CN103275904B

CN103275904B - 肺炎链球菌在复杂基质中的分离方法

Info

Publication number: CN103275904B
Application number: CN201310219419.1A
Authority: CN
Inventors: 许恒毅; 魏华; 杨林; 熊勇华; 赖卫华; 徐锋; 邓省亮
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2033-06-05
Also published as: CN103275904A

Abstract

本发明公开了富集分离肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）的方法，为目的菌更好地进行后续研究提供基础，涉及生物技术领域。方法包括树枝状聚合物与抗体共价偶联、长链生物素封闭抗体-树枝状聚合物的裸露氨基、树枝状聚合物偶联的抗体捕获样品液中的目的菌、纳米磁珠偶联的链霉亲和素识别并偶联样品液中的长链生物素化的树枝状聚合物、细菌的磁分离及重悬等步骤。重悬液可以直接进行后续分析，与传统的细菌磁分离方法相比，该方法更适用于在复杂基质中对细菌进行磁分离，提高了样品中目的菌分离效率。

Description

肺炎链球菌在复杂基质中的分离方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是涉及基于纳米磁珠的致病菌分离方法。

背景技术

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）作为临床上重要的致病菌，在自然界中广泛分布，其在健康人群中的携带率为5％～50％之间，且与定植和感染密切相关。SP除了可引起鼻窦炎和中耳炎外，更是引起脑膜炎、大叶性肺炎、败血症等严重疾病的首位病原菌。此外，其还可导致严重的神经毒性，如局灶性神经功能缺损、认知功能障碍和听力丧失等。近年来全球因肺炎链球菌感染死亡达70-100万，其主要发病率集中在老年和儿童群体中，此外，中国是全球范围内肺炎链球菌引起感染病例数最多的国家之一，占全球病例数的12％；也是肺炎链球菌导致5岁以下儿童死亡病例数最多的国家之一。因此，为有效控制肺炎链球菌感染的传播及降低疾病造成的危害，发展快速、高效富集分离痰液和鼻咽分泌物等样品中肺炎链球菌的技术极有必要。

免疫磁分离技术是致病菌快速筛查技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩增菌液中目标菌，缩短检测时间，提高检测灵敏度。传统的免疫磁分离技术主要是基于微米级免疫磁珠的分离技术，将目标菌抗体连接到磁珠上，然后用磁珠捕获样品液中对目标菌（具体原理见图2A）。然而，该分离技术存在诸多局限性：1）微米磁珠的比表面积相对较小，降低了磁珠捕获效率；2）由于微米磁珠自身的颗粒性质，其与细菌细胞之间通过多相反应（multiphase reaction）结合，通常需要更长的时间去特异性捕获痰液等基质中的细菌细胞；3）微米磁珠单分散性较差，在痰液等基质液中容易发生自身聚集或形成沉淀；4）将抗体分子直接偶联于免疫磁珠上，此过程常常会导致抗体的活性大大地降低并且导致抗体的空间方向发生改变增大了抗体间的空间位阻效应，从而降低了抗体的捕获效率5）由于基质性质复杂并且其中非目的致病菌的杂菌浓度大，微米磁珠容易产生非特异性吸附，难以实现对样液中目的菌的特异性分离；6）微米磁珠的浓度过高会造成细菌细胞的破损（磁场导致细胞表面磁珠互相吸引，使细胞受到挤压甚至破裂），导致分离的失败。7）磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种简便、分离时间短、捕获效率高、低梯度磁场下（小于30 T/m）能从复杂的基质中快速、特异性分离目的菌肺炎链球菌的方法。

肺炎链球菌在复杂基质中的分离方法，包括以下步骤：（1）取3.6 mg树枝状聚合物溶解于2 mL 0.02 M，pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺NHSS，0.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；加入10.5 mg SP特异性抗体，室温置于混匀仪上搅拌30 min；真空干燥后，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得树枝状聚合物-抗体复合物；（2）取15 mg 长链生物素，3.6 mg NHSS，2.4 mg EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；加入0.55 mg树枝状聚合物-抗体复合物，室温置于混匀仪上搅拌30 min；真空干燥后，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素-树枝状聚合物-抗体复合物；（3）取1 mL待测样品溶液，加入0.1 mg 的长链生物素-树枝状聚合物-抗体复合物于上述离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；常规磁力架分离3 min；（4）磁分离后，用0.1% PBST洗涤后，用PBS缓冲液重悬即得到富集有SP的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树枝状聚合物-抗体-SP抗原复合物。

所述树枝状聚合物为氨基化的聚酰胺-胺型树枝状聚合物，其分子量为42000 Da。结构如图1。

所述修饰了链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20-50 nm，优选为30 nm。

树枝状聚合物通过氨基和SP特异性抗体的羧基实现树枝状聚合物和抗体的共价偶联。

树枝状聚合物通过氨基和长链生物素分子的羧基，实现树枝状聚合物和长链生物素的共价偶联；从而封闭树枝状聚合物上裸露的氨基位点。

具体原理见图2B。

本方法适用于各种基质中肺炎链球菌的分离，特别适用于复杂基质，如生物样品、全血样品等。生物样品包括各类新鲜或冷冻后的生物材质，如痰液、腹腔积液、关节腔积液和鼻咽分泌物等产品。样品处理按照常规处理方法即可。

采用本发明技术方案具有如下有益效果：

1、本发明借助了树枝状聚合物的级联放大效应，将磁细菌信号成指数级扩大，在较低的磁场强度下就能实现磁细菌的分离，且在相同的时间内，较传统免疫磁珠分离方法相比，分离到目的菌能力更强，特别适用于复杂样品的分离，如生物样品、全血样品等。针对单纯采用抗体修饰后的20-50 nm免疫磁珠分离复杂基质样品中的目的菌速度慢、磁场要求高的缺陷，采用树状大分子实现纳米磁珠磁信号的放大，从而提高了复杂基质样品中目的菌分离效率，实现了在低梯度磁场下（小于30 T/m）复杂的生物基质中目的菌特异性快速分离。

2、本方案为将抗体分子偶联于树枝状聚合物上，避免了常规方法中将抗体分子偶联于磁珠表面导致抗体活性降低和空间位阻大的缺点。

3、本发明采用树枝状聚合物，可以使反应溶液更加稳定，不易发生沉淀，增加了抗体分子与目标菌接触的机会，有利于提高捕获效率；同时，树枝状聚合物上连有大量的长链生物素分子，可以结合链霉亲和素修饰的纳米磁珠，从而使树枝状聚合物上结合大量的纳米磁珠，实现了磁细菌信号的级联放大，有利于缩短磁细菌的分离时间。

4、以纳米磁珠（20-50 nm）代替微米级磁性微粒后，由于纳米磁珠粒径小，比表面积大，与细菌表面抗原结合的位阻小，细菌表面磁珠的覆盖效率显著提高，且磁性纳米粒子覆盖的细菌可以保持正常的形状，纳米磁珠在复杂基质中也有较好的分散性和稳定性，因此纳米磁珠的使用可以克服上述种种由于使用微米磁珠造成的缺陷。

5、本发明在分离过程中，引入了树状高聚物分子，树枝状聚合物上连有大量的长链生物素分子，可以特异且高亲和性地与分散在基质溶液中偶联有链霉亲和素纳米磁珠识别，从而使树枝状聚合物上结合大量的纳米磁珠，大大增加了靶细菌表面结合的磁珠数量，实现了在磁场下快速分离所捕获的靶细菌。与传统的细菌磁分离方法相比，因加入的是在基质中更为稳定的纳米磁珠，该方法更适用于在复杂基质中对细菌进行磁分离，提高了复杂基质样品中目的菌分离效率。

6、磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。然而本实验方案在偶联过程中引入树枝状聚合物，其具有一定的空间大小，从而使抗体分子远离磁珠和磁珠表面，避免了磁珠本身性质及表面对抗体分子的不利影响。同时，引入的树枝状聚合物却不会影响抗体空间构象，从而起到了保护抗体分子生物活性的作用。

附图说明

图1 树枝状聚合物的结构示意图。

图2 常规磁分离技术（A）及本发明所涉及的磁分离技术（B）的操作流程图。

具体实施方式

为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

长链生物素为购买于美国Thermo Fisher Scientific 公司羧基化长链生物素（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，分子量556.59）。

修饰有链霉亲和素的纳米磁珠（30 nm）购买于美国Ocean NanoTech 公司。

树枝状聚合物为氨基化的聚酰胺-胺型树枝状聚合物，其分子量为42000 Da，购自于威海晨源化工新材料有限公司。

常规磁力架分离磁场强度小于30T/m。

N-羟基丁二酰亚胺NHSS, 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC等均为常规试剂，不再赘述。

0.1%PBST 配制方法：8.0 g NaCl、0.2 g KCl、0.24 g KH₂PO₄、1.44 g Na₂HPO₄溶解于800 mL蒸馏水中，用5 M NaOH调整pH至7.4，再定容至1000mL即得0.01 M PBS。再以1/1000(V/V)的体积比加入Tween 20，即获得0.1%PBST。

实施例1

实验一：

1、树枝状聚合物-抗体复合物，按照如下步骤制备:

（1）取3.6 mg树枝状聚合物氨基化的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；

（2）取10.5 mg SP特异性抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；

（3）上述溶液经真空干燥后，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥。

2、长链生物素-树枝状聚合物-抗体复合物按照如下步骤制备：

（1）取15 mg 长链生物素，3.6 mg NHSS，2.4 mg EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；

（2）将0.55 mg树枝状聚合物-抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；

3.富集捕获：取待测样品溶液1 mL，加入0.1 mg 长链生物素-树枝状聚合物-抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-树枝状聚合物-抗体-肺炎链球菌抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架分离3 min；

4.去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有肺炎链球菌肺炎链球菌的复合物纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-树枝状聚合物-抗体-肺炎链球菌抗原。

实施例2 富集效果实验

（1）取1 mL浓度为10⁴cfu/mL的肺炎链球菌于1.5 mL无菌离心管中，12000 rpm离心5 min，弃上清，用等体积无菌PBS溶液重悬。

（2）富集捕获：分别设置本发明技术方案组（肺炎链球菌抗体和长链生物素共修饰的树枝状聚合物组）、肺炎链球菌特异性抗体修饰的纳米磁珠组、肺炎链球菌特异性抗体修饰的微米磁珠组富集目的菌。

（3）磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有肺炎链球菌的免疫磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠复合物。

（4）捕获率计算：将各组富集的目的菌重悬液进行梯度稀释后，用平板对每个梯度计数，通过捕获效率公式计算目标菌的捕获效率，每次实验重复三次。各组捕获效率的计算公式如下：（被富集吸附的菌落总数/所有的细菌总数）×100%。

所述各组富集捕获目的菌的方案如下：

a.本发明技术方案组（肺炎链球菌抗体和长链生物素共修饰的树枝状聚合物组）富集捕获目的菌方案如实施例1，具体如下：

将0.1 mg 肺炎链球菌抗体和生物素共修饰的树枝状聚合物即生物素-树枝状聚合物-抗体复合物加入到含目标菌离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。

b. 肺炎链球菌特异性抗体修饰的纳米磁珠组富集捕获目的菌方案具体如下：

将0.1 mg制备好的肺炎链球菌特异性抗体修饰的纳米磁珠加入到含目标菌离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。

所述肺炎链球菌特异性抗体修饰的纳米磁珠制备：（1）取10 mg纳米磁珠（30 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入80 μg 肺炎链球菌特异性抗体，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN₃, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。

c. 肺炎链球菌特异性抗体修饰的微米磁珠组富集捕获目的菌方案具体如下：

将0.1 mg制备好的肺炎链球菌特异性抗体修饰的微米磁珠加入到含目标菌离心管中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。最后，将离心管插入常规磁力架分离3 min。

所述肺炎链球菌特异性抗体修饰的微米磁珠制备：（1）取10 mg微米磁珠（1150 nm，没有偶联链霉亲和素）依次用无水乙醇，1 M NaOH，1 M HCl各洗涤一次，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗三次，无菌PBS重悬。加入NHSS 0.4 mg，EDC 0.35 mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化2 h。（2）磁力架回收磁珠，PBS（0.02 M，pH 4.0）洗涤三次后，磁珠重悬于无菌PBS中，按每mg磁珠加入80 μg 肺炎链球菌特异性抗体，置于混匀仪上37℃偶联2 h。（3）加入乙醇胺室温封闭2 h。磁架回收磁珠，PBS 洗涤三次，10 ml PBS（含0.05% NaN₃, 0.5% BSA，pH 7.4）重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。

各组捕获率如下：

肺炎链球菌特异性抗体修饰的微米磁珠组捕获率	肺炎链球菌特异性抗体修饰的纳米磁珠组捕获率	肺炎链球菌抗体和长链生物素共修饰的树枝状聚合物组捕获率
			45.1%	20.6%	88.5%

实验结果表明，肺炎链球菌特异性抗体修饰的微米磁珠组的捕获效率明显高于纳米磁珠组的捕获效率，这说明对比纳米磁珠组，由于微米磁珠体积大、磁性强，在短时间内就能分离富集较多的目标菌。但是，本发明技术方案组的捕获效率又远远大于肺炎链球菌特异性抗体修饰的微米磁珠组，这表明本发明技术方案借助树枝状聚合物可以增加目标菌表面纳米磁珠覆盖率，从而使磁性大大提高，进而实现了在短时间内（3min）高效分离富集肺炎链球菌。

实施例3 富集捕获实验

常规磁力架分离时间为30min，其余同实施例2.

各组捕获率如下：

肺炎链球菌特异性抗体修饰的微米磁珠组捕获率	肺炎链球菌特异性抗体修饰的纳米磁珠组捕获率	肺炎链球菌抗体和长链生物素共修饰的树枝状聚合物组捕获率
			46.5%	40.6%	90.9%

实验结果表明，对比实施例2中分离3min，当分离时间达到30min时，三组的捕获效率都得到了提高，特别是肺炎链球菌特异性抗体修饰的纳米磁珠组的捕获效率提高最为明显，这表明通过延长时间可以大大地提高纳米磁珠组的捕获效率，但是其还是低于短时间分离（3min）时肺炎链球菌抗体和长链生物素共修饰的树枝状聚合物组的捕获效率。这表明本发明技术方案可以在短时间内（3min）高效分离富集肺炎链球菌。

实施例4

将无菌痰液常规方式制成待测样品溶液，加入SP调节菌落浓度至10⁴cfu/mL备用。

将制备好的肺炎链球菌抗体和长链生物素共修饰的树状分子（0.1 mg）分别加入到样品溶液中，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min。然后添加修饰有链霉亲和素的纳米磁珠（0.1 mg），置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min。最后，常规磁力架分离3 min。磁分离后，将上清液倒入无菌离心管中，而分离出来捕获有肺炎链球菌的免疫磁珠则用PBST清洗两次，混合均匀，并用1 mL无菌PBS溶液重悬免疫磁珠。捕获率如实施例2方法获得，其余同实施例2。结果见表1，表明本方案能高效富集分离样品中的肺炎链球菌。

实施例5

无菌腹腔积液为样品待测样品溶液，加入SP调节菌落浓度至10⁴cfu/mL。其余同实施例4

实施例6

无菌鼻咽分泌物为待测样品溶液，加入SP调节菌落浓度至10⁴cfu/mL。其余同实施例4。

实施例7

待测样品为无菌全血，加入SP调节菌落浓度至10⁴cfu/mL。其余同实施例4。

表1 不同实际样品中SP分离效果的比较

实际样品	SP抗体和长链生物素共修饰的树枝状聚合物组捕获率
		实施例2痰液	84.2%
实施例3腹腔积液	85.6%
		实施例4鼻咽分泌物	83.3%
实施例5全血	81.4%

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.肺炎链球菌在复杂基质中的分离方法，其特征在于包括以下步骤：（1）取3.6 mg树枝状聚合物溶解于2 mL 0.02 M，pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N-羟基丁二酰亚胺，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；加入10.5 mg 肺炎链球菌特异性抗体，室温置于混匀仪上搅拌30 min；真空干燥后，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得树枝状聚合物-抗体复合物；（2）取15 mg 长链生物素，3.6 mg N-羟基丁二酰亚胺，2.4 mg EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；加入0.55 mg树枝状聚合物-抗体复合物，室温置于混匀仪上搅拌30 min；真空干燥后，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素-树枝状聚合物-抗体复合物；（3）取1 mL待测样品溶液，加入0.1 mg 的长链生物素-树枝状聚合物-抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；常规磁力架分离3 min；所述修饰有链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20-50 nm；（4）磁分离后，用0.1% PBST洗涤后，用PBS缓冲液重悬即得到富集有肺炎链球菌的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-树枝状聚合物-抗体-肺炎链球菌抗原复合物；

所述树枝状聚合物为氨基化的聚酰胺-胺型树枝状聚合物，其分子量为42000 Da。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述修饰了链霉亲和素的纳米磁珠粒径为30 nm。