CN103911345B - 用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，包括磁性微球，磁性微球上偶联有用于特异性识别与捕获循环肿瘤细胞的上皮细胞特异性抗体。所述上皮细胞特异性抗体，根据需要捕获的目标肿瘤细胞而选择，比如需要捕获MCF‑7细胞时，所述上皮细胞特异性抗体选用抗EpCAM抗体。本发明还公开了利用该免疫磁性微球捕获外周血中循环肿瘤细胞的方法。本发明的免疫磁性微球采用上皮细胞特异性抗体修饰，可以实现对目标细胞高选择性和高特异性的捕获。磁性微球可起到尺寸放大作用，用于实现高回收率膜分离，还可用于磁分离操作实现高纯度捕获。本发明的免疫磁性微球及捕获方法，可用于癌症患者的早期诊断及治疗反应的预测。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，及其制备方法与使用方法。
背景技术
循环肿瘤细胞的检测有助于研究肿瘤转移机制、指导肿瘤治疗、评估疗效及预后、监测肿瘤的转移或复发。目前用于循环肿瘤细胞检测的方法很多，主要包括富集分离方法、免疫细胞化学技术、流式细胞技术、逆转录聚合酶链反应及CellSearch检测系统等，其中富集分离方法主要包括密度梯度离心法、膜过滤法、免疫磁珠富集法等。由于外周血中循环肿瘤细胞的数量极其稀少，故捕获效率及纯度一直是限制循环肿瘤细胞研究的重要因素，目前大多数方法无法同时达到高效率及高纯度的捕获与检测。CellSearch系统是目前美国食品和药品管理局(FDA)唯一批准的检测循环肿瘤细胞的方法，虽然能实现快速有效地捕获与检测，但捕获效率有待进一步提高，且价格昂贵。最新研究较多的基于膜或芯片过滤的方法虽然大大提高了捕获效率，但是捕获纯度仍不理想。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，及其制备方法与使用方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，包括磁性微球，磁性微球上偶联有用于特异性识别与捕获循环肿瘤细胞的上皮细胞特异性抗体。
所述磁性微球，是表面带有羧基或氨基的具有超顺磁性的磁性微球，可以是聚苯乙烯，Fe3O4，SiO2，脲醛树脂，γ-Fe2O3等磁性材料（磁性微球通常有三层结构：金属小颗粒层（有磁性），高分子材料层（聚苯乙烯、尿醛树脂、二氧化硅等），功能基层（羧基或氨基等），目前已普遍商品化，能直接购买得到），直径为1～6μm。磁性微球的作用为：既可起到尺寸放大作用，用于实现高回收率膜分离，还可用于磁分离操作，实现高纯度捕获。
所述偶联是指通过共价偶联、疏水作用或者分子间作用力连接在一起。
所述上皮细胞特异性抗体，包括针对循环肿瘤细胞表面特异性抗原的所有抗体种类，可以是多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体，以及核酸适配体。
所述上皮细胞特异性抗体，根据需要捕获的目标肿瘤细胞而选择，比如：需要捕获MCF-7细胞时，选用抗EpCAM抗体。
所述用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球的制备方法，所用磁性微球为羧基磁性微球时，方法为：
（1）羧基磁性微球的活化：取200μL羧基磁性微球，加入250μL的EDC/NHS溶液（EDC:1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，纯度99%；NHS:N-羟基丁二酰亚胺；二者均为现有技术中已有的常规试剂）（EDC/NHS溶液中，EDC、NHS的浓度均为3.2×103μg/mL），室温下活化30min，磁分离，PBS缓冲液洗涤磁性微球，得活化后的磁性微球；
（2）羧基磁性微球与抗EpCAM抗体偶联：向上述活化后的磁性微球中加入上皮细胞特异性抗体（比如50～400μL10μg·mL-1抗EpCAM抗体），室温反应6h，磁分离，PBS缓冲液洗涤，得免疫磁性微球，加1mLPBS缓冲液于4℃保存，备用。
所用磁性微球为氨基磁性微球时，方法为：取200μL氨基磁性微球，加入上皮细胞特异性抗体（比如50～400μL10μg·mL-1抗EpCAM抗体），以及250μL的EDC/NHS溶液，室温反应3h，磁分离，PBS缓冲液洗涤，得免疫磁性微球，加1mLPBS缓冲液于4℃保存，备用。
利用上述免疫磁性微球捕获外周血中循环肿瘤细胞的方法（即用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球的使用方法）：
（一）免疫磁性微球孵育细胞：
取培养的MCF-7细胞或待测人血液样品1mL，加入25～100μL免疫磁性微球，室温静置孵育1h；
（二）过滤：
（1）PDMS片的合成及制作（为常规方法）：
①取50g：5g双组分有机硅弹性体于一次性水杯中混匀搅拌；
②置于真空装置中进行抽真空，待气泡上升接近纸杯顶端时关掉真空泵，调节使其处于并保持真空状态静止一段时间直至杯内气泡消失液面变澄清；
③待气泡逐渐消失液面变澄清后，放气，取出混合物，加入到事先准备好的容器中使其定形；
④将加有有机硅弹性体的容器置于烘箱中，80℃固定50min，固定后得PDMS片；
⑤用打孔器对合成的PDMS片打孔，孔径为1.9×2.4（mm×mm）；
（2）聚碳酸酯膜（5～10μm）过滤分离白细胞及其它血细胞：
①将聚碳酸酯膜置于两片打孔的PDMS片之间，并使上下两孔之间对齐使之形成真空状态；
②注射器吸取孵育后的溶液，PBS溶液进行清洗孵育所用的容器，目的为：防止细胞残留，一并吸入注射器；
③将上述含有样品的注射器置于夹有聚碳酸酯膜的PDMS片上，使注射器头部与PDMS片上端的小孔对齐，PDMS片下端小孔与抽滤装置连通，打开抽滤装置开关，将注射器中的溶液抽滤到废液瓶，而吸附有循环肿瘤细胞的免疫磁性微球则被截留于滤膜（即聚碳酸酯膜）上；
（三）磁分离：
上述抽滤完成后，取下滤膜，置于磁分离架上磁分离以进一步去除白细胞，PBS溶液洗涤，得去除白细胞及其他血细胞偶联免疫磁性微球的循环肿瘤细胞（磁分离后，循环肿瘤细胞与免疫磁性微球偶联在一起，留在滤膜上），可进行各项检测，比如：将上述经过磁分离后的聚碳酸酯膜置于显微镜下观察，当细胞数较少时，直接进行计数。
为配合上述捕获外周血中循环肿瘤细胞的方法，本发明还提供了一套与免疫磁性微球配套使用的装置，主要包括过滤装置（包括样品管、打孔的韧性材料、滤膜、抽滤装置），磁分离装置（磁分离架），检测装置（光学显微镜），均为现有技术中已有的常规实验仪器或材料。
本发明的免疫磁性微球采用上皮细胞特异性抗体修饰磁性微球，可以实现对目标细胞高选择性和高特异性的捕获。磁性微球既可起到尺寸放大作用，用于实现高回收率膜分离，还可用于磁分离操作实现高纯度捕获。与此免疫磁性微球配套的装置主要包括过滤装置、磁分离装置及检测装置；使用方法包括联合采用膜过滤和磁分离实现高效高纯度细胞捕获，采用直接显微镜计数实现快速检测。本发明所述捕获及快速检测方法，无需复杂修饰及细胞鉴别过程，成本低廉且高效快速，操作简单，可用于癌症患者的早期诊断及治疗反应的预测。
附图说明
图1：两种方法对MCF-7捕获纯度的比较，其中，a.只经过膜过滤；b.经过膜过滤联合磁分离。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1免疫磁性微球的合成
本实施例所用磁性微球为羧基磁性微球，粒径3～4μm,5mg/ml，表面羧基含量100nmol/g，购自天津市倍思乐色谱技术开发中心。
步骤如下：
（1）羧基磁性微球的活化：取200μL羧基磁性微球，超声30s，磁分离，去离子水洗涤一次；加入250μL的EDC/NHS溶液（EDC/NHS溶液中，EDC、NHS的浓度均为3.2×103μg/mL），室温下活化30min，磁分离，PBS缓冲液洗涤，反复5遍，得活化后的磁性微球；
（2）羧基磁性微球与抗EpCAM抗体偶联：向上述活化后的磁性微球中加入150μL10μg·mL-1抗EpCAM抗体，室温反应6h，磁分离，PBS缓冲液洗涤，反复5遍，得免疫磁性微球，加1mLPBS缓冲液于4℃保存，备用。
实施例2免疫磁性微球的使用方法
步骤如下：
（一）免疫磁性微球孵育细胞：取培养的MCF-7细胞1mL，加入50μL免疫磁性微球（实施例1制备），室温静置孵育1h。
（二）过滤
（1）PDMS片的合成及制作：
①取50g：5g双组分有机硅弹性体（硅橡胶，基本组分：固化剂=10：1）于一次性水杯中混匀搅拌10min；
②置于真空装置中进行抽真空，待气泡距纸杯顶端约5mm时关掉真空泵，调节使其处于并保持真空状态静止约30-40min直至杯内气泡消失液面变澄清；
③待气泡逐渐消失液面变澄清后，放气，取出混合物，加入到事先准备好的容器中使其定形；
④将加有有机硅弹性体的容器置于烘箱中，80℃固定50min；
⑤用打孔器对合成的PDMS片打孔，孔径为1.9×2.4（mm×mm）；
（2）聚碳酸酯膜（8μm）过滤分离白细胞及其它血细胞
①将聚碳酸酯膜置于两片打孔的PDMS片之间，并使上下两孔之间对齐使之形成真空状态。
②注射器吸取孵育后的溶液，PBS溶液进行清洗，一并吸入注射器。
③将含有样品的注射器置于夹有聚碳酸酯膜的PDMS片上，使注射器头部与PDMS片上端的小孔对齐，PDMS片下端小孔与抽滤装置连通。打开抽滤装置开关，将注射器中的溶液抽滤到废液瓶，循环肿瘤细胞被截留于滤膜上。
（三）磁分离：孵育后的样品经过滤后取下滤膜，置于磁分离架上磁分离以进一步去除白细胞，PBS溶液洗涤，反复5次，得去除白细胞及其他血细胞的偶联免疫磁性微球的循环肿瘤细胞，待进行检测。
（四）偶联免疫磁性微球的循环肿瘤细胞的检测：将上述经过磁分离前、后的聚碳酸酯膜置于显微镜下观察（结果如图1a、b所示），当细胞数较少时，直接进行计数。
表1.人血液中MCF-7细胞添加回收率试验
由图1可见，只用膜过滤未经磁分离的细胞中白细胞数量很多，而经过磁分离后捕获的细胞中白细胞数量极少，捕获纯度得到了很大提高。由表1可见，膜过滤联合磁分离方法的回收率远高于只用磁分离的方法（是指孵育完成后，不经膜过滤直接进行磁分离后进行观察）。本方法总分析时间在2小时以内。因此，这种高效、高纯度、快速捕获的方法有望用于临床血液中循环肿瘤细胞的捕获检测，从而有助于癌症的早期诊断及预后评价。
Claims (7)
1.利用用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球捕获外周血中循环肿瘤细胞的方法，所述方法用于非治疗和非诊断的目的，所述用于外周血中循环肿瘤细胞捕获的免疫磁性微球，包括磁性微球，磁性微球上偶联有用于特异性识别与捕获循环肿瘤细胞的上皮细胞特异性抗体，其特征在于：步骤如下：
(一)免疫磁性微球孵育细胞：
取培养的MCF-7细胞或待测人血液样品1mL，加入25～100μL免疫磁性微球，室温静置孵育1h；
(二)过滤：
(1)PDMS片的合成及制作：
①取50g：5g双组分有机硅弹性体于一次性水杯中混匀搅拌；
②置于真空装置中进行抽真空，待气泡上升接近纸杯顶端时关掉真空泵，调节使其处于并保持真空状态静止一段时间直至杯内气泡消失液面变澄清；
③待气泡逐渐消失液面变澄清后，放气，取出混合物，加入到事先准备好的容器中使其定形；
④将加有有机硅弹性体的容器置于烘箱中，80℃固定50min，固定后得PDMS片；
⑤用打孔器对合成的PDMS片打孔，孔径为1.9mm×2.4mm；
(2)聚碳酸酯膜过滤分离白细胞及其它血细胞：
①将聚碳酸酯膜置于两片打孔的PDMS片之间，并使上下两孔之间对齐使之形成真空状态；
②注射器吸取孵育后的溶液，PBS溶液进行清洗孵育所用的容器，一并吸入注射器；
③将上述含有样品的注射器置于夹有聚碳酸酯膜的PDMS片上，使注射器头部与PDMS片上端的小孔对齐，PDMS片下端小孔与抽滤装置连通，打开抽滤装置开关，将注射器中的溶液抽滤到废液瓶，而吸附有循环肿瘤细胞的免疫磁性微球则被截留于滤膜上；
(三)磁分离：
上述抽滤完成后，取下滤膜，置于磁分离架上磁分离以进一步去除白细胞，PBS溶液洗涤，得去除白细胞及其他血细胞的偶联免疫磁性微球的循环肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磁性微球，是表面带有羧基或氨基的具有超顺磁性的磁性微球，直径为1～6μm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述磁性微球为羧基磁性微球，粒径3～4μm,5mg/ml，表面羧基含量100nmol/g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述偶联是指通过共价偶联、疏水作用或者分子间作用力连接在一起。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述上皮细胞特异性抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体，或核酸适配体。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述上皮细胞特异性抗体，根据需要捕获的目标肿瘤细胞而选择。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于：需要捕获MCF-7细胞时，所述上皮细胞特异性抗体选用抗EpCAM抗体。
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