CN109521196A - 一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒 - Google Patents

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Abstract

本发明创造提供一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，所述试纸条位于试纸盒内，所述试纸条包括有底板和设置于底板上的顺次搭接的样品垫、超顺磁性纳米微球标记垫、NC膜和吸水垫，所述超顺磁性纳米微球标记垫上喷涂有磁性纳米微球和鸡IgY抗体的混合体，其中所述磁性纳米微球的表面包被有肺炎衣原体抗原；所述试纸盒上设有吸引所述磁性纳米微球的薄磁铁。本发明创造的试纸盒采用包被有肺炎衣原体抗原的超顺磁性纳米微球进行检测，检测时磁性纳米微球材料可在免疫层析时形成肉眼可见的检测条带，易于观察实现家庭自测；而在临床使用时，可以将磁性手柄拆除，配合磁性仪器使用，具有较高的医用临床和家用价值。

Description

一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒
技术领域
本发明创造属于医疗检测装置领域，尤其是涉及一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒。
背景技术
肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，Cp)是一种常见的人类呼吸道致病菌，它首次发现于1989年。目前，肺炎衣原体只有一个血清型，98KD蛋白为特异性抗原，代表株为TWAR。它的原体形态多样，电镜下可呈现点型的梨形，其长轴长0.44um，短轴长0.31um，平均直径为0.38um。核区呈圆形，位于细胞中央，平均直径为0.24um，核区和细胞膜之间有较宽的原生质区。Cpn的感染即为普遍，呈世界性的分布，主要引起人类的呼吸道感染，与人类密度呈正相关，在临床上多以隐性、持续性感染形式存在，反复迁延导致难以治疗的并发证，与哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病等心脑血管疾病的发生和发展密切相关。
肺炎衣原体感染机体后，IgM抗体于2-4周出现，IgG抗体于6-8周内出现。通常，肺炎衣原体急性感染的2-6个月后，IgM抗体急剧下降，直至不能被检出，IgG抗体则下降缓慢，可持续较长时间。因此怀疑肺炎衣原体初次感染时，IgM的检测具有重要的诊断意义；然而，反复感染或慢性感染时，IgM抗体的滴度通常很低，IgM抗体检测呈阴性不能排除现症感染；再次感染时，IgM抗体通常不会出现，而IgG抗体的滴度会迅速升高。
目前，特异性IgM及IgG抗体的检测方法主要有冷凝集试验、明胶颗粒凝集实验、酶连免疫吸附实验、金标免疫斑点法、金标免疫层析法及超顺磁性纳米微球检测法。冷凝集实验的特异性度和敏感度均为最低，其临床诊断价值不大；金标免疫斑点法及金标免疫层析虽操作简便快捷，但敏感度略低，对抗体水平较低患者有漏诊的可能；明胶凝集实验试剂准备与操作过程较为繁琐，且需要专业人员操作；酶联免疫吸附法虽具有特异、敏感等优点，但检测时间长，操作繁琐，无法同时检测IgM及IgG两种抗体。超顺磁性纳米微球检测法中，由于超顺磁性纳米微球的内部是一个磁核，外部是一层包覆层(高分子材料)，表面分布着许多活性基团，可以和抗体等蛋白质发生偶联，磁性纳米微球有巨大的比表面积，可以偶联大量的生物分子；将磁性纳米微球包被上特异性抗体、抗原、受体、单链DNA等，可用于分离复杂样品中的靶体，大大提高了分离速度和富集效率；在外加磁场的作用下，超顺磁性纳米微球可以快速移动，通过吸附、洗涤、解吸附等操作步骤从样品中得到目标抗体，因而大大提高了反应速度、检测灵敏度和稳定性；但现有的超顺磁性纳米微球检测法需要专业人员配合磁性仪器分析进行检测，不适用于家庭自测。因此，设计一种具备高灵敏度的对肺炎衣原体的特异性IgM、IgG抗体进行快速同步共检的试纸盒尤为重要。
发明创造内容
本发明创造要解决的技术问题是提供一种肺炎衣原体IgM、IgG抗体快速检测试纸盒及适配试纸条，能够做到快速检测被检者是否有肺炎衣原体感染，以及初步判断初期感染还是既往感染。
为解决上述技术问题，本发明创造采用的技术方案是：
一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，所述试纸条位于试纸盒内，所述试纸条包括有底板和设置于底板上的顺次搭接的样品垫、超顺磁性纳米微球标记垫、NC膜和吸水垫，所述超顺磁性纳米微球标记垫上喷涂有磁性纳米微球和鸡IgY抗体的混合体，其中所述磁性纳米微球的表面包被有肺炎衣原体抗原；所述NC膜上设有两条检测线和一条质控线，所述两条检测线分别为鼠抗人IgM抗体和鼠抗人IgG抗体印制而成的薄膜线，所述质控线为羊抗鸡IgY抗体印制而成的薄膜线；
所述试纸盒上设有吸引所述磁性纳米微球的薄磁铁。
进一步，所述试纸盒包括有试纸盒上盖、试纸盒下盖及可拆卸的手柄；所述试纸盒上盖上依次开有观察视窗和加样孔；
所述手柄为一侧设有开口的中空结构，其外表面有防滑纹；所述手柄的内表面固定有薄磁铁；
进一步，所述试纸盒上盖包括有上盖本体和设于上盖本体一端的上盖凸起，相应地，所述试纸盒下盖包括有下盖本体和设于下盖本体一端的下盖凸起；所述上盖凸起与下盖凸起扣合后与所述手柄形成插接。
所述上盖凸起外表面还设有一U型凸起，所述下盖凸起的外表面也相应地设有一U型凸起，所述手柄的开口端设有一U型凹槽，所述U型凹槽的尺寸与所述试纸盒上盖和试纸盒下盖上的U凸起尺寸相适配。
进一步，所述底板为PVC材质。
进一步，所述样品垫材质是玻璃纤维素膜。
进一步，所述超顺磁性纳米微球标记垫材质是玻璃纤维素膜。
进一步，所述试纸盒上盖的内表面的边角处固设有若干柱形固定棒，所述试纸盒下盖的内表面分布有与所述固定棒对应的中空柱形槽，所述中空柱形槽的内径与试纸盒上盖的柱形固定棒的外径相适配。
进一步，所述试纸盒下盖的内表面还设有限定试纸条位置的凹槽，所述凹槽的大小与所述试纸条尺寸相同。
进一步，所述两条检测线与一条质控线相互平行且与样品流动方向垂直。
本发明创造具有的优点和积极效果是：
(1)本发明创造提供了一种操作简便快捷、成本低、特异性强、携带方便、非专业人员也能操作和进行现场检测的磁性检测试纸盒；
(2)本发明创造通过超顺磁性纳米微球表面结合的抗原与待检物特异性的结合，减少了样本(血清、血浆或全血)中甘油三酯、蛋白质等的干扰，以及IgM抗体和IgG抗体间因原料纯化不好而出现的交叉反应，大大减少了非特异性的出现，降低假阳性或假阴性；
(3)本发明创造的试纸盒采用包被有肺炎衣原体抗原的超顺磁性纳米微球进行检测，结合磁性纳米微球在外磁场作用下迅速聚集，离开磁场能够均匀分散，具有较强的顺磁性且不易沉降的特点，同时也利用了其具有丰富的表面活性基团，易于与抗原抗体偶联等优点；检测时磁性纳米微球材料可在免疫层析时形成肉眼可见的检测条带，易于观察实现家庭自测；而在临床使用时，可以将磁性手柄拆除，配合磁性仪器使用，使检测结果更加准确，提高了检测灵敏度和准确性，因此本发明能同时满足临床检测和家庭自测，具有较高的医用临床和家用价值；
(4)本试纸盒实现了抗人肺炎衣原体IgM、IgG抗体的同步检测，可快速判断被检者是初期感染、感染时间较久或是既往感染，解决了分项检测所带来的操作过程繁琐，检测不够方便快捷，检测成本高等问题，具有较高的市场价值，前景广阔。
附图说明
图1：肺炎衣原体抗体检测试纸条的结构示意图；
图2：试纸盒结构示意图；
图3：试纸盒手柄的剖视图；
图4：试纸盒上盖结构示意图；
图5：试纸盒下盖结构示意图；
图6：检测结果示意图。
图中：1-试纸盒，2-试纸条，3-试纸盒上盖，4-试纸盒下盖，5-手柄，6观察视窗，7-加样孔，8-薄磁铁，9-底板，10-样品垫，11-超顺磁性纳米微球标记垫，12-NC膜，13-吸水垫；T1线-鼠抗人IgM抗体；T2线-鼠抗人IgG抗体；C线-羊抗鸡IgY抗体。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明创造中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在本发明创造的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明创造和简化描述，而不是指示或暗示所指的机构或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明创造的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明创造的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本发明创造的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明创造中的具体含义。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1
如附图所示，本实施例在于提供一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，所述试纸盒1包括有试纸盒上盖3、试纸盒下盖4及可拆卸的手柄5；
所述试纸盒上盖3上依次开有观察视窗6和加样孔7，透过所述观察视窗6可以方便地观察试纸盒内试纸条2的检测结果；所述加样孔7用于将样品滴加至试纸盒内的试纸条2上；
所述试纸盒上盖3的内表面的边角处固设有若干柱形固定棒，所述试纸盒下盖4内表面分布有与所述固定棒对应的中空柱形槽，所述中空柱形槽的内径与试纸盒上盖的柱形固定棒的外径相适配，用于将试纸盒下盖与试纸盒上盖紧密扣合，防止样本溢出或渗入检测盒内部，影响检测结果；
所述试纸盒下盖4的内表面还设有限定试纸条2位置的凹槽，所述凹槽的大小与所述试纸条2尺寸相同，从而可以将试纸条2放置在所述凹槽内，防止检测时由于移动、意外掉落等使试纸条位置移动等造成检测结果不准确；
所述手柄5为一侧设有开口的中空结构，其外表面有防滑纹，便于检测者手持观察结果；所述手柄5的内表面固定有薄磁铁8，检测时提供外磁场，使超顺磁性纳米微球特异性定向移动，提高检测灵敏性。
所述试纸盒上盖3包括有上盖本体和设于上盖本体一端的上盖凸起，相应地，所述试纸盒下盖4包括有下盖本体和设于下盖本体一端的下盖凸起；当所述中空柱形槽与试纸盒上盖的柱形固定棒的相配合后，所述试纸盒上盖3和试纸盒下盖4形成封闭结构，保证紧密扣合，所述上盖凸起和下盖凸起也紧密扣合并与所述手柄插接连接；
进一步地，所述上盖凸起外表面还设有一U型凸起，所述下盖凸起的外表面也相应地设有一U型凸起，所述手柄5的开口端设有一U型凹槽，所述U型凹槽的尺寸与所述试纸盒上盖和试纸盒下盖上的U凸起尺寸相适配，使得所述手柄与所述试纸盒插接时可以通过所述U型凹槽和U型凸起的配合，牢固地固定在试纸盒端部，方便使用者手持检测，并可根据检测需要安装或拆除。
所述试纸条2包括有底板9和设置于底板上的顺次搭接的样品垫10、超顺磁性纳米微球标记垫11、NC膜12和吸水垫13；其中所述底板9为PVC材质，所述样品垫10为经过处理的玻璃纤维素膜，所述超顺磁性纳米微球标记垫11也是经过处理的玻璃纤维素膜，上面设有包被肺炎衣原体抗原的磁性纳米微球和胶体金标记的鸡IgY抗体；(其中PVC底板，吸水垫，玻璃纤维素膜购自上海捷宁生物科技有限公司；NC膜购自美国MilliporeCo；超顺磁性纳米微球购自上海奥润微纳新材料科技有限公司，直径80-100nm，表面带羧基修饰)。
所述NC膜12上设有两条检测线和一条质控线，所述的两条检测线分别为鼠抗人IgM抗体(T1线)和鼠抗人IgG抗体(T2线)印制而成的薄膜线，所述质控线为羊抗鸡IgY抗体(C线)印制而成的薄膜线(以上所述鼠抗人IgM抗体，鼠抗人IgG抗体，鸡IgY抗体、羊抗鸡IgY抗体均购自杭州隆基生物技术有限公司)；所述的两条检测线与一条质控线相互平行且与样品流动方向垂直。
具体地，在家用直接检测时，可先将带有薄磁铁的防滑手柄5安装固定在所述试纸盒1的端部，将血清、血浆或全血滴加到加样孔7中，垂直滴加2-3滴样品稀释液，样品朝着吸水纸方向层析，溶液将标记垫上的磁性纳米微球润湿并分散其中，磁性纳米微球也随着溶液一起在外磁场的做用下在硝酸纤维素膜上层析。如果溶液中有待检测物质肺炎衣原体抗体(IgM或IgG)，则标记垫11上的磁性纳米微球-Ag跟待检测物质中的IgM(或IgG)反应形成磁性微球-Ag-IgM(或磁性微球-Ag-IgG)复合物；当此复合物经过检测线T1时，与T1线上包被的鼠抗人IgM抗体结合，形成磁性微球-Ag-IgM-鼠抗人IgM抗体复合物进而出现肉眼可见的有色条带；未被检测线T1捕捉的磁性微球继续往前层析，到达检测线T2线，可与T2线上包被的鼠抗人IgG抗体结合，形成磁性微球-Ag-IgG-鼠抗人IgG抗体符合物进而出现肉眼可见的有色条带；金标鸡IgY抗体与质控线C线上包被的羊抗鸡IgY抗体结合行成有色条带。如果检测线上(T1、T2线均有有色条带或仅一条有色条带)和质控线上都有条带，则检测样品为阳性；如果只有质控线上有条带，则为阴性。待反应15-20min内观察结果。若检测线T1和T2和质控线C处出现反应线时，则表示肺炎衣原体IgM和IgG检测结果均为阳性，即可初步判断待检者为既往感染或感染时间较长；若只有检测线T1和质控线C处出现显色反应线，而检测线T2不显色，则表示肺炎衣原体IgM检测结果阳性，即被检者为初期感染；若检测线T1线不显色，而检测线T2线和质控线C处出现显色反应线，则表示肺炎衣原体IgG检测结果为阳性，即被检者为既往感染；若检测线T1线和T2线均不显色，只有质控线C线显色，则表示肺炎衣原体IgM抗体和IgG抗体检测结果均为阴性，即被检者没有感染肺炎衣原体；若质控线C线处不显色，则表示检测卡无效。
而在临床检测时，可将所述手柄5拆除，使所述试纸盒与磁性仪器配合使用，用磁信号分析仪检测试纸条特定位置上的磁信号，根据磁信号得出待测样本中肺炎衣原体抗体含量，具体步骤如下：检测时利用所述试纸条检测不同浓度的肺炎衣原体抗体，根据肺炎衣原体的不同浓度与其T线检测磁信号，得到定量曲线和肺炎衣原体不同浓度与其T/C检测磁信号的比值的定量曲线，测定样本中肺炎衣原体的抗体含量，进而可得到相应的检测结果。
实施例2
本实施例在于提供实施例1所述的试纸条的制备方法，具体步骤如下：
一、样品垫的制备
1、样品垫处理液的配置如表1所示：
表1样品垫处理液的配置
原料 浓度
TRIS 0.6％
Casein 0.1％
Tween-20 0.5％
PVP 0.5％
M1000002 0.5mg/ml
双蒸水 定容至1000ml
pH 7.0±0.1
根据表1所示配置样品垫处理液备用；
2、样品垫的制备
将步骤1中配置好的样品垫处理液按照16cm2/mL的分布铺于玻璃纤维素膜上，随后放于45℃的鼓风干燥箱中过夜备用。
二、超顺磁性纳米微球标记垫的制备
1、标记垫处理液的配置如表2所示：
表2标记垫处理液的配置
原料 浓度
TRIS 0.6％
Casein 0.5％
Tween-20 0.05％
PVP 0.5％
NaN<sub>3</sub> 0.02％
双蒸水 定容至1000ml
pH 8.0±0.1
将玻璃纤维素膜浸泡于处理好的标记垫处理液中，摇床匀速过夜，然后均匀甩干，放于45℃鼓风干燥箱中烘干备用；
2、超顺磁性纳米微球的抗原标记
(1)取2mg磁性纳米微球，用500ul pH值为4-6的10mMol/L的MEST(其中加入0.05％Tween-20)活化缓冲液洗涤2-4次后，向磁性纳米微球中加入485ul活化缓冲液再加入EDC(原浓度0.5mg/ml)与NHS(原浓度0.25mg/ml)分别2.5mg，在涡旋振荡器上混合均匀，室温活化30min。活化后，用MEST缓冲溶液洗涤除去未反应的活化剂，再更换离心管，并用MEST缓冲溶液洗涤磁性纳米微球两遍；
(2)用pH值7-9的5mMon/L的硼酸盐吐温缓冲液(其中Tween-20含量为0.05％)溶液作为偶联缓冲液，用500ul偶联缓冲液洗涤磁性纳米微球2-3遍；加入475ul偶联缓冲液重悬洗涤后的磁性纳米微球，在加入25ul的10mg/ml的肺炎衣原体重组抗原，20-25℃偶联过夜，期间在垂直旋转仪上不断摇动混匀；
(3)加入500ul的1％BSA(BSA溶解在硼酸盐吐温缓冲液中)对磁性纳米微球表面没有完全反应的活化基团进行封闭，室温30min。
(4)用BST洗涤封闭后的磁性纳米微球3-4次(洗涤时需更换离心管，要将磁性纳米微球重悬)，最后将磁性纳米微球重悬在500ul保存缓冲液1中(保存缓冲液1成分：pH值9的5mMol/L硼酸盐(BST)缓冲液，0.05％Tween-20，0.01％NaN3,，0.1％BSA)；
3、鸡IgY的胶体金标记标记
(1)取金水15ml于小烧杯中；
(2)调pH：加入适量0.2Mon/L碳酸钾溶液调节pH值，pH试纸Merck(0-14)测量pH至8-9；
(3)纯化水稀释原料鸡IgY抗体至1.0mg/ml；共150ul；
(4)将稀释的鸡IgY抗体加入15ml金水中，标记1h；
(5)加入10％BSA 150ul，轻柔混匀，摇床20min；
(6)分装离心：10000rpm，25min；
(7)弃去上清液，用150ul保存缓冲液2保存(保存缓冲液2为PBS缓冲液，成分为：NaCl 7.9g，KCl 0.2g,KH2PO4 0.24g，K2HPO4,1.8g溶解于水中，定容至1L，pH7.4),复溶备用。
4、标记垫的制备
(1)制备磁性纳米微球标记液，如表3所示
表3磁性纳米微球标记液的配置
(2)将制备好的磁性纳米微球标记液用Biodot airjet喷头均匀喷于上述经预处理的玻璃纤维素膜上，其参数为压力16psi，喷嘴间距7mm，喷量0.25ul/mm，喷速40mm/s，将制备好的结合垫放在37℃鼓风干燥箱中2-5h烘干，制成超顺磁性纳米微球标记垫。
三、NC膜的制备
用包被缓冲液(pH值7.4的磷酸盐缓冲液)将鼠抗人IgM抗体(T1线)、鼠抗人IgG抗体(T2线)和羊抗鸡IgY抗体(C线)稀释到包被浓度1.0mg/ml，将三种包被液以喷量0.1ul/mm，喷速20mm/s的喷点量分别包被在硝酸纤维素膜的检测线和质控线位置上，线间距离分别为4mm，45℃鼓风干燥箱干燥备用。
四、试纸条的制备
将上述步骤中的样品垫10、超顺磁性纳米微球标记垫11、NC膜12以及吸水垫13依次搭接在PCV底板9上，形成肺炎衣原体IgM抗体和IgG抗体共检磁性试纸条。将其放入实施例1中所述的试纸盒1中，即可完成相关检测。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，所述试纸条位于试纸盒内，其特征在于，所述试纸条包括有底板和设置于底板上的顺次搭接的样品垫、超顺磁性纳米微球标记垫、NC膜和吸水垫，所述超顺磁性纳米微球标记垫上喷涂有磁性纳米微球和鸡IgY抗体的混合体，其中所述磁性纳米微球的表面包被有肺炎衣原体抗原；所述NC膜上设有两条检测线和一条质控线，所述两条检测线分别为鼠抗人IgM抗体和鼠抗人IgG抗体印制而成的薄膜线，所述质控线为羊抗鸡IgY抗体印制而成的薄膜线；
所述试纸盒上设有吸引所述磁性纳米微球的薄磁铁。
2.一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，其特征在于，所述试纸盒包括有试纸盒上盖、试纸盒下盖及可拆卸的手柄；所述试纸盒上盖上依次开有观察视窗和加样孔；
所述手柄为一侧设有开口的中空结构，其外表面有防滑纹；所述手柄的内表面固定有薄磁铁。
3.如权利要求2所述的一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，其特征在于，所述试纸盒上盖包括有上盖本体和设于上盖本体一端的上盖凸起，相应地，所述试纸盒下盖包括有下盖本体和设于下盖本体一端的下盖凸起；所述上盖凸起与下盖凸起扣合后与所述手柄形成插接。
所述上盖凸起外表面还设有一U型凸起，所述下盖凸起的外表面也相应地设有一U型凸起，所述手柄的开口端设有一U型凹槽，所述U型凹槽的尺寸与所述试纸盒上盖和试纸盒下盖上的U凸起尺寸相适配。
4.如权利要求1所述的一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，其特征在于，所述底板为PVC材质。
5.如权利要求1所述的一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，其特征在于，所述样品垫材质是玻璃纤维素膜。
6.如权利要求1所述的一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，其特征在于，所述超顺磁性纳米微球标记垫材质是玻璃纤维素膜。
7.如权利要求2所述的一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，其特征在于，所述试纸盒上盖的内表面的边角处固设有若干柱形固定棒，所述试纸盒下盖的内表面分布有与所述固定棒对应的中空柱形槽，所述中空柱形槽的内径与试纸盒上盖的柱形固定棒的外径相适配。
8.如权利要求2所述的一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，其特征在于，所述试纸盒下盖的内表面还设有限定试纸条位置的凹槽，所述凹槽的大小与所述试纸条尺寸相同。
9.如权利要求1所述的一种肺炎衣原体抗体检测磁性试纸条及相应的试纸盒，其特征在于，所述两条检测线与一条质控线相互平行且与样品流动方向垂直。
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