CN105628672B - 一种通过sers信号快速检测外泌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过SERS信号快速检测外泌体的方法,首先,利用磁性捕获基底和拉曼探针通过免疫反应识别样品中的外泌体,形成磁性捕获基底‑外泌体‑拉曼探针形式的三明治结构;然后,利用外加磁场分离收集产物;最后,利用共聚焦拉曼显微系统分析产物中的SERS信号,SERS信号越强则表明外泌体浓度越高。本发明将SERS技术运用到外泌体检测中,采用SERS技术对样品进行精确的定性以及定量分析,可实现快速高灵敏的外泌体检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过SERS信号快速检测外泌体的方法,属于外泌体检测技术。
背景技术
外泌体(Exosomes)是一种体积较小的细胞外泌囊泡,具有脂质双层膜结构,直径约40-100nm。尽管外泌体早在1983年就被发现,但人们一直认为它只是细胞的废弃物。近几年,人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸,能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。最近的研究发现外泌体在生理学和病理学现象中扮演着重要的角色,如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能,可作为疾病诊断的生物标志物。
外泌体的检测已有多种方法,例如扫描电子显微镜、动态光散射技术、超速离心法等。但这些方法或多或少存在着一些不足,如样品处理复杂、费时、高通量水平低等。
表面增强拉曼散射光谱(surface enhanced Raman scattering,SERS)技术作为一种新兴的生物标记手段,是当前国际上备受瞩目的研究热点。SERS一方面继承了拉曼光谱的诸多优点,如光信号不易漂白、对生物组织损伤小、光谱信息丰富等;另一方面,它弥补了传统拉曼散射信号强度弱、不利于检测的缺点。SERS光谱的“指纹”特性使人们能在复杂的生物环境中跟踪、检测目标分子。此外,SERS效应巨大的增强作用使基于SERS的光谱检测具有超高的灵敏度,甚至可实现单分子水平的分析研究。SERS效应产生在纳米尺度粗糙的金属表面,纳米技术的飞速发展为构筑多功能化的SERS纳米探针提供了丰富的技术途径。这些基于SERS光谱技术的纳米探针在生物成像、核酸或蛋白检测、肿瘤识别、药物输运等诸多生物医学领域展现出了优异的应用前景。
发明内容
发明目的:为了克服现有技术中存在的不足,本发明提供一种通过SERS信号快速检测外泌体的方法,通过拉曼探针和磁性捕获基底以及免疫识别作用,实现对样品中的外泌体进行快速、高灵敏度的定量分析,解决现有技术中样品处理复杂、检测过程费时等问题。
技术方案:为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种通过SERS信号快速检测外泌体的方法,首先,利用磁性捕获基底和拉曼探针通过免疫反应识别样品中的外泌体,形成磁性捕获基底-外泌体-拉曼探针形式的三明治结构;然后,利用外加磁场分离收集产物;最后,利用共聚焦拉曼显微系统分析产物中的SERS信号,SERS信号越强则表明外泌体浓度越高。
具体的,所述磁性捕获基底为核壳结构,包括内核层和外壳层,内核层为四氧化三铁纳米粒子,外壳层为二氧化硅壳层,在二氧化硅壳层外表面修饰氨基,二氧化硅壳层通过氨基连接外泌体特异性抗体A;所述拉曼探针为核壳结构,包括内核层和外壳层,内核层为金/银纳米粒子,外壳层为二氧化硅壳层,在金或银纳米粒子外表面连接有拉曼分子,二氧化硅壳层将拉曼分子和金/银纳米粒子包裹在内,在二氧化硅壳层外表面修饰氨基,二氧化硅壳层通过氨基连接外泌体特异性抗体B。
优选的,所述四氧化三铁纳米粒子采用溶剂热法制备,所述二氧化硅壳层采用改进的法(参见Langmuir 2003,19,6693-6700,A General Method To CoatColloidal Particles with Silica)制备,所述外泌体特异性抗体A是能与外泌体表面的蛋白A’发生免疫识别的特异性抗体。
优选的,所述拉曼分子为含巯基的具有较大拉曼散射截面的有机分子,拉曼分子通过巯基共价地连接到金/银纳米粒子外表面;所述金/银纳米粒子采用柠檬酸钠热还原法制备,所述二氧化硅壳层采用改进的法制备,所述外泌体特异性抗体B是能与外泌体表面的蛋白B’发生免疫识别的特异性抗体。
优选的,所述外泌体特异性抗体A和外泌体特异性抗体B是两种不同的外泌体特异性抗体,通过外泌体特异性抗体A和外泌体特异性抗体B能分别识别外泌体表面同时表达的两种不同蛋白(蛋白A’和蛋白B’)。使用两种外泌体特异性抗体,可避免磁性捕获基底和拉曼探针之间的竞争,从而提高形成三明治结构的效率。
有益效果:本发明提供的通过SERS信号快速检测外泌体的方法,利用拉曼探针能提供SERS信号,同时结合磁性捕获基底的磁性富集作用,实现了灵敏的外泌体定量检测;拉曼探针和磁性捕获基底能与外泌体通过免疫识别作用形成稳定的三明治结构;本发明方法可直接用磁铁从样品(如血液、细胞培养液)中分离“三明治”型产物,并用共聚焦拉曼显微系统检测SERS信号,大大简化了外泌体检测的步骤,同时也提高了检测结果的可靠性。
附图说明
图1为本发明方法的检测示意图;
图2为实施例最终磁性收集产物的SERS光谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明,实施例中涉及的PBS缓冲液为pH=7.4,浓度为10mM。
以5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)为拉曼分子,以人子宫颈癌细胞(HeLa)的外泌体为待测外泌体,利用本发明的方法进行外泌体的检测实验。
步骤一、制备四氧化三铁纳米粒子
采用溶剂热法制备四氧化三铁纳米粒子。在80mL乙二醇中加入2.7g六水合氯化铁(FeCl3·6H2O),1g聚乙二醇(PEG,分子量200)和3.6g醋酸钠,搅拌半小时使之充分混合均匀。随后将该混合溶液装入聚四氟乙烯反应釜中200℃反应8小时。产物用磁性分离并用去离子水反复清洗,即得到三氯化铁纳米粒子。将三氯化铁纳米粒子分散至50mL去离子水中,用氩气驱赶溶液中的氧气后,密封4℃保存待用。
步骤二、四氧化三铁纳米粒子表面包裹二氧化硅
采用改进的法包裹。取400μL步骤一中得到的四氧化三铁纳米粒子溶液,分散至10mL 50mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP,分子量8000)水溶液中,将混合液超声20min后振荡12h,用磁铁收集包裹了PVP的四氧化三铁纳米粒子,并将其分散至10mL含1.25%(质量分数)氨水的酒精中,加入10μL正硅酸四乙酯(TEOS)后振荡10h,使二氧化硅逐渐生长至四氧化三铁纳米粒子表面。用磁铁收集包裹了二氧化硅的四氧化三铁纳米粒子,并用酒精反复清洗,随后将二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子分散至10mL酒精中,加入400μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS),100μL去离子水,振荡12h后将该混合液置于70℃水浴中加热2h。用磁铁收集反应产物即得表面修饰了氨基的二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子,最后将该产物分散至2mL酒精中。
步骤三,在步骤二中得到的二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子表面连接抗体A(rabbit anti-CD63),得到磁性捕获基底。
取100μL步骤二中得到的修饰了氨基的二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子,磁铁分离,弃除上清并将分离产物分散至500μL的去离子水中,加入5μL50%的戊二醛,室温振荡1小时后磁铁分离,水洗2次后将沉淀分离至500μL的去离子水中;加入5μL1mg/mL的rabbit anti-CD63,室温振荡3小时后磁铁分离,并用PBS缓冲液清洗一次,将沉淀分散至500μL的PBS中;再加入50μL1%的BSA反应1小时后磁铁分离,沉淀分散至500μL的PBS中,4℃保存。
步骤四,制备球形金纳米粒子
在200mL去离子水中加入200μL质量分数为10%的HAuCl4溶液,剧烈搅拌并加热至沸腾。随后加入8mL质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液,继续加热搅拌15min。停止加热,搅拌至溶液冷却至室温,即得到酒红色的球形金纳米粒子溶液。
步骤五,制备拉曼探针
取10mL球形金纳米粒子溶液,离心分离至5mL去离子水中,加入到20mL异丙醇中,加入10μL 10mM DTNB,搅拌反应1h。之后加入100μL氨水(25%),5μL TEOS,室温搅拌反应14h后,离心收集产物,并将产物分散至5mL无水乙醇中,即得到二氧化硅包裹的连接了拉曼分子的金纳米粒子。取500μL二氧化硅包裹的连接了拉曼分子的金纳米粒子,加入5μL 50%的戊二醛,室温振荡1小时后离心分离,水洗2次后将沉淀分离至500μL的去离子水中;加入5μL 1mg/mL的rabbit anti-CD81(抗体B),室温振荡3小时后离心分离,并用PBS缓冲液清洗一次,将沉淀分散至500μL的PBS中;再加入50μL1%的BSA反应1小时后离心提纯至500μL的PBS中,4℃保存。
步骤六,外泌体检测实验
HeLa细胞接种于35mm皮氏培养皿中,孵育72h后,收集皮氏培养皿中的细胞培养液(~2.5mL)。取50μL步骤三中得到的磁性捕获基底,50μL步骤五中得到的拉曼探针,混合好后加入到500μL HeLa细胞培养液中。室温振荡4小时,使拉曼探针、磁性捕获基底与培养液中的外泌体充分反应,从而形成磁性捕获基底-外泌体-拉曼探针“三明治”型产物,产物用磁铁收集并分散至50μL去离子水中,使用共聚焦拉曼显微系统检测其SERS信号。
本实施例中,步骤五制备出的报告标签的SERS信号强,益于进行SERS定量分析。图2是步骤六最终磁性收集产物的SERS光谱,可以看出,磁性分离产物中检测到了很强的SERS信号,说明HeLa细胞培养液中存在着大量的外泌体。
本实施例表明,本发明提出的检测方法能通过SERS信号检测细胞外泌体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种通过SERS信号快速检测外泌体的方法,其特征在于:首先,利用磁性捕获基底和拉曼探针通过免疫反应识别样品中的外泌体,形成磁性捕获基底-外泌体-拉曼探针形式的三明治结构;然后,利用外加磁场分离收集产物;最后,利用共聚焦拉曼显微系统分析产物中的SERS信号,SERS信号越强则表明外泌体浓度越高;
所述磁性捕获基底为核壳结构,包括内核层和外壳层,内核层为四氧化三铁纳米粒子,外壳层为二氧化硅壳层,在二氧化硅壳层外表面修饰氨基,二氧化硅壳层通过氨基连接外泌体特异性抗体A;所述拉曼探针为核壳结构,包括内核层和外壳层,内核层为金纳米粒子,外壳层为二氧化硅壳层,在金纳米粒子外表面连接有拉曼分子,二氧化硅壳层将拉曼分子和金纳米粒子包裹在内,在二氧化硅壳层外表面修饰氨基,二氧化硅壳层通过氨基连接外泌体特异性抗体B;
所述四氧化三铁纳米粒子采用溶剂热法制备,所述二氧化硅壳层采用改进的法制备,所述外泌体特异性抗体A是能与外泌体表面的蛋白A’发生免疫识别的特异性抗体;
所述拉曼分子为含巯基的有机分子,拉曼分子通过巯基共价地连接到金纳米粒子外表面;所述金纳米粒子采用柠檬酸钠热还原法制备,所述二氧化硅壳层采用改进的法制备,所述外泌体特异性抗体B是能与外泌体表面的蛋白B’发生免疫识别的特异性抗体;
所述外泌体特异性抗体A和外泌体特异性抗体B是两种不同的外泌体特异性抗体,通过外泌体特异性抗体A和外泌体特异性抗体B能分别识别外泌体表面同时表达的两种不同蛋白;
具体包括如下步骤:
步骤一、采用溶剂热法制备四氧化三铁纳米粒子
在80mL乙二醇中加入2.7g六水合氯化铁、1g聚乙二醇和3.6g醋酸钠,搅拌半小时使之充分混合均匀;随后将该混合溶液装入聚四氟乙烯反应釜中200℃反应8小时,产物用磁性分离并用去离子水反复清洗,即得到三氯化铁纳米粒子;将三氯化铁纳米粒子分散至50mL去离子水中,用氩气驱赶溶液中的氧气后,密封4℃保存待用;
步骤二、采用改进的法包裹在四氧化三铁纳米粒子表面包裹二氧化硅取400μL步骤一中得到的四氧化三铁纳米粒子溶液,分散至10mL 50mg/mL聚乙烯吡咯烷酮水溶液中,将混合液超声20min后振荡12h,用磁铁收集包裹了PVP的四氧化三铁纳米粒子,并将其分散至10mL含1.25%质量分数氨水的酒精中,加入10μL正硅酸四乙酯后振荡10h,使二氧化硅逐渐生长至四氧化三铁纳米粒子表面;用磁铁收集包裹了二氧化硅的四氧化三铁纳米粒子,并用酒精反复清洗,随后将二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子分散至10mL酒精中,加入400μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷和100μL去离子水,振荡12h后将该混合液置于70℃水浴中加热2h;用磁铁收集反应产物即得表面修饰了氨基的二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子,最后将该产物分散至2mL酒精中;
步骤三,在步骤二中得到的二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子表面连接抗体A,得到磁性捕获基底;所述抗体A为rabbit anti-CD63
取100μL步骤二中得到的修饰了氨基的二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子,磁铁分离,弃除上清并将分离产物分散至500μL的去离子水中,加入5μL50%的戊二醛,室温振荡1小时后磁铁分离,水洗2次后将沉淀分离至500μL的去离子水中;加入5μL1mg/mL的rabbitanti-CD63,室温振荡3小时后磁铁分离,并用PBS缓冲液清洗一次,将沉淀分散至500μL的PBS中;再加入50μL1%的BSA反应1小时后磁铁分离,沉淀分散至500μL的PBS中,4℃保存;
步骤四,制备球形金纳米粒子
在200mL去离子水中加入200μL质量分数为10%的HAuCl4溶液,搅拌并加热至沸腾;随后加入8mL质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液,继续加热搅拌15min;停止加热,搅拌至溶液冷却至室温,即得到酒红色的球形金纳米粒子溶液;
步骤五,制备拉曼探针
取10mL球形金纳米粒子溶液,离心分离至5mL去离子水中,加入到20mL异丙醇中,加入10μL 10mM DTNB,搅拌反应1h;之后加入100μL氨水和5μL TEOS,室温搅拌反应14h后,离心收集产物,并将产物分散至5mL无水乙醇中,即得到二氧化硅包裹的连接了拉曼分子的金纳米粒子;取500μL二氧化硅包裹的连接了拉曼分子的金纳米粒子,加入5μL 50%的戊二醛,室温振荡1小时后离心分离,水洗2次后将沉淀分离至500μL的去离子水中;加入5μL 1mg/mL的抗体B,室温振荡3小时后离心分离,并用PBS缓冲液清洗一次,将沉淀分散至500μL的PBS中;再加入50μL1%的BSA反应1小时后离心提纯至500μL的PBS中,4℃保存;所述抗体B为rabbit anti-CD81。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |