の培養);
ME35 F/2(海水および培地F/2における、ムリエロプシスspのスペイン産株の培養)
MEO F/2(淡水および培地F/2における、ムリエロプシスspのスペイン産株の培養);および
培地UMA5
MCH35 UMA5(海水およびUMA5培地における、ムリエロプシスspのチリ産株(BEA_IDA_0063B)の培養);
MCHO UMA5(淡水および培地UMA5における、ムリエロプシスspのチリ産株(BEA_IDA_0063B)の培養)
ME35 UMA5(海水およびUMA5培地における、ムリエロプシスspのスペイン産株の培養)
MEO UMA5(淡水および培地UMA5における、ムリエロプシスspのスペイン産株の培養)。
培地F/2
MCH35 F/2(海水および培地F/2における、ムリエロプシスspのチリ産株(BEA_IDA_0063B));
MCHO F/2(淡水および培地F/2における、ムリエロプシスspのチリ産株(BEA_IDA_0063B)の培養);
ME35 F/2(海水および培地F/2における、ムリエロプシスspのスペイン産株の培養)
MEO F/2(淡水および培地F/2における、ムリエロプシスspのスペイン産株の培養);および
培地UMA5
MCH35 UMA5(海水およびUMA5培地における、ムリエロプシスspのチリ産株(BEA_IDA_0063B)の培養);
MCHO UMA5(淡水および培地UMA5における、ムリエロプシスspのチリ産株(BEA_IDA_0063B)の培養)
ME35 UMA5(海水およびUMA5培地における、ムリエロプシスspのスペイン産株の培養)
MEO UMA5(淡水および培地UMA5における、ムリエロプシスspのスペイン産株の培養)。
サンプルは、培養の1、3、6、8、10、13、15、17、および21日に、水路から採取した。最後に、培養物はデカンテーションし、ペレットを各ボトルから収集して、後に遠心分離し、飲用水で2回洗浄し、次いで凍結および凍結乾燥した。
凍結乾燥物について、脂質、タンパク質、ルテイン、カロテノイド、および灰分の近似分析を実施した。
培養は、0.03および0.07g/Lの微細藻類を用いて開始した(図1および2)。培養の21日では、最良の結果は、MCH35(BEA_IDA_0063B)UMA5(0.41g/Lであった)およびMCHO(BEA_IDA_0063B)UMA5(0.42g/Lであった)とラベルされた培養物の微細藻類バイオマスの世代において得られた。培養物MCH35(BEA_IDA_0063B)F/2、MEO F/2、MEO UMA5、MCHO(BEAJDA 0063B)F/2の間では、何ら差異は確認されず、全てのこれらの場合に得られた結果は、0.31g/Lであった。
実施例2:チリ産の微細藻類株およびスペイン産の微細藻類株の屋外培養。海水中での屋外培養を評価するべく、ME35 UMA5およびMCH35 UMA5を選択した。培養は以下の結果を示した:0.26g/Lおよび0.41g/L(図1)。F/2を加えた海水中の結果(0.20g/Lおよび0.31g/L(図2)と対比して、前のものは良好ではあるが、培地とその他との間で、値の増加が有意であるようには見えない。
別の評価は、同じ株および条件を用いて実施されたが、しかし今回は、前の評価におけるよりも高くなるべき初回接種濃度であって、かつそれ故に、大量生産および生産性最適化に適した最小限の濃度である0.5g/Lより高い微細藻類増殖を確保するための、該初回接種濃度を評価する。
図4は、日がたつにつれて減少するリンの消費を示しており、これは微細藻類培養においては正常である。図3は、微細藻類バイオマス中に存在する生化学化合物のパーセントを示す。培養の23日後、灰分のパーセント値は、灰分のパーセント値が灰分11.64%であるME35 F/2を除き、全ては類似し、かつ2.82%から6.72%の範囲内で異なっている。
タンパク質のパーセントは、12.91%から44.13%までの変異を示し、UMA5およびF/2培地の双方を用いて海水中で増殖されたスペイン産株の場合の30%よりも高く、かつ同様の手段を用いた淡水中での作物の場合の40%よりも高い。双方の培地および淡水および海水中で培養されたチリ産株は、13%の平均タンパク質値を示した。
脂質のパーセントは、14.09%から53.67%の変異を示し、F/2を用いて培養された淡水および海水におけるスペイン産株が、UMA5中の淡水中のスペイン産株のように40%より高い脂質含量をもつことがわかる。残りの培養物は、15%の平均脂質パーセントを有する。
ルテインのパーセントは、0.15%から0.67%の範囲内である。4つの収穫物は、0.55%よりも高い値を示した。培地F/2およびUMA5において海水中で増殖されたチリ産株と、UMA5を用いた淡水中およびUMA5を用いた海水中で増殖されたスペイン産株とである(図4)。0.55%ルテインというこの基準値は、この化合物の最高のパーセントがその株から得られた、セネスデムス・アルメリエンシス(Scenesdemus almeriensis)から得られる。現在ルテインが抽出される供給源は、タゲテス・エレクタ(チャイニーズカーネーションまたはマリーゴールド)の花であり、その0.03%が得られる(Sanchezら、2008年)。このように、ムリエロプシスspの海水中での培養物がルテインの生産を可能にすることが確認される。
実施例3:UMA5培地において海水および淡水を用いた初回接種濃度の評価
チリ産株ムリエロプシスspの海水中(MCH35(BEA_IDA_0063B))および淡水中(MCHO(BEA_IDA_0063B))における初回接種濃度。スペイン産ムリエロプシスspの株もまた評価された。海水中(ME35)および淡水中(MEO)のスペイン産株。研究は、既知の濃度の培養物(MCH35(BEA_IDA_0063B)、MCHO(BEA_IDA_0063B)、ME35、およびMEO)から実施した。これらを、1リットルバルーンへ、以下の体積:167mL、333mL、および500mLで添加し、次に海水および淡水をそれぞれ用いて950mLとして、以下の作物を定義した:接種濃度0.2g/Lの、MCH35(BEA_IDA_0063B)、MCHO(BEA_IDA_0063B)、ME35、およびMEO(0.2g/L);、接種濃度0.3g/Lの、MCH35(BEA_IDA_0063B)、MCHO(BEA_IDA_0063B)、ME35、およびMEO(0.3g/L);接種濃度0.4g/Lの、MCH35(BEA_IDA_0063B)、MCHO(BEA_IDA_0063B)、ME35、およびMEO(0.4g/L)。これらの培養にはUMA5培地を使用した。
チリ産株ムリエロプシスspの海水中(MCH35(BEA_IDA_0063B))および淡水中(MCHO(BEA_IDA_0063B))における初回接種濃度。スペイン産ムリエロプシスspの株もまた評価された。海水中(ME35)および淡水中(MEO)のスペイン産株。研究は、既知の濃度の培養物(MCH35(BEA_IDA_0063B)、MCHO(BEA_IDA_0063B)、ME35、およびMEO)から実施した。これらを、1リットルバルーンへ、以下の体積:167mL、333mL、および500mLで添加し、次に海水および淡水をそれぞれ用いて950mLとして、以下の作物を定義した:接種濃度0.2g/Lの、MCH35(BEA_IDA_0063B)、MCHO(BEA_IDA_0063B)、ME35、およびMEO(0.2g/L);、接種濃度0.3g/Lの、MCH35(BEA_IDA_0063B)、MCHO(BEA_IDA_0063B)、ME35、およびMEO(0.3g/L);接種濃度0.4g/Lの、MCH35(BEA_IDA_0063B)、MCHO(BEA_IDA_0063B)、ME35、およびMEO(0.4g/L)。これらの培養にはUMA5培地を使用した。
各バルーンの100mLを採取して、乾燥重量分析と、硝酸塩およびリン酸塩の測定とを実施し、バルーンに850mLを残し、そして蒸発水をオートクレーブされた飲用水で自動的に置き換えた。培養の3、6、および13日に、50mLを採取して、乾燥重量、硝酸塩、およびリン酸塩の分析を実施した。実験の終わりに、培養物をデカンテーションし、全てのボールのペレットを収集し、各培養物のトリプリケートを合わせて6サンプルとし、これらを飲用水で2回洗浄し、そして遠心分離した。次にペレットを、脂質、タンパク質、ルテイン、カロテノイド、および灰分の近似分析用に凍結および凍結乾燥した。図5は、初回濃度が0.1977g/L;0.3310g/L;0.3910g/Lの株ME35の、0日における平均および標準偏差を示す。株MCH35(BEA_IDA_0063B)は、0日において、0.2143g/L;0.3380g/L;および0.4423g/Lの初回濃度を有する。目標は0.2g/L;0.3g/L、および0.4g/Lにおいて接種することであったが、バルーンはもう少し多いバイオマスが、しかし予想範囲内で接種された。培養の13日に、海水中で増殖されたスペイン産株のムリエロプシスsp培の培養においては、0.2g/Lの初回濃度を用いたバルーンを0.3g/Lおよび0.4g/Lの初回濃度を用いたバルーンに対して比較した場合、有意差が観察された。しかしながら、0.3g/Lと0.4g/Lの初回濃度を用いたバルーンの間では、何ら差異がない。海水中で増殖されたチリ産のムリエロプシスspの株(BEAJDA 0063B)の場合、スペイン産株と同様の傾向が見られ、すなわち、0.2g/Lの初回濃度を用いた培養物と、0.3g/Lおよび0.4g/Lの初回濃度を用いたものとの間には有意差が存在する。しかしながら、0.3g/Lと0.4g/Lの初回濃度を用いた培養物の間では、何ら差異がない。
最高の値は、1.0740g/Lに達するME35(初回濃度0.4g/L)において、および1.1360g/Lに達するMCH35(BEA_IDA_0063B、初回濃度0.3g/L)において見出された。図6は、スペイン産株の生産性に関しては、3つの初回接種濃度に何ら差異がないらしいことを示している。一方、0.3g/Lで接種されたチリ産株(BEAJDA 0063B)については、0.2g/Lの初回濃度に対し15%多い生産性がある。初回接種濃度は、13日では最終産物に比例していない。例えば、0.2g/Lのスペイン産株を接種する場合、培養の13日において1.02g/Lが得られる。一方、0.4g/Lを接種する場合、2.04g/Lは得られず、しかし1.07g/Lが得られる。それ故、スペイン産株については、3つの接種濃度のいずれにおいても使用できる。一方、チリ産株(BEA_IDA_0063B)については、0.2と0.3g/Lの間の接種が使用できる。
2つの株の間では、何ら有意差は観察されず、平均は、スペイン産株の3つの培養物の間では0.052g/Lであり、チリ産株(BEA_IDA_0063B)については0.055g/Lであった。
入手可能な文献の大多数には、微細藻類の近似プロフィールに何らかの変化を誘導するためには、栄養素の剥奪があることから、硝酸塩およびリン酸塩の含量は、初回接種濃度がこれら2つの主要栄養素の消費に影響するかどうかの評価を可能にする。本明細書では、代わりにカロテノイド生成を誘導することが必要である。
したがって、バイオマスの濃度がNおよびPの消費に直接には関係しないことが示される。例えば、図1を見れば、株MCH35(BEA_IDA_0063B、0.3g/L)およびMCH35(BEA_IDA_0063B、0.4g/L)について、培養の13日では、両者はほぼ同じ濃度のバイオマスを有しており(図5参照)、それ故それらのNおよびPの消費は非常に類似しているはずであるが、しかし培養の13日に対しては起こっておらず(図7参照)、株MCH35(BEAJDA 0063B、0.4g/L)におけるより大きいNの消費を裏付けており、そのことは、いかなる理論にも囚われるものではないが、バルーンが光源に対して置かれていた距離に起因するものかもしれない。
図8は、日が経つにつれて減少するリンの消費を示しており、これは微細藻類培養においては正常なことである。
図9は、培養の13日後の微細藻類バイオマス中に存在する生化学化合物のパーセントを示す。灰分については、全てのパーセントは類似しており、8.21%から10.57%の範囲内である。タンパク質のパーセントについては、値は44.74%から51.45%の範囲内である。脂質のパーセントは、9.62%から15.40%の範囲内である。ルテインのパーセントは、0.10%から0.55%の範囲内である。
全ての培養物の近似分析に従えば、それは、2つのタイプの水(淡水および海水)および3つの接種濃度(0.2g/L;0.3g/L、および0.4g/L)における、2つの株についてである。それ故、海水中でのスペイン産株の培養は、タンパク質の生成を可能にするのに対し、淡水中での培養は、脂質の生成を可能にする。その一方で、海水中でのチリ産株(BEAJDA 0063B)を用いた培養は、ルテインの生成を可能にする。
図10は、淡水中での作物における結果を示す。MEO株の平均および標準偏差は、0日において観察され、初回濃度:0.2127g/L;0.2927g/L;および0.3917g/Lである。一方、株MCH0(BEA_IDA_0063B)は、0日では初回濃度:0.2407g/L;0.3573g/Lおよび0.4083g/Lにとどまっていた。目標は0.2g/L;0.3g/L、および0.4g/Lを接種することであり、バルーンはもう少し多いバイオマスが、しかし予想された範囲内で接種された。
培養の13日においては、初回濃度0.2g/Lと0.3g/Lの間、および0.3と0.4g/Lの間で、淡水を用いて培養されたスペイン産ムリエロプシスsp株には、何ら有意差が観察されなかった。しかしながら、0.2g/Lと0.4g/Lの初回濃度を用いたバルーンの間では差異が見られた。淡水を用いて培養されたチリ産ムリエロプシスsp(BEAJDA 0063B)の場合には、初回濃度0.2g/L;0.3g/L、および0.4g/Lの間で、培養物に何ら有意差は観察されなかった。同じ方法で、用いた接種物の濃度に関し、2つの独立した株の間でかなりの差異が観察され、MEO(0.2g/L)において最低の値0.47g/Lが、そしてMCHO培養(BEA_IDA_0063B、0.4g/L)において最高の値1.21g/Lが得られた。
図11は、スペイン産株についての生産性を示しており、3つの初回接種濃度には何ら差異が見られない。同じことがチリ産株についても言え、初回接種物の増減は生産性の増減に影響しない。2つの株間で、顕著な差異が観察される場合、スペイン産株の3つの培養物の間の平均は0.021g/Lであり、チリ産株(BEA_IDA_0063B)については0.062g/Lである。
生成されたバイオマスの濃度は、NおよびPの消費に直接関係づけられる必要がある。図12において、スペイン産株の培養の13日では、微細藻類による窒素消費が示されず、そのことは、培養の13日のスペイン産株が、チリ産株が生成するバイオマスの濃度の半分を示す図6において反映されている。いかなる理論にも囚われるものではないが、このことは栄養素の欠如に起因するのかもしれない。また、図13では、0日において、スペイン産株のリン酸塩がチリ産株に比較して低いことが観察される。全ての作物において、リンの消費は日がたつにつれて減少しており、そのことは微細藻類培養物においては正常である。
図14は、培養13日後の微細藻類バイオマス中に存在する生化学化合物(灰分、脂質、タンパク質、ルテイン)のパーセントを示す。生化学化合物のパーセントは、全て類似している。灰分のパーセントは、7.49%から11.94%の範囲内である。タンパク質のパーセントは、14.45%から14.80%の範囲内である。脂質のパーセントは、15.46%から39.16%の範囲内である。ルテインのパーセントは、0.13%から0.31%の範囲内である。
実施例4:400リットルの海水および淡水の屋外培養系における、スペイン産ムリエロプシスsp株およびチリ産株(BEAJDA 0063B)の評価。
バイオマス生産を、海水中(MCH35)および淡水中(MCH0)のチリ産ムリエロプシスsp(BEA_IDA_0063B)と、海水中(ME35)および淡水中(MEO)のスペイン産ムリエロプシスspとを用いて評価した。このため、チリ産ムリエロプシスsp(BEAJDA 0063B)およびスペイン産株を、400リットルのバッグ内で、半量のUMA5を用いて淡水および海水中で培養した。標識された培養物は、以下の形態に置かれた:MCH35(BEA_IDA_0063B)、MCH0(BEA_IDA_0063B)、ME35、およびMEO。サンプルを24および25日に採取して、屋外(400リットル系)における株の増殖曲線を実施した。乾燥重量測定を実施し、実験の終わりに培養物をデカンテーションし、ペレットを系から収集した。デカントを遠心分離し、飲用水で2回洗浄し、ペレットを凍結および凍結乾燥して、次に続く脂質、タンパク質、ルテイン、カロテノイド、および灰分の近似分析用とした。半量のUMA5を用いた400リットルの系において増殖された、2つの株(チリ産(BEAJDA 0063B)株およびスペイン産株)の増殖曲線が得られた(図14参照)。15日後で初めて培養物は、MEOおよびMCH0(BEA_IDA_0063B)についてそれぞれ0.40および0.29g/Lのバイオマス濃度に達する。これらの値は、低いバイオマス生産の値であるが、しかし、飲料水が海水よりも高価であることを常に考慮すれば、その入手しやすさの故に、微細藻類は海水中で増殖するように増殖される。株が淡水作物に由来しても、それは非常に良好に海水に適応する(図5参照)。これらの作物のその天然の環境(淡水)におけるベースラインを得るべく、増殖曲線が実施され、次にそれらが14m3の開放プールに移行される。
バイオマス生産を、海水中(MCH35)および淡水中(MCH0)のチリ産ムリエロプシスsp(BEA_IDA_0063B)と、海水中(ME35)および淡水中(MEO)のスペイン産ムリエロプシスspとを用いて評価した。このため、チリ産ムリエロプシスsp(BEAJDA 0063B)およびスペイン産株を、400リットルのバッグ内で、半量のUMA5を用いて淡水および海水中で培養した。標識された培養物は、以下の形態に置かれた:MCH35(BEA_IDA_0063B)、MCH0(BEA_IDA_0063B)、ME35、およびMEO。サンプルを24および25日に採取して、屋外(400リットル系)における株の増殖曲線を実施した。乾燥重量測定を実施し、実験の終わりに培養物をデカンテーションし、ペレットを系から収集した。デカントを遠心分離し、飲用水で2回洗浄し、ペレットを凍結および凍結乾燥して、次に続く脂質、タンパク質、ルテイン、カロテノイド、および灰分の近似分析用とした。半量のUMA5を用いた400リットルの系において増殖された、2つの株(チリ産(BEAJDA 0063B)株およびスペイン産株)の増殖曲線が得られた(図14参照)。15日後で初めて培養物は、MEOおよびMCH0(BEA_IDA_0063B)についてそれぞれ0.40および0.29g/Lのバイオマス濃度に達する。これらの値は、低いバイオマス生産の値であるが、しかし、飲料水が海水よりも高価であることを常に考慮すれば、その入手しやすさの故に、微細藻類は海水中で増殖するように増殖される。株が淡水作物に由来しても、それは非常に良好に海水に適応する(図5参照)。これらの作物のその天然の環境(淡水)におけるベースラインを得るべく、増殖曲線が実施され、次にそれらが14m3の開放プールに移行される。
図15には、0.1g/Lの初回接種を用いた培養の24日間の、海水中で増殖された2つの株の増殖曲線が示されている。3日間の潜伏期間が存在し、培養17日には、MCH35(BEA_IDA_0063B)およびME35において、値は0.46g/Lおよび0.32g/Lである。24日には、バッチまたはバッチ式で、MCH35(BEA_IDA_0063B)およびME35について、0.64g/Lおよび0.44g/Lの値が達成される。生産期間において、24日が望ましくない期間であることを考慮して、図16に示されたさらなるバッチまたはバッチが、0.2g/Lの初回接種を用いて実施され、それにより5日間の潜伏期間と、17日の培養によりMCH35(BEA_IDA_0063B)およびME35について0.55g/Lおよび0.52g/Lが達成されたこととが示された。
また本発明者らは、培養の12日において、株MCH35(BEA_IDA_0063B)およびME35が41.5および41.3%以上のバイオマス;それぞれ0.53および0.46g/Lを示したことを指摘するべきである。0.2g/Lの微細藻類を接種した場合、そのことは培養の日数の削減をもたらし、バイオマスの収穫を早く始めることができる。
図18は、培養の13日および14日に得られたバイオマスについて実施された近似分析の値を示しており、これらの日にちが選ばれたのは、バッチまたはバッチ期間が終わり、半連続的な収穫物が開始される平均日数であるからである。次に、これらの日数の培養によるバイオマスの、品質を確認することが必要である。灰分のパーセントは、5.05%から9.62%の間である。タンパク質のパーセントは、双方とも海水中で増殖されたチリ産およびスペイン産の株において9.4%と9.9%の間であり、淡水中で増殖された株におけるタンパク質のパーセントは、20.36%と30.46%の間である。脂質のパーセントは、4つの培養物、海水および淡水中の双方の株、において類似しており、8.42%のパーセントを示す。ルテインのパーセントは、0.53%;0.50%;0.39%;および0.57%である。これは、セネスデムス・アルメリエンシスの0.55%に比較して良好なパーセントのルテインであり、かつタゲテス・エレクタの花の0.03%を充分に上回る。株MCH35(BEA_IDA_0063B)およびMCH0(BEA_IDA_0063B)は、それらの増殖、生産性、およびルテイン生産を調べるべく、開放プールへ接種される(後に本文において示される表3から7の統計分析を参照)。
最後に、図19において、MCH35(BEA_IDA_0063B)UMA5、およびMCH35(BEA_IDA_0063B)F/2における3つの実験のルテインパーセントの要約が示されており、それらは0.67%および0.52%ルテインであり、逆に0.31g/Lおよび0.41g/Lのバイオマスがそれぞれ生産される。前述のものは、1リットルの培養あたりそれぞれ2.07mgおよび2.13mgのルテインが生産されたことを示している。互いを比較して、これらの値には重要な差異がないように見えるが、大規模、例えば15,000リットルの培養では、ほぼ1グラムのルテインの差が生まれることは、商業的に非常に重大である。表1における、400リットル系において増殖された株の場合、ルテイン生産は、バッチ培養またはバッチ別の最後に到達したバイオマス濃度(g/L)とルテインの生産(g/L)とのパーセントで観察される。MCH35(BEAJDA 0063B)は、海水中で培養された場合に最も高いルテイン生産を示すことから選ばれた。それは、5および15立方メートルの系にスケールされた。
表3の分散分析ANOVAによれば、テストFのP値は、0.05よりも小さい0.0132であり、それ故、たんぱく質の平均間には、95%の信頼度レベルで統計的な有意差がある。
表4によれば、海水中で増殖されたチリ産とスペイン産のムリエロプシス(MCH−35(BEAJDA 0063B)−ME35)の間には何ら統計的有意差がなく、また淡水中で増殖されたチリ産とスペイン産のムリエロプシス(MCH−0(BEA_IDA_0063B)−MEO)の間にも差異はないことが観察される。しかし、海水および淡水で増殖された株の間には差異がある。
表5の分散分析ANOVAによれば、F比のP値は、0.05よりも大きい0.5010であり、それ故、脂質含量の点では、作物間には、95.0%信頼度レベルで統計的な有意差はない。
表6の分散分析ANOVAによれば、F比のP値は、0.05よりも大きい0.5472であり、それ故、脂質含量の点では、作物間には、95.0%の信頼度のレベルで統計的な有意差はない。
表7の分散分析ANOVAによれば、F比のP値は、0.05よりも大きい0.3040であり、それ故、脂質含量の点では、作物間には、95.0%の信頼度レベルで統計的な有意差はない。
Claims (9)
- 高いルテイン含量と低い金属含量をもつバイオマスを生産するための、微細藻類ムリエロプシスsp(Muriellopsis属の種)の野外すなわち「屋外」における培養方法であって、スパニッシュ・バンク・オブ・アルジー(Spanish Bank of Algae)の受託番号BEA_IDA_0063Bのムリエロプシスsp株を、海水および、培地UMA5またはF/2において培養すること、そして次に収穫物をデカンテーションしてペレットを収集し、これを任意で遠心分離し、洗浄し、凍結および凍結乾燥することを含む、該方法。
- 前記培養が、UMA5培地を用いて実施される、請求項1に記載の培養方法。
- 前記培養が、F/2培地を用いて実施される、請求項1に記載の培養方法。
- 前記培養が、開放水路型の系において実施される、請求項1に記載の培養方法。
- 前記培養が、開放プールにおいて実施される、請求項1に記載の培養方法。
- 前記洗浄および遠心工程が、飲用水を用いて少なくとも2回実施される、請求項1に記載の培養方法。
- 前記微細藻類の培養が、0.2g/L以上の初回接種濃度を用いて実施される、請求項1に記載の培養方法。
- 前記微細藻類の培養が、0.3g/L以上の初回接種濃度を用いて実施される、請求項4に記載の培養方法。
- 前記微細藻類の培養が、0.4g/L以上の初回接種濃度を用いて実施される、請求項4に記載の培養方法。
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