CN103275903B - 一种富集分离单核增生李斯特菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了富集分离单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）的方法，更好地为目的菌进行后续研究提供基础，涉及生物技术领域。方法包括树状分子与抗体共价偶联、抗体修饰的树状分子再包被长链生物素分子、抗体和长链生物素共修饰的树状分子捕获样品液中的目的菌、链霉亲和素修饰的纳米磁珠识别并偶联样品液中的长链生物素化树状分子、被捕获细菌的分离及重悬等步骤；重悬液可以直接进行后续分析，与传统的细菌磁分离方法相比，该方法更适用于在复杂基质中对细菌进行磁分离，提高了样品中目的菌分离效率。

Description

一种富集分离单核增生李斯特菌的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是涉及基于纳米磁珠的食源性致病菌分离方法。

背景技术

食源性致病菌污染是我国食品安全的重大问题之一。据WHO统计，发达国家每年约有三分之一的人感染食源性疾病，全世界每年有220万人因患食源性疾病而丧生。在我国，每年食物中毒例数在20～40万人，除意外事故外，大部分均由食源性致病菌引起。由单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）引起的中毒事件时有发生，发展快速、高效富集分离样品中单核细胞增生李斯特菌的技术极有必要。

免疫磁分离技术是食源性致病菌快速筛查技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩增菌液中目标菌，提高致病菌检测灵敏度。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法（IMS）将目标菌抗体连接到磁珠上，然后将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标菌进行捕获、富集，磁分离（具体原理见图2A）。然而，目前该基于微米级免疫磁珠的分离技术存在诸多局限性：1）微米磁珠的比表面积相对较小，降低了磁珠捕获效率；2）由于微米磁珠自身的颗粒性质，其与细菌细胞之间通过多相反应（multiphase reaction）结合，通常需要更长的时间去特异性捕获食品基质中的细菌细胞；3）微米磁珠单分散性较差，在食品基质液中容易发生自身聚集或形成沉淀；4）传统的免疫磁分离技术，往往是将抗体分子直接偶联于免疫磁珠上，此过程常常会导致抗体的活性大大降低，并且导致抗体的空间方向发生改变，从而增大抗体间的空间位阻效应并降低抗体的捕获效率5）食品基质性质复杂并且其中非目的致病菌的杂菌浓度大，微米磁珠容易产生非特异性吸附，难以实现对食品样液中目的菌的特异性分离；6）微米磁珠的浓度过高会造成细菌细胞的破损（磁场导致细胞表面磁珠互相吸引，使细胞受到挤压甚至破裂），导致分离的失败;（7）磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种捕获效率高、简便分离时间短，低梯度磁场下（小于30 T/m）复杂的食品基质中目的菌单核细胞增生李斯特菌特异性快速分离的方法。包括如下步骤：

一种富集分离单增李斯特菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）每取1.0 mg树状分子溶解于2 mL 0.02 M，pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺NHSS，0.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；加入10.5 mg Lm特异性抗体，室温置于混匀仪上搅拌30 min；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得树状分子-抗体复合物；（2）取15 mg 长链生物素，3.6 mg NHSS，2.4 mg EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；将0.53 mg步骤（1）所得树状分子-抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素-树状分子-抗体复合物；（3）取1mL样品溶液，加入0.1 mg步骤（2）所得 Lm抗体和长链生物素共修饰的树状分子即生物素-树状分子-抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min；常规磁力架分离3 min；（4）去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有单核细胞增生李斯特菌的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树状分子-抗体复合物。

所述树状分子为氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM-G4，其分子量为14215 Da。

所述修饰了链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20-50 nm ，优选为30 nm。

树状分子通过氨基和Lm特异性抗体的羧基实现和抗体的共价偶联。

树状分子通过氨基和长链生物素分子的羧基，实现和长链生物素的共价偶联；加入过量长链生物素以保证封闭上裸露的氨基位点。

具体原理见图2B。

本方法特别适用于复杂样品的分离，如食品样品、全血样品等。食品样品包括各类新鲜或冷冻加工后的食品材质，如新鲜蔬菜、肉类、海鲜类和奶类等产品。样品处理按照常规处理方法即可，如将样品粉碎后制成待测溶液。

采用本发明技术方案具有如下有益效果：

1、本发明借助了的级联放大效应，将磁细菌信号成指数级扩大，在较低的磁场强度下就能实现磁细菌的分离，且在相同的时间内，较常规免疫磁珠分离方法相比，分离到目的菌能力更强，特别适用于复杂样品的分离，如食品样品、全血样品等。针对单纯采用抗体修饰后的20-50 nm免疫磁珠分离复杂基质样品中的目的菌速度慢、磁场要求高的缺陷，采用树状大分子实现纳米磁珠磁信号的放大，从而提高了复杂基质样品中目的菌分离效率，实现了在低梯度磁场下（小于30 T/m）复杂的食品基质中目的菌特异性快速分离。

2、本方案为将抗体分子偶联于树状分子上，避免了常规方法中将抗体分子偶联于磁珠表面导致抗体活性降低和空间位阻大的缺点。

3、本发明采用树状分子，可以使反应溶液更加稳定，不易发生沉淀，增加了抗体分子与目标菌接触的机会，有利于提高捕获效率；同时，树状分子上连有大量的长链生物素分子，可以结合链霉亲和素修饰的纳米磁珠，从而使树状分子上结合大量的纳米磁珠，实现了磁细菌信号的级联放大，有利于缩短磁细菌的分离时间。

4、以纳米磁珠（20-50 nm）代替微米级磁性微粒后，由于纳米磁珠粒径小，比表面积大，与细菌表面抗原结合的位阻小，细菌表面磁珠的覆盖效率显著提高，且磁性纳米粒子覆盖的细菌可以保持正常的形状，纳米磁珠在复杂基质中也有较好的分散性和稳定性，因此纳米磁珠的使用可以克服上述种种由于使用微米磁珠造成的缺陷。

5、本发明在分离过程中，引入了树状高聚物分子，树状分子上连有大量的长链生物素分子，可以特异且高亲和性地与分散在基质溶液中偶联有链霉亲和素纳米磁珠识别，从而使树状分子上结合大量的纳米磁珠，大大增加了靶细菌表面结合的磁珠数量，实现了在磁场下快速分离所捕获的靶细菌。与传统的细菌磁分离方法相比，因加入的是在基质中更为稳定的纳米磁珠，该方法更适用于在复杂基质中对细菌进行磁分离，提高了复杂基质样品中目的菌分离效率。

6、磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。然而本实验方案在偶联过程中引入树状高分子，其具有一定的空间大小（4-6 nm），从而使抗体分子远离磁珠和磁珠表面，避免了磁珠本身性质及表面对抗体分子的不利影响。同时，引入的树状高分子却不会影响抗体空间构象，从而起到了保护抗体分子生物活性的作用。

附图说明

图1 PAMAM的结构示意图：立体空间结构（A）和平面图（B）。

图2 常规磁分离技术（A）及本发明所涉及的磁分离技术（B）的操作流程图。

具体实施方式

为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

长链生物素为购买于美国Thermo Fisher Scientific 公司羧基化长链生物素（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，分子量556.59）。

修饰有链霉亲和素的纳米磁珠（30 nm）购买于美国Ocean NanoTech 公司。

树状分子为氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM-G4，其分子量为14215 Da，购自于威海晨源化工新材料有限公司。

常规磁力架分离磁场强度小于30 T/m。

    N-羟基丁二酰亚胺NHSS, 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC等均为常规试剂，不再赘述。

   0.1%PBST 配制方法：8.0 g NaCl、0.2 g KCl、0.24 g KH₂PO₄、1.44 g Na₂HPO₄溶解于800 mL蒸馏水中，用5 M NaOH调整pH至7.4，再定容至1000 mL即得0.01 M PBS。再以1/1000(V/V)的体积比加入Tween 20，即获得0.1%PBST。

实施例1

1、树状分子-抗体复合物，按照如下步骤制备:

（1）取1.0 mg树状分子溶解于2 mL磷酸盐缓冲液（PBS，0.02mol/L，pH 6.5），加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺NHSS，0.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；

（2）取10.5 mg Lm特异性抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；

（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。

2、长链生物素-树状分子-抗体复合物按照如下步骤制备：

（1）取15 mg长链生物素，3.6 mg NHSS，2.4 mg EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；

（2）将0.53 mg树状分子-抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；

（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。

3.富集捕获：取待测样品溶液1mL，加入0.1 mg长链生物素-树状分子-抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-树状分子-抗体-Lm抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架分离3 min；

4.去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液重悬即得富集有单增李斯特菌Lm的复合物纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-树状分子-抗体-Lm抗原。

实施例2 富集效果实验

（1）取1 mL浓度为10⁴ cfu/mL的Lm于1.5 mL无菌离心管中，12000 rpm离心5 min，弃上清，用等体积无菌PBS溶液重悬。

（2）富集捕获：分别设置本发明技术方案组（Lm抗体和长链生物素共修饰的树状分子组）、Lm特异性抗体修饰的纳米磁珠组、Lm特异性抗体修饰的微米磁珠组富集目的菌。

（3）磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有Lm的免疫磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠复合物。

（4）捕获率计算：将各组富集的目的菌重悬液进行梯度稀释后，用平板对每个梯度计数，通过捕获效率公式计算目标菌的捕获效率，每次实验重复三次。各组捕获效率的计算公式如下：（被富集吸附的菌落总数/所有的细菌总数）×100%。

所述各组富集捕获目的菌的方案如下：

a.本发明技术方案组（Lm抗体和长链生物素共修饰的树状分子组）富集捕获目的菌方案如实施例1，具体如下：

将0.1 mg Lm抗体和生物素共修饰的树状分子即生物素-树状分子-抗体复合物加入到含目标菌离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。

b. Lm特异性抗体修饰的纳米磁珠组富集捕获目的菌方案具体如下：

将0.1 mg制备好的Lm特异性抗体修饰的纳米磁珠加入到含目标菌离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。

所述Lm特异性抗体修饰的纳米磁珠制备：（1）取10 mg纳米磁珠（30 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入80 μg Lm特异性抗体，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN₃, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。

c. Lm特异性抗体修饰的微米磁珠组富集捕获目的菌方案具体如下：

将0.1 mg制备好的Lm特异性抗体修饰的微米磁珠加入到含目标菌离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。

所述Lm特异性抗体修饰的微米磁珠制备：（1）取10 mg微米磁珠（1150 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入80 μg Lm特异性抗体，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN₃, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。

各组捕获率如下：

Lm特异性抗体修饰的微米磁珠组捕获率	Lm特异性抗体修饰的纳米磁珠组捕获率	Lm抗体和长链生物素共修饰的树状分子组捕获率
			57.8%	21.6%	90.5%

实验结果表明，Lm特异性抗体修饰的微米磁珠组的捕获效率明显高于纳米磁珠组的捕获效率，这说明对比纳米磁珠组，由于微米磁珠体积大、磁性强，在短时间内就能分离富集较多的目标菌。但是，本发明技术方案组的捕获效率又远远大于Lm特异性抗体修饰的微米磁珠组，这表明本发明技术方案借助树状分子可以增加目标菌表面纳米磁珠覆盖率，从而使磁性大大提高，进而实现了在短时间内（3 min）高效分离富集单增李斯特菌。

实施例3 富集捕获实验

常规磁力架分离时间为30 min，其余同实施例2.

各组捕获率如下：

Lm特异性抗体修饰的微米磁珠组捕获率	Lm特异性抗体修饰的纳米磁珠组捕获率	Lm抗体和长链生物素共修饰的树状分子组捕获率
			60.1%	40.6%	92.8%

实验结果表明，对比实施例2中分离3 min，当分离时间达到30 min时，三组的捕获效率都得到了提高，特别是Lm特异性抗体修饰的纳米磁珠组的捕获效率提高最为明显，这表明通过延长时间可以大大地提高纳米磁珠组的捕获效率，但是其还是低于短时间分离（3 min）时Lm抗体和长链生物素共修饰的树状分子组的捕获效率。这表明本发明技术方案可以在短时间内（3 min）高效分离富集单增李斯特菌。

   实施例4

将无菌肉类粉碎，按常规方式制成待测样品溶液，加入Lm调节菌落浓度至10⁴ cfu/mL备用。

将制备好的Lm抗体和长链生物素共修饰的树状分子（0.1 mg）分别加入到样品溶液中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后添加修饰有链霉亲和素的纳米磁珠（0.1 mg），置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，常规磁力架分离3 min。磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有Lm的免疫磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠。捕获率如实施例2方法获得，其余同实施例2。结果见表1，表明本方案能高效富集分离样品中的Lm。

实施例5

无菌牛奶为样品待测样品溶液，加入Lm调节菌落浓度至10⁴ cfu/mL。其余同实施例4

实施例6

无菌蔬菜粉碎，按常规方式制成待测样品溶液，加入Lm调节菌落浓度至10⁴ cfu/mL。其余同实施例3。

实施例7

待测样品为无菌全血，加入Lm调节菌落浓度至10⁴ cfu/mL。其余同实施例3。

表1 不同实际样品中Lm分离效果的比较

实际样品	Lm抗体和长链生物素共修饰的树状分子组捕获率
		实施例4肉类	83.2%
实施例5牛奶	84.1%
		实施例6蔬菜	84.7%
实施例7全血	80.2%

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种富集分离单核细胞增生李斯特菌Lm的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）每取1.0 mg树状分子溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺，0.4 mg 1-乙基3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；加入10.5 mg Lm特异性抗体，室温置于混匀仪上搅拌30 min；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得树状分子-抗体复合物；（2）取15 mg 长链生物素，3.6 mg N-羟基丁二酰亚胺，2.4 mg 1-乙基3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；将0.53 mg步骤（1）所得树状分子-抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素-树状分子-抗体复合物；（3）取1mL样品溶液，加入0.1 mg步骤（2）所得 Lm抗体和长链生物素共修饰的树状分子即生物素-树状分子-抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；常规磁力架分离3 min；所述纳米磁珠粒径为20-50 nm；（4）去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液重悬即得富集有单核细胞增生李斯特菌的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树状分子-抗体复合物；

所述树状分子为氨基化的聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM-G4，其分子量为14215 Da。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述纳米磁珠粒径为30 nm。