CN103275934A - 微量循环肿瘤细胞的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了分离富集全血中循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）的方法，更好地为肿瘤细胞进行后续研究提供基础，涉及生物医学领域。方法包括树状分子与可特异性结合靶细胞的物质（特异性物质）共价偶联、特异性物质修饰的树状分子再包被长链生物素分子、特异性物质和长链生物素共修饰的树状分子捕获全血样品中的CTCs、链霉亲和素修饰的纳米磁珠识别并偶联全血中长链生物素化树状分子、被捕获CTCs的分离及重悬等步骤。重悬液可以直接进行后续分析，与传统的细胞分离方法相比，该方法更适用于在复杂全血样品中对CTCs进行磁分离，缩短了磁分离的时间，提高了全血样品中CTCs分离效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是涉及基于纳米磁珠的循环肿瘤细胞分离方法。
背景技术
循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指进入人体外周血的肿瘤细胞。国外研究发现，肿瘤患者的外周血中CTCs的出现往往早于可见的实体瘤。因此，CTCs的检测已被广泛应用于肿瘤患者体外早期诊断。然而，肿瘤患者早期外周血中 CTCs数量十分稀少，现有方法还无法对外周血中痕量 CTCs 直接检测。因此，实现人体外周血中CTCs 的高效富集，使之达到检测方法灵敏度要求，不仅对肿瘤的早期发现，还对肿瘤患者化疗药物的快速评估、个体化治疗（临床筛药、耐药性的检测）、肿瘤复发的监测以及肿瘤新药的开发具有重要指导意义。
免疫磁分离技术是循环肿瘤细胞快速分离富集技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩全血样品中肿瘤细胞，提高肿瘤细胞检测灵敏度。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法（IMS）将特异性物质连接到磁珠上，然后将连有特异性物质的磁珠投入样品液中对目标细胞进行捕获、富集，磁分离（具体原理见图2A）。然而，目前该基于微米级免疫磁珠的分离技术存在诸多局限性：1）微米磁珠的比表面积相对较小，降低了磁珠捕获效率；2）由于微米磁珠自身的颗粒性质，其与细胞之间通过多相反应（multiphase reaction）结合，通常需要更长的时间去特异性捕获全血基质中的细胞；3）微米磁珠单分散性较差，在全血基质中容易发生自身聚集或形成沉淀；4）传统的免疫磁分离技术，往往是将特异性物质直接偶联于免疫磁珠上，此过程常常会导致特异性物质的活性大大地降低，并且导致特异性物质的空间方向发生改变，从而增大特异性物质间的空间位阻效应，降低特异性物质的捕获效率；5）血液粘稠度高并且其中非 CTCs的血细胞浓度大，微米磁珠容易产生非特异性吸附，难以实现对血液中CTCs的特异性分离；6）微米磁珠的浓度过高会造成CTCs的破损（磁场导致细胞表面磁珠互相吸引，使细胞受到挤压甚至破裂），导致分离的失败；（7）磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种捕获效率高、简便分离时间短，低梯度磁场下（小于30 T/m）复杂的全血基质中CTCs特异性快速分离的方法。
微量循环肿瘤细胞的分离方法，包括以下步骤：氨基化树状分子与循环肿瘤细胞相应的特异性物质偶联，摩尔投料比为1:1，形成树状分子-特异性物质复合物；
（1）将树状分子-特异性物质复合物与长链生物素偶联，加入过量长链生物素以封闭树状分子上裸露的氨基位点，形成长链生物素-树状分子-特异性物质复合物;
（2）将上述长链生物素-树状分子-特异性物质复合物溶液加入到全血样品溶液中，以捕获全血样品溶液中的CTCs，形成长链生物素-树状分子-特异性物质-CTCs复合物；
（3）将修饰有链霉亲和素的纳米磁珠加入到上述混合溶液中通过链霉亲和素与长链生物素的亲和作用捕获长链生物素-树状分子-特异性物质-CTCs复合物，以形成终复合物纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树状分子-特异性物质-CTCs；
（4）将终复合物溶液磁力分离，去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液重悬即得富集有CTCs的磁珠。
所述树状分子为氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM-G4，其分子量为14215 Da。结构如图1。
步骤（1）中树状分子通过氨基和特异性物质的羧基实现树状分子和特异性物质的共价偶联。
步骤（2）中树状分子通过氨基和长链生物素分子的羧基，实现树状分子和长链生物素的共价偶联；加入过量长链生物素以保证封闭树状分子上裸露的氨基位点。
所述修饰了链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20-50 nm，优选为30 nm。
步骤（1）所述的制备摩尔投料比为1:1的树状分子-特异性物质复合物，按照如下步骤制备:取10.5 mg氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子 PAMAM G4溶解于2 mL 0.02 M，pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺NHSS，0.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取与上述加入的PAMAM G4摩尔投料比为1:1的特异性物质，加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
步骤（2）所述的长链生物素-树状分子-特异性物质复合物按照如下步骤制备：每取22.5 mg长链生物素，5.4 mg NHSS，3.6 mg EDC溶解于3 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；将8.0 mg树状分子-特异性物质复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
步骤（3）、（4）具体包括如下步骤：
取1 mL人新鲜全血，加入0.2 mg特异性物质和长链生物素共修饰的树状分子，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.2 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠加入到上述溶液中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，常规磁力架分离3 min；磁力分离后，去离子水轻轻清洗，用PBS缓冲液重悬即得富集有CTCs的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树状分子-特异性物质-CTCs复合物。
所述循环肿瘤细胞相应的特异性物质包括：抗HER2抗体对应乳腺癌SK-BR-3细胞、抗上皮细胞粘附因子EpCAM抗体对应乳腺癌MCF-7细胞、叶酸对应子宫颈癌HeLa细胞、转铁蛋白Tf对应转铁蛋白受体阳性TfR+癌HCT116 细胞、表皮生长因子对应鳞状细胞癌Tu212细胞。
具体原理见图2B。
本方法特别适用于复杂样品的分离，如全血样品等。样品处理按照常规处理方法即可。
采用本发明技术方案具有如下有益效果：
1、本发明借助了树状分子的级联放大效应，将磁细胞信号成指数级扩大，在较低的磁场强度下就能实现磁细胞的分离，且在相同的时间内，较常规免疫磁珠分离方法相比，分离到目的细胞能力更强，特别适用于复杂样品的分离，如全血样品等。针对单纯采用抗体修饰后的20-50 nm免疫磁珠分离复杂基质样品中的目的细胞速度慢、磁场要求高的缺陷，采用树状大分子实现纳米磁珠磁信号的放大，从而提高了复杂基质样品中目的细胞分离效率，实现了在低梯度磁场下（小于30 T/m）复杂的食品基质中目的细胞特异性快速分离。
2、本方案为将特异性物质分子偶联于树状分子上，避免了常规方法中将特异性物质分子偶联于磁珠表面导致特异性物质活性降低和空间位阻大的缺点。
3、本发明采用树状分子，可以使反应溶液更加稳定，不易发生沉淀，增加了特异性物质与目标细胞接触的机会，有利于提高捕获效率；同时，树状分子上连有大量的长链生物素分子，可以结合链霉亲和素修饰的纳米磁珠，从而使树状分子上结合大量的纳米磁珠，实现了磁细胞信号的级联放大，有利于缩短磁细胞的分离时间。
4、以纳米磁珠（20-50 nm）代替微米级磁性微粒后，由于纳米磁珠粒径小，比表面积大，与细胞表面抗原结合的位阻小，细胞表面磁珠的覆盖效率显著提高，且磁性纳米粒子覆盖的细胞可以保持正常的形状，纳米磁珠在复杂基质中也有较好的分散性和稳定性，因此纳米磁珠的使用可以克服上述种种由于使用微米磁珠造成的缺陷。
5、本发明在分离过程中，引入了树状高聚物分子，树状分子上连有大量的长链生物素分子，可以特异且高亲和性地与分散在基质溶液中偶联有链霉亲和素纳米磁珠识别，从而使树状分子上结合大量的纳米磁珠，大大增加了靶细胞表面结合的磁珠数量，实现了在磁场下快速分离所捕获的靶细胞。与传统的细胞磁分离方法相比，因加入的是在基质中更为稳定的纳米磁珠，该方法更适用于在复杂基质中对细胞进行磁分离，提高了复杂基质样品中目的细胞分离效率。
6、磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。然而在偶联过程中引入树状高分子，其具有一定的空间大小（4-6 nm），从而使抗体分子远离磁珠和磁珠表面，避免了磁珠本身性质及表面对抗体分子的不利影响。同时，引入的树状高分子却不会影响抗体空间构象，从而起到了保护抗体分子生物活性的作用。
附图说明
图1 PAMAM的结构示意图：立体空间结构（A）和平面图（B）；
图2 常规磁分离技术（A）及本发明所涉及的磁分离技术（B）的操作流程图。
具体实施方式
为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
长链生物素为购买于美国Thermo Fisher Scientific 公司羧基化长链生物素（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，分子量556.59）。
修饰有链霉亲和素的纳米磁珠（30 nm）购买于美国Ocean NanoTech 公司。
氨基化的树状分子为氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM-G4，其分子量为14215 Da，购自于威海晨源化工新材料有限公司。
常规磁力架分离磁场强度小于30 T/m。
N-羟基丁二酰亚胺NHSS，乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC等均为常规试剂，不再赘述。
0.1%PBST 配制方法： 8.0 g NaCl、0.2 g KCl、0.24 g KH2PO4、1.44 g Na2HPO4溶解于800 mL蒸馏水中，用5 M NaOH调整pH至7.4，再定容至1000 mL即得0.01 M PBS。再以1/1000（V/V）的体积比加入Tween 20，即获得0.1%PBST。
纳米磁珠富集全血中乳腺癌SK-BR-3细胞的研究
实施例1
1.树状分子-抗HER2抗体复合物，按照如下步骤制备:
（1）每取10.5 mg氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子 PAMAM G4溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；
（2）取0.8 mg 抗HER2抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
2.长链生物素-树状分子-抗HER2抗体复合物按照如下步骤制备：
（1）每取22.5 mg 长链生物素，5.4 mg NHSS，3.6 mg EDC溶解于3 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；
（2）将8.0 mg树状分子-抗HER2抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
3.富集捕获：取待测样品溶液1mL，加入0.2 mg 长链生物素-树状分子-抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-树状分子-抗体-SK-BR-3细胞抗原复合物；加入0.2 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架分离3 min；
4.去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有SK-BR-3细胞的复合物即纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-树状分子-抗体-SK-BR-3细胞抗原。
实施例2 富集效果实验
（1）取1 mL浓度为104 细胞/mL的SK-BR-3细胞于1.5 mL无菌离心管中，12000 rpm离心5 min，弃上清，用等体积无菌PBS溶液重悬。
（2）富集捕获：分别设置本发明技术方案组（SK-BR-3细胞抗体和长链生物素共修饰的树状分子组）、SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组、SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组富集靶细胞。
（3）磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有SK-BR-3细胞的免疫磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠复合物。
（4）捕获率计算：将各组富集的靶细胞重悬液进行梯度稀释后，用流式细胞仪（Flow Cytometer）检测数量，通过捕获效率公式计算靶细胞的捕获效率，每次实验重复三次。各组捕获效率的计算公式如下：（被富集吸附的靶细胞总数/所有的细胞总数）× 100%。
所述各组富集捕获靶细胞的方案如下：
a.本发明技术方案组（SK-BR-3细胞抗体和长链生物素共修饰的树状分子组）富集捕获靶细胞方案如实施例1，具体如下：
将0.2 mg SK-BR-3细胞抗体和生物素共修饰的树状分子即生物素-树状分子-抗体复合物加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后加入0.2 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
b. SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组富集捕获靶细胞方案具体如下：
将0.2 mg制备好的SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
所述SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠制备：（1）取10 mg纳米磁珠（30 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入80 μg SK-BR-3细胞特异性抗体，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN3, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。
c. SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组富集捕获靶细胞方案具体如下：
将0.2 mg制备好的SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的微米磁珠加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
所述SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的微米磁珠制备：（1）取10 mg微米磁珠（1150 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入80 μg SK-BR-3细胞特异性抗体，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN3，0.5% BSA，pH 7.4）重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。
各组捕获率如下：
实验结果表明，SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组的捕获效率明显高于纳米磁珠组的捕获效率，这说明对比纳米磁珠组，由于微米磁珠体积大、磁性强，在短时间内就能分离富集较多的靶细胞。但是，本发明技术方案组的捕获效率又远远大于SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组，这表明本发明技术方案借助树状分子可以增加靶细胞表面纳米磁珠覆盖率，从而使磁性大大提高，进而实现了在短时间内（3min）高效分离富集SK-BR-3细胞。
实施例3 富集捕获实验
常规磁力架分离时间为30 min，其余同实施例2.
各组捕获率如下：
| SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的微米磁珠组捕获率 | SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组捕获率 | SK-BR-3细胞抗体和长链生物素共修饰的树状分子组捕获率 |
| 51.2% | 37.9% | 91.2% |
实验结果表明，对比实施例2中分离3 min，当分离时间达到30 min时，三组的捕获效率都得到了提高，特别是SK-BR-3细胞特异性抗体修饰的纳米磁珠组的捕获效率提高最为明显，这表明通过延长时间可以大大地提高纳米磁珠组的捕获效率，但是其还是低于短时间分离（3 min）时SK-BR-3细胞抗体和长链生物素共修饰的树状分子组的捕获效率。这表明本发明技术方案可以在短时间内（3 min）高效分离富集SK-BR-3细胞。
实施例4
待测样品为健康志愿者外周血，加入SK-BR-3细胞调节细胞浓度至104细胞/mL。
将制备好的SK-BR-3细胞抗体和长链生物素共修饰的树状分子（0.2 mg）分别加入到样品溶液中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后添加修饰有链霉亲和素的纳米磁珠（0.2 mg），置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，常规磁力架分离3 min。磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有SK-BR-3细胞的免疫磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠。捕获率如实施例2方法获得，其余同实施例2。实验结果为SK-BR-3细胞的分离效率为89.08%，结果表明，本方案能高效富集分离样品中的SK-BR-3细胞。
纳米磁珠富集全血中鳞状细胞癌Tu212细胞的研究
实施例1
1.树状分子-表皮生长因子复合物，按照如下步骤制备:
（1）取10.5 mg氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子 PAMAM G4溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；
（2）取24.1 mg 表皮生长因子加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
2.长链生物素-树状分子-表皮生长因子复合物按照如下步骤制备：
（1）每取22.5 mg 长链生物素，5.4 mg NHSS，3.6 mg EDC溶解于3 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；
（2）将8.0 mg树状分子-表皮生长因子复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
3.富集捕获：取待测样品溶液1mL，加入0.2 mg 长链生物素-树状分子-表皮生长因子复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-树状分子-表皮生长因子-Tu212细胞表皮生长因子受体复合物；加入0.2 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架分离3 min；
4.去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有Tu212细胞的复合物即纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-树状分子-表皮生长因子-Tu212细胞。
实施例2 富集效果实验
（1）取1 mL浓度为104 细胞/mL的Tu212细胞于1.5 mL无菌离心管中，12000 rpm离心5 min，弃上清，用等体积无菌PBS溶液重悬。
（2）富集捕获：分别设置本发明技术方案组（表皮生长因子和长链生物素共修饰的树状分子组）、表皮生长因子修饰的纳米磁珠组、表皮生长因子修饰的微米磁珠组富集靶细胞。
（3）磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有Tu212细胞的磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬磁珠复合物。
（4）捕获率计算：将各组富集的靶细胞重悬液进行梯度稀释后，用流式细胞仪（Flow Cytometer）检测数量，通过捕获效率公式计算靶细胞的捕获效率，每次实验重复三次。各组捕获效率的计算公式如下：（被富集吸附的靶细胞总数/所有的细胞总数）×100%。
所述各组富集捕获靶细胞的方案如下：
a.本发明技术方案组（表皮生长因子和长链生物素共修饰的树状分子组）富集捕获靶细胞方案如实施例1，具体如下：
将0.2 mg 表皮生长因子和生物素共修饰的树状分子即生物素-树状分子-表皮生长因子复合物加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后加入0.2 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
b. 表皮生长因子修饰的纳米磁珠组富集捕获靶细胞方案具体如下：
将0.2 mg制备好的表皮生长因子修饰的纳米磁珠加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
所述表皮生长因子修饰的纳米磁珠制备：（1）取10 mg纳米磁珠（30 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入10 μg表皮生长因子，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN3, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬磁珠并于4℃冰箱保存备用。
c. 表皮生长因子修饰的微米磁珠组富集捕获靶细胞方案具体如下：
将0.2 mg制备好的表皮生长因子修饰的微米磁珠加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
所述表皮生长因子修饰的微米磁珠制备：（1）取10 mg微米磁珠（1150 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入10 μg表皮生长因子，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN3, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬磁珠并于4℃冰箱保存备用。
各组捕获率如下：
| 表皮生长因子修饰的微米磁珠组捕获率 | 表皮生长因子修饰的纳米磁珠组捕获率 | 表皮生长因子和长链生物素共修饰的树状分子组捕获率 |
| 48.1% | 22.4% | 89.2% |
实验结果表明，表皮生长因子修饰的微米磁珠组的捕获效率明显高于纳米磁珠组的捕获效率，这说明对比纳米磁珠组，由于微米磁珠体积大、磁性强，在短时间内就能分离富集较多的靶细胞。但是，本发明技术方案组的捕获效率又远远大于表皮生长因子修饰的微米磁珠组，这表明本发明技术方案借助树状分子可以增加靶细胞表面纳米磁珠覆盖率，从而使磁性大大提高，进而实现了在短时间内（3 min）高效分离富集Tu212细胞。
实施例3 富集捕获实验
常规磁力架分离时间为30 min，其余同实施例2.
各组捕获率如下：
| 表皮生长因子修饰的微米磁珠组捕获率 | 表皮生长因子修饰的纳米磁珠组捕获率 | 表皮生长因子和长链生物素共修饰的树状分子组捕获率 |
| 50.9% | 36.6% | 90.6% |
实验结果表明，对比实施例2中分离3 min，当分离时间达到30 min时，三组的捕获效率都得到了提高，特别是表皮生长因子修饰的纳米磁珠组的捕获效率提高最为明显，这表明通过延长时间可以大大地提高纳米磁珠组的捕获效率，但是其还是低于短时间分离（3 min）时表皮生长因子和长链生物素共修饰的树状分子组的捕获效率。这表明本发明技术方案可以在短时间内（3 min）高效分离富集Tu212细胞。
实施例4
待测样品为健康志愿者外周血，加入Tu212细胞调节细胞浓度至104细胞/mL。
将制备好的表皮生长因子和长链生物素共修饰的树状分子（0.2 mg）分别加入到样品溶液中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后添加修饰有链霉亲和素的纳米磁珠（0.2 mg），置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，常规磁力架分离3 min。磁分离后将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有Tu212细胞的磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬磁珠。捕获率如实施例2方法获得，其余同实例2。实验结果为Tu212细胞的分离效率为84.15%，结果表明，本方案能高效富集分离样品中的Tu212细胞。
纳米磁珠富集全血中子宫颈癌HeLa细胞的研究
1、树状分子-叶酸复合物，按照如下步骤制备:
（1）取2.5 mg氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子 PAMAM G4溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；
（2）取8.0 mg 叶酸加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
2、长链生物素-树状分子-叶酸复合物按照如下步骤制备：
（1）取22.5 mg 长链生物素，5.4 mg NHSS，3.6 mg EDC溶解于3 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；
（2）将8.0 mg树状分子-叶酸复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
3.富集捕获：取待测样品溶液1mL，加入0.2 mg 长链生物素-树状分子-叶酸复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-树状分子-叶酸-HeLa细胞叶酸受体复合物；加入0.2 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架分离3 min；
4.去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有HeLa细胞的复合物即纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-树状分子-叶酸-HeLa细胞。
实施例2 富集效果实验
（1）取1 mL浓度为104 细胞/mL的HeLa细胞于1.5 mL无菌离心管中，12000 rpm离心5 min，弃上清，用等体积无菌PBS溶液重悬。
（2）富集捕获：分别设置本发明技术方案组（叶酸和长链生物素共修饰的树状分子组）、叶酸修饰的纳米磁珠组、叶酸修饰的微米磁珠组富集靶细胞。
（3）磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有HeLa细胞的磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬磁珠复合物。
（4）捕获率计算：将各组富集的靶细胞重悬液进行梯度稀释后，用流式细胞仪（Flow Cytometer）检测数量，通过捕获效率公式计算靶细胞的捕获效率，每次实验重复三次。各组捕获效率的计算公式如下：（被富集吸附的靶细胞总数/所有的细胞总数）×100%。
所述各组富集捕获靶细胞的方案如下：
a.本发明技术方案组（叶酸和长链生物素共修饰的树状分子组）富集捕获靶细胞方案如实施例1，具体如下：
将0.2 mg 叶酸和生物素共修饰的树状分子即生物素-树状分子-叶酸复合物加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后加入0.2 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
b. 叶酸修饰的纳米磁珠组富集捕获靶细胞方案具体如下：
将0.2 mg制备好的HeLa细胞特异性叶酸修饰的纳米磁珠加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
所述叶酸修饰的纳米磁珠制备：（1）取10 mg纳米磁珠（30 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入5μg 叶酸，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN3, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬磁珠并于4℃冰箱保存备用。
c. 叶酸修饰的微米磁珠组富集捕获靶细胞方案具体如下：
将0.2 mg制备好的叶酸修饰的微米磁珠加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
所述叶酸修饰的微米磁珠制备：（1）取10 mg微米磁珠（1150 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入5 μg 叶酸，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN3, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬磁珠并于4℃冰箱保存备用。
各组捕获率如下：
| 叶酸修饰的微米磁珠组捕获率 | 叶酸修饰的纳米磁珠组捕获率 | 叶酸和长链生物素共修饰的树状分子组捕获率 |
| 46.2% | 20.3% | 87.9% |
实验结果表明，叶酸修饰的微米磁珠组的捕获效率明显高于纳米磁珠组的捕获效率，这说明对比纳米磁珠组，由于微米磁珠体积大、磁性强，在短时间内就能分离富集较多的靶细胞。但是，本发明技术方案组的捕获效率又远远大于叶酸修饰的微米磁珠组，这表明本发明技术方案借助树状分子可以增加靶细胞表面纳米磁珠覆盖率，从而使磁性大大提高，进而实现了在短时间内（3 min）高效分离富集HeLa细胞。
实施例3 富集捕获实验
常规磁力架分离时间为30 min，其余同实施例2。
各组捕获率如下：
| 叶酸修饰的微米磁珠组捕获率 | 叶酸修饰的纳米磁珠组捕获率 | 叶酸和长链生物素共修饰的树状分子组捕获率 |
| 52.6% | 36.8% | 90.7% |
实验结果表明，对比实施例2中分离3 min，当分离时间达到30 min时，三组的捕获效率都得到了提高，特别是叶酸修饰的纳米磁珠组的捕获效率提高最为明显，这表明通过延长时间可以大大地提高纳米磁珠组的捕获效率，但是其还是低于短时间分离（3 min）时叶酸和长链生物素共修饰的树状分子组的捕获效率。这表明本发明技术方案可以在短时间内（3 min）高效分离富集HeLa细胞。
实施例4
待测样品为健康志愿者外周血，加入HeLa细胞调节细胞浓度至104细胞/mL。
将制备好的叶酸和长链生物素共修饰的树状分子（0.2 mg）分别加入到样品溶液中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后添加修饰有链霉亲和素的纳米磁珠（0.2 mg），置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，常规磁力架分离3 min。磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有HeLa细胞的磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬磁珠。捕获率如实施例2方法获得，其余同实施例2。实验结果为HeLa细胞的分离效率为84.47%，结果表明，本方案能高效富集分离样品中的HeLa细胞。
纳米磁珠富集全血中TfR
+
癌HCT116 细胞的研究
1、树状分子-转铁蛋白复合物，按照如下步骤制备:
（1）每取10.5 mg氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子 PAMAM G4溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；
（2）取2 mg 转铁蛋白加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
2、长链生物素-树状分子-转铁蛋白复合物按照如下步骤制备：
（1）取22.5 mg 长链生物素，5.4 mg NHSS，3.6 mg EDC溶解于3 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；
（2）将8.0 mg树状分子-转铁蛋白复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
3.富集捕获：取待测样品溶液1mL，加入0.2 mg 长链生物素-树状分子-转铁蛋白复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-树状分子-转铁蛋白-HCT116细胞转铁蛋白受体复合物；加入0.2 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架分离3 min；
4.去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有HCT116 细胞的复合物即纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-树状分子-转铁蛋白-HCT116 细胞。
实施例2 富集效果实验
（1）取1 mL浓度为104 细胞/mL的HCT116 细胞于1.5 mL无菌离心管中，12000 rpm离心5 min，弃上清，用等体积无菌PBS溶液重悬。
（2）富集捕获：分别设置本发明技术方案组（转铁蛋白和长链生物素共修饰的树状分子组）、转铁蛋白修饰的纳米磁珠组、转铁蛋白修饰的微米磁珠组富集靶细胞。
（3）磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有HCT116 细胞的磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬磁珠复合物。
（4）捕获率计算：将各组富集的靶细胞重悬液进行梯度稀释后，用流式细胞仪（Flow Cytometer）检测数量，通过捕获效率公式计算靶细胞的捕获效率，每次实验重复三次。各组捕获效率的计算公式如下：（被富集吸附的靶细胞总数/所有的细胞总数）×100%。
所述各组富集捕获靶细胞的方案如下：
a.本发明技术方案组（转铁蛋白和长链生物素共修饰的树状分子组）富集捕获靶细胞方案如实施例1，具体如下：
将0.2 mg 转铁蛋白和生物素共修饰的树状分子即生物素-树状分子-转铁蛋白复合物加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后加入0.2 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
b. 转铁蛋白修饰的纳米磁珠组富集捕获靶细胞方案具体如下：
将0.2 mg制备好的HCT116 细胞特异性转铁蛋白修饰的纳米磁珠加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
所述转铁蛋白修饰的纳米磁珠制备：（1）取10 mg纳米磁珠（30 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入1μg 转铁蛋白，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN3, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬磁珠并于4℃冰箱保存备用。
c. 转铁蛋白修饰的微米磁珠组富集捕获靶细胞方案具体如下：
将0.2 mg制备好的转铁蛋白修饰的微米磁珠加入到含靶细胞离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。
所述转铁蛋白修饰的微米磁珠制备：（1）取10 mg微米磁珠（1150 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入1μg转铁蛋白，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN3, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬磁珠并于4℃冰箱保存备用。
各组捕获率如下：
| 转铁蛋白修饰的微米磁珠组捕获率 | 转铁蛋白修饰的纳米磁珠组捕获率 | 转铁蛋白和长链生物素共修饰的树状分子组捕获率 |
| 44.4% | 19.3% | 86.7% |
实验结果表明，转铁蛋白修饰的微米磁珠组的捕获效率明显高于纳米磁珠组的捕获效率，这说明对比纳米磁珠组，由于微米磁珠体积大、磁性强，在短时间内就能分离富集较多的靶细胞。但是，本发明技术方案组的捕获效率又远远大于转铁蛋白修饰的微米磁珠组，这表明本发明技术方案借助树状分子可以增加靶细胞表面纳米磁珠覆盖率，从而使磁性大大提高，进而实现了在短时间内（3 min）高效分离富集HCT116 细胞。
实施例3 富集捕获实验
常规磁力架分离时间为30 min，其余同实施例2.
各组捕获率如下：
| 转铁蛋白修饰的微米磁珠组捕获率 | 转铁蛋白修饰的纳米磁珠组捕获率 | 转铁蛋白和长链生物素共修饰的树状分子组捕获率 |
| 47.9% | 37.4% | 88.1% |
实验结果表明，对比实施例2中分离3 min，当分离时间达到30 min时，三组的捕获效率都得到了提高，特别是转铁蛋白修饰的纳米磁珠组的捕获效率提高最为明显，这表明通过延长时间可以大大地提高纳米磁珠组的捕获效率，但是其还是低于短时间分离（3 min）时转铁蛋白和长链生物素共修饰的树状分子组的捕获效率。这表明本发明技术方案可以在短时间内（3 min）高效分离富集HCT116 细胞。
实施例4
待测样品为健康志愿者外周血，加入HCT116 细胞调节细胞浓度至104细胞/mL。
将制备好的转铁蛋白和长链生物素共修饰的树状分子（0.2 mg）分别加入到样品溶液中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后添加修饰有链霉亲和素的纳米磁珠（0.2 mg），置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，常规磁力架分离3 min。磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有HCT116 细胞的磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬磁珠。捕获率如实施例2方法获得，其余同实施例2。实验结果为HCT116 细胞的分离效率为82.97%，结果表明，本方案能高效富集分离样品中的HCT116 细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.微量循环肿瘤细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)氨基化树状分子与循环肿瘤细胞相应的特异性物质偶联，摩尔投料比为1:1，形成树状分子-特异性物质复合物；
(2)将树状分子-特异性物质复合物与长链生物素偶联，加入过量长链生物素以封闭树状分子上裸露的氨基位点，形成长链生物素-树状分子-特异性物质复合物;
(3)将上述长链生物素-树状分子-特异性物质复合物溶液加入到全血样品溶液中，以捕获全血样品溶液中的CTCs，形成长链生物素-树状分子-特异性物质-CTCs复合物；
(4)将修饰有链霉亲和素的纳米磁珠加入到上述混合溶液中通过链霉亲和素与长链生物素的亲和作用捕获长链生物素-树状分子-特异性物质-CTCs复合物，以形成终复合物纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树状分子-特异性物质-CTCs；
(5)将终复合物溶液置于磁力架上进行分离，去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液重悬即得富集有CTCs的的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树状分子-特异性物质-CTCs复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述树状分子为氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM-G4，其分子量为14215 Da。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中树状分子通过氨基和特异性物质的羧基实现树状分子和特异性物质的共价偶联。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中树状分子通过氨基和长链生物素分子的羧基，实现树状分子和长链生物素的共价偶联；加入过量长链生物素以保证封闭树状分子上裸露的氨基位点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述修饰了链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20-50 nm，优选为30 nm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）所述的制备摩尔投料比为1:1的树状分子-特异性物质复合物，按照如下步骤制备:
（1）每取10.5 mg氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子 PAMAM G4溶解于2 mL 0.02 M，pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺NHSS，0.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；
（2）取与上述加入的PAMAM G4摩尔投料比为1:1的特异性物质，加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所述的长链生物素-树状分子-特异性物质复合物按照如下步骤制备：
（1）每取22.5 mg 长链生物素，5.4 mg NHSS，3.6 mg EDC溶解于3 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；
（2）将8.0 mg树状分子-特异性物质复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）、（4）具体包括如下步骤：
取1 mL人新鲜全血，加入0.2 mg特异性物质和长链生物素共修饰的树状分子，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.2 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠加入到上述溶液中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，常规磁力架分离3 min；磁力分离后，去离子水轻轻清洗，用PBS缓冲液重悬即得富集有CTCs的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树状分子-特异性物质-CTCs复合物。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述循环肿瘤细胞相应的特异性物质包括：抗HER2抗体对应乳腺癌SK-BR-3细胞、抗上皮细胞粘附因子EpCAM抗体对应乳腺癌MCF-7细胞、叶酸对应子宫颈癌HeLa细胞、转铁蛋白Tf对应转铁蛋白受体阳性TfR+癌HCT116 细胞、表皮生长因子对应鳞状细胞癌Tu212细胞。
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