CN107015006A - 一种细胞因子免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种细胞因子免疫层析试纸，在样品区检测液添加在样品垫上；在结合区结合垫表面涂布纳米颗粒与目标细胞因子单克隆抗体的偶联物，检测液中的目标细胞因子与所述单克隆抗体特异性结合；在检测区当检测液中的目标细胞因子与多克隆抗体结合后，检测线处显色，目标细胞因子被检出；当检测液中偶联物的单克隆抗体与二抗抗体结合，质控线处显色，效验检测过程是否有效。本发明可以完成液体中目标细胞因子的检测，超顺磁纳米颗粒与目标蛋白的单抗偶联，对目标细胞因子进行检测，高效、精准、测试时间短，适合多种细胞因子的检测，灵敏度优于传统试纸条检测。

Description

一种细胞因子免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种细胞因子免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

细胞因子(cytokine，CK)是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。细胞因子具有重要的生物学功能，例如白介素6(IL-6)是一种由免疫系统细胞、血管内皮细胞及脂肪细胞产生的多效应细胞因子。它能在免疫反应、急性反应、造血作用、肿瘤发生和炎症反应中起到关键作用，IL-6水平在自身免疫性疾病、心血管疾病、急性感染、烧伤、急性髓样白血病、器官移植排斥等疾病中均有改变，且IL-6水平变化与病程密切相关。因此，对IL-6等细胞因子进行快速、灵敏检测能够对病情变化进行监测，及早发现异常并采取治疗措施，具有重大意义。

目前，如细胞因子这样的蛋白质小分子的检测方法主要有ELISA、免疫荧光检测、免疫电化学检测、表面等离子共振等，这些方法均涉及抗体孵育、样品孵育、标记以及许多洗脱的步骤，操作繁琐，难以达到快速、简便的检测，并且难以在空间和设备有限的条件下进行检测。

但目前免疫层析试纸条的检测限通常在几十ng/mL，灵敏度不足，难以检测水平较低的细胞因子。超顺磁纳米颗粒(Superparamagnetic nanobead,SPMNB)是一种新兴的纳米材料，具有良好的磁学性质和磁分离特性，在磁场存在下可被固定，而撤销磁场时又能快速重悬，分散于溶液中。利用修饰相应的细胞因子抗体的超顺磁纳米颗粒，可以简便的实现细胞因子免疫层析试纸的快速、可视化检测。

发明内容

为了克服现有技术上的问题，本发明提供了一种细胞因子免疫层析试纸及其制备方法，在高灵敏度检测的同时大大缩短了检测时间，并且可以及时给出定量结果，检测仪器简单可靠，操作简易，方便实用。

本发明提供以下技术方案：

一种细胞因子免疫层析试纸，依次包括样品区、结合区、检测区，在所述样品区，检测液添加在样品垫上，用于检测液在结合垫上均匀分布并去除样品中的杂质颗粒；

在所述结合区样品垫部分叠压在结合垫之上，结合垫表面涂布纳米颗粒与目标细胞因子单克隆抗体的偶联物，检测液中的目标细胞因子与所述单克隆抗体特异性结合，结合垫用于吸附部分所述偶联物；

在所述检测区结合垫部分叠压在蛋白持留用膜上，所述蛋白持留用膜先后间隔设有检测线和质控线，所述检测线包被有目标细胞因子的多克隆抗体，当检测液中的目标细胞因子与所述多克隆抗体结合后，检测线处显色，目标细胞因子被检出；所述质控线上包被与所述单克隆抗体特异性结合的二抗抗体，当检测液中所述偶联物的单克隆抗体抗体与所述二抗抗体结合，质控线处显色，效验检测过程是否有效。

进一步地，在检测区下游还设有吸收区，在所述吸收区吸收垫部分叠压在蛋白持留用膜上，吸收垫用于控制检测液流速、促进虹吸作用，及避免检测液滞留在检测区表面。

进一步地，所述样品垫和结合垫的材质为玻璃纤维、无纺布、聚酯膜或纤维素滤纸；所述吸收垫为滤纸或层析纸。

进一步地，所述纳米颗粒为超顺磁纳米颗粒，所述超顺磁纳米颗粒的直径为100-300nm，结合垫涂布浓度为10μL/cm-30μL/cm。

进一步地，所述蛋白持留用膜为硝酸纤维素膜、PVDF膜或尼龙膜。

进一步地，所述细胞因子为白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、趋化因子或生长因子。

进一步地，目标细胞因子为白介素6，所述超顺磁纳米颗粒表面修饰氨基，通过碳二亚胺法与白介素6的单克隆抗体共价偶联，所述检测线包被白介素6多克隆抗体。

进一步地，检测线和质控线显色结果通过灰度处理进行目标细胞因子的半定量分析。

进一步地，通过磁性分析仪MAR对检测线和质控线的磁性进行定量分析。

一种细胞因子免疫层析试纸的测试试纸条，所述测试试纸条包括测试卡槽、试纸条本体、试纸条盖板，所述试纸条本体由下至上依次为宽度相同、长度不同的底板条、蛋白持留用膜、结合垫、样品垫和吸收垫，所述结合垫部分叠压在所述蛋白持留用膜一端上部，所述样品垫依次部分叠压在所述结合垫延长端上部，所述吸收垫部分叠压在所述蛋白持留用膜另一端上部；

试纸条本体置于测试卡槽内部，试纸条盖板与所述测试卡嵌合将试纸条本体固定其中，在所述测试卡上设有样品区通孔和检测区通孔，所述样品区通孔对应所述样品垫位置；所述检测区通孔对应所述蛋白持留用膜位置，在试纸条盖板上检测线和质控线的对应位置分别设有检测线和质控线标识。

一种测试试纸条的制备方法，包括以下步骤：

步骤一制备结合垫，将超顺磁纳米颗粒悬浮液洗涤、活化，将超顺磁纳米颗粒与目标小分子蛋白质单克隆抗体混合、偶联，对偶联物液体进行封闭、重悬、保存，定量喷涂在结合垫上，

步骤二制备蛋白持留用膜，对蛋白持留用膜进行包被，在检测线上包被目标小分子蛋白的多克隆抗体，在质控线上包被与单克隆抗体特异性结合的二抗抗体，检测线与质控线之间设有间隔；

步骤三组装测试试纸条，将底板条、蛋白持留用膜、结合垫、样品垫和吸收垫依次叠放成试纸条本体，将试纸条本体置于测试卡槽内部，将试纸条盖板压盖在试纸条本体上与测试卡槽嵌合，真空密封保存。

采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

1、本发明可以完成液体中目标细胞因子的检测，超顺磁纳米颗粒与目标细胞因子的单抗偶联，对目标细胞因子进行检测，高效、精准、测试时间短，本发明试纸适多种细胞因子的检测，灵敏度优于传统试纸条检测。

2、本发明试纸能够实现可视化半定量检测，优于传统的胶体金免疫层析试纸条，方便快捷，通常20分钟可进行信号读取。

3、本发明的试纸的检测结果可以通过磁性分析仪进行分析，检测结果可靠且便携，适合现场及时检测，检测信号稳定性好，便于长期保存。

附图说明

图1是本发明细胞因子免疫层析试纸的结构示意图；

图2是本发明测试试纸条的结构示意图。

其中：1-样品垫、2-结合垫、3-蛋白持留用膜、4-检测线、5-质控线、6-吸收垫、7-底板、8-样品区通孔、9-检测区通孔、10-测试卡槽、11-试纸条盖板。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种细胞因子免疫层析试纸，依次包括样品区、结合区、检测区，如图1所示，在样品区，检测液添加在样品垫1上；在结合区样品垫部分叠压在结合垫2之上，结合垫表面涂布纳米颗粒与目标细胞因子单克隆抗体的偶联物，检测液中的目标细胞因子与单克隆抗体特异性结合。

在检测区结合垫部分叠压在蛋白持留用膜3上，蛋白持留用膜先后间隔设有检测线4和质控线5，检测线包被有目标细胞因子的多克隆抗体，当检测液中的目标细胞因子与所述多克隆抗体结合后，检测线处显色，目标细胞因子被检出；质控线上包被与所述单克隆抗体特异性结合的二抗抗体，当检测液中所述偶联物的单克隆抗体抗体与二抗抗体结合，质控线处显色，效验检测过程是否有效。

优选地，在检测区下游还设有吸收区，在吸收区吸收垫6部分叠压在蛋白持留用膜上，吸收垫用于控制检测液流速、促进虹吸作用，及避免检测液滞留在检测区表面。

样品垫和结合垫的材质为玻璃纤维、无纺布、聚酯膜或纤维素滤纸；吸收垫为滤纸或层析纸。样品垫中还可以添加表面活性剂等改性剂。

优选地，纳米颗粒可以为超顺磁纳米颗粒，超顺磁纳米颗粒的直径为100-300nm，结合垫涂布浓度为10μL/cm-30μL/cm。蛋白持留用膜为硝酸纤维素膜、PVDF膜或尼龙膜，在本发明中对蛋白持留用膜的材质不作限定，能够实现该功能的膜都可被使用。本发明的细胞因子为白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、趋化因子或生长因子，或者其他生物小分子蛋白。

本发明利用超顺磁纳米颗粒偶联单克隆抗体，简化了操作步骤，提高检测效力和检测精度。

例如使用本发明磁性免疫层析试纸条进行IL-6检测，当待测样品中含有IL-6时，IL-6蛋白先与结合垫上的超顺磁颗粒-抗体偶联物结合。随着层析作用的进行，当进过检测线T时，结合有偶联物的IL-6蛋白与检测线上多抗结合并停留在T线上，未结合IL-6的偶联物则继续流动，当流经质控线C时，偶联物与C线上的二抗结合并停留在C线处。整个层析反应大约在30分钟内完成，一般反应5分钟后可在检测线T和质控线C上出现肉眼清晰可见的棕色显色条带。检测线和质控线显色结果通过灰度处理进行目标细胞因子的半定量分析。或者通过磁性分析仪MAR对检测线和质控线的磁性进行定量分析。

实施例2

图2是本发明测试试纸条的结构示意图，如图2所示，测试试纸条包括测试卡槽10、试纸条本体、试纸条盖板11，试纸条本体由下至上依次为宽度相同、长度不同的底板条、蛋白持留用膜、结合垫、样品垫和吸收垫，结合垫部分叠压在蛋白持留用膜一端上部，样品垫依次部分叠压在结合垫延长端上部，吸收垫部分叠压在蛋白持留用膜另一端上部；

试纸条本体置于测试卡槽内部，试纸条盖板与测试卡嵌合将试纸条本体固定其中，在测试卡上设有样品区通孔和检测区通孔，样品区通孔对应样品垫位置；检测区通孔对应蛋白持留用膜位置，在试纸条盖板上检测线和质控线的对应位置分别设有检测线T和质控线标识C。

实施例3

IL-6的检测方法。

A.抗体的筛选：筛选商品化的IL-6的单克隆抗体和多克隆抗体，且能够配对进行ELISA实验的抗体。

B.超顺磁颗粒-抗体偶联物的活化：选用直径为100-300nm的商品化超顺磁纳米颗粒，取1mg磁颗粒到1.5ml离心管中，用500ul MEST(pH 6.0，0.05％Tween 20)洗涤3次，磁分离后移除上清；加入新配置的100ul EDC(5mg/ml)和100ul NHS(5mg/ml)溶液到装有磁颗粒的离心管中，并加入300ul PBST溶液；4℃活化8h或25℃活化30～60min或37℃活化4～5h，该期间保持磁颗粒的悬浮状态；离心管置于磁分离架上磁分离，移除上清，加入500ulMEST，将磁颗粒移到新的离心管中，并使用500ul MEST洗涤3次，磁分离后移除上清；

C.超顺磁纳米颗粒与抗体共价偶联：加入40ul(1mg/ml)的单克隆抗体到装有磁颗粒的离心管中，并加入460ul PBST溶液，混匀磁颗粒和单克隆抗体；4℃偶联8h或25℃偶联4～5h或37℃偶联3h，该期间保持磁颗粒的悬浮状态；

D.超顺磁纳米颗粒-抗体偶联物的封闭：偶联结束后，将离心管置于磁分离架上分离，移除上清；加入500ul PBST(pH 7.4，含1％BSA)重悬偶联物；4℃封闭12～15h或25℃封闭1～2h或37℃封闭30min，该期间保持磁颗粒的悬浮状态；

E.超顺磁纳米颗粒-抗体偶联物的重悬：封闭结束后，将离心管置于磁分离架上分离，移除上清；使用500ul PBST洗涤3次，磁分离后移除上清；加入250ul PBST(pH 7.4，含0.02％NaN3，0.5％BSA)重悬。

F.将制备好的磁颗粒抗体偶联物使用定量喷液装置以10μL/cm-20μL/cm的量喷涂于结合垫上；

G.硝酸纤维素膜的包被：使用包被缓冲液将针对IL-6表面蛋白的多克隆抗体以及羊抗小鼠IgG稀释到0.5-2mg/ml浓度，使用定量喷液装置分别将二者以0.4-0.8cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，晾干后于干燥处(湿度20％～40％)封存备用，保存温度为4℃～25℃，避免阳光直射；

H.试纸条的组装：在底板上依次相互交错2mm地贴上包被有抗体的硝酸纤维素膜、磁颗粒结合垫、样品垫、吸收垫、然后根据要求宽度切割即得到试纸条

I.检测卡槽的组装：将上述组装好的试纸条放置于塑料检测卡槽内，盖上盖板后紧压，确保试纸条固定无偏斜，与干燥剂一并放入铝箔袋中真空密封保存。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种细胞因子免疫层析试纸，依次包括样品区、结合区、检测区，其特征在于，在所述样品区，检测液添加在样品垫上，用于检测液在结合垫上均匀分布并去除样品中的杂质颗粒；

在所述结合区样品垫部分叠压在结合垫之上，结合垫表面涂布纳米颗粒与目标细胞因子单克隆抗体的偶联物，检测液中的目标细胞因子与所述单克隆抗体特异性结合，结合垫用于吸附部分所述偶联物；

在所述检测区结合垫部分叠压在蛋白持留用膜上，所述蛋白持留用膜先后间隔设有检测线和质控线，所述检测线包被有目标细胞因子的多克隆抗体，当检测液中的目标细胞因子与所述多克隆抗体结合后，检测线处显色，目标细胞因子被检出；所述质控线上包被与所述单克隆抗体特异性结合的二抗抗体，当检测液中所述偶联物的单克隆抗体抗体与所述二抗抗体结合，质控线处显色，效验检测过程是否有效。

2.根据权利要求1所述的细胞因子免疫层析试纸，其特征在于，在检测区下游还设有吸收区，在所述吸收区吸收垫部分叠压在蛋白持留用膜上，吸收垫用于控制检测液流速、促进虹吸作用，及避免检测液滞留在检测区表面。

3.根据权利要求1所述的细胞因子免疫层析试纸，其特征在于，所述样品垫和结合垫的材质为玻璃纤维、无纺布、聚酯膜或纤维素滤纸；所述吸收垫为滤纸或层析纸。

4.根据权利要求1所述的细胞因子免疫层析试纸，其特征在于，所述纳米颗粒为超顺磁纳米颗粒，所述超顺磁纳米颗粒的直径为100-300nm，结合垫涂布浓度为10μL/cm-30μL/cm。

5.根据权利要求1所述的细胞因子免疫层析试纸，其特征在于，所述蛋白持留用膜为硝酸纤维素膜、PVDF膜或尼龙膜。

6.根据权利要求1所述的细胞因子免疫层析试纸，其特征在于，所述细胞因子为白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、趋化因子或生长因子。

7.根据权利要求4所述的细胞因子免疫层析试纸，其特征在于，目标细胞因子为白介素6，所述超顺磁纳米颗粒表面修饰氨基，通过碳二亚胺法与白介素6的单克隆抗体共价偶联，所述检测线包被白介素6多克隆抗体。

8.根据权利要求4所述的细胞因子免疫层析试纸，其特征在于，检测线和质控线显色结果通过灰度处理进行目标细胞因子的半定量分析。

9.根据权利要求4所述的细胞因子免疫层析试纸，其特征在于，通过磁性分析仪MAR对检测线和质控线的磁性进行定量分析。

10.根据权利要求1或4中任一项所述的细胞因子免疫层析试纸的测试试纸条，其特征在于，所述测试试纸条包括测试卡槽、试纸条本体、试纸条盖板，所述试纸条本体由下至上依次为宽度相同、长度不同的底板条、蛋白持留用膜、结合垫、样品垫和吸收垫，所述结合垫部分叠压在所述蛋白持留用膜一端上部，所述样品垫依次部分叠压在所述结合垫延长端上部，所述吸收垫部分叠压在所述蛋白持留用膜另一端上部；

试纸条本体置于测试卡槽内部，试纸条盖板与所述测试卡嵌合将试纸条本体固定其中，在所述测试卡上设有样品区通孔和检测区通孔，所述样品区通孔对应所述样品垫位置；所述检测区通孔对应所述蛋白持留用膜位置，在试纸条盖板上检测线和质控线的对应位置分别设有检测线和质控线标识。

11.根据权利要求10所述测试试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一 制备结合垫，将超顺磁纳米颗粒悬浮液洗涤、活化，将超顺磁纳米颗粒与目标小分子蛋白质单克隆抗体混合、偶联，对偶联物液体进行封闭、重悬、保存，定量喷涂在结合垫上，

步骤二 制备蛋白持留用膜，对蛋白持留用膜进行包被，在检测线上包被目标小分子蛋白的多克隆抗体，在质控线上包被与单克隆抗体特异性结合的二抗抗体，检测线与质控线之间设有间隔；

步骤三 组装测试试纸条，将底板条、蛋白持留用膜、结合垫、样品垫和吸收垫依次叠放成试纸条本体，将试纸条本体置于测试卡槽内部，将试纸条盖板压盖在试纸条本体上与测试卡槽嵌合，真空密封保存。