CN103235120B - 一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒及其应用，包括以下组分：a)捕获微球；b)不同荧光标记的三种二抗；c)磷酸缓冲液。本发明还提供一种利用流式微球检测技术复合检测同一体系中戊型肝炎病毒抗体谱的方法。本发明优点在于：克服传统单种抗体检测假阴性、假阳性率高的缺陷，提高检测灵敏度和特异性；还可用于HEV病毒感染的分期；利用流式微球检测技术，反应过程一步完成，可以提高检测效率和自动化程度。

Description

一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学检测领域，具体地说，是一种利用流式微球检测技术复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒。

背景技术

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的经消化道传播的急性传染病，发病率逐年升高，目前尚无特效治疗方法。戊型肝炎广泛流行于亚、非及美洲一些国家，发病例呈全球性分布，是发展中国家较常见的传染病，我国为高发区。当成人感染HEV后，会出现尿黄、眼睛黄、皮肤黄发热，乏力、食欲减退、厌油、恶心、呕吐、上腹不适、肝区痛关节痛等症状。病情严重的病人可发生暴发性肝功能衰竭，肝昏迷，弥漫性血管内凝血等危及生命的并发症，孕妇感染HEV后，病死率高（5%～25%），还会造成流产和死胎。

目前，HEV病毒的检测方法主要有核酸检测和免疫学检测。HEV RNA 检测是临床戊型肝炎诊断的金标准，但该方法操作复杂、成本高，不易在临床广泛开展，而且在急性戊型肝炎患者中，血液或粪便中HEV RNA存在的时间较短，所以临床HEV的诊断主要依靠血液HEV抗体检测。抗HEV IgM是HEV急性感染的诊断指标之一，在感染HEV第2周就可以在血清中被检测到，第6周达到高峰，随后迅速下降，阳性持续时间较短（3个月左右），因此抗HEV IgM现有诊断试剂常有漏诊和误诊。这部分漏诊的带毒者即成为HEV的移动传染源，有可能是造成HEV区域性小规模流行和持续散发的原因。此外，类风湿因子等的存在会影响血清IgM的检测，造成假阳性，这在其他疾病检测中屡见不鲜，抗-HEV IgM检测也不例外。这说明现有的IgM诊断试剂尚不能满足HEV感染的临床诊断和流行病学筛查与防治的需要。抗HEV IgG一般在发病2周后可检测到，在第7周达到高峰，并能一直保持在较高的水平，可持续1年甚至数年，因此抗HEV IgG检测是目前HEV病毒感染诊断主要依据。但是抗HEV IgG不能鉴别患者为HEV急性感染还是既往感染。有研究表明IgG抗体亲和力高低测定可诊断是否为急性感染，通常感染初期IgG亲和力低，恢复期IgG亲和力高，但重复感染患者通常也表现为IgG亲和力高。这种情况在孕妇弓型虫感染患者中也有报道。虽然抗体亲和力能用来区分感染时间，特别是亚临床和无黄疸的患者，也可以鉴定抗HEV IgM阴性的急性感染，但高和低亲和力的区分不得不凭经验，而且不是所有急性感染都是抗-HEV IgG亲和力都低，也有的患者发病早期抗HEV IgG阳性，而亲和力高，因此抗体亲和力实验只能作为一种验证实验。人体感染HEV后3～4周，首先出现抗HEV IgM和IgA，此后约l周即可检测到抗HEV lgG。IgA抗体被证实在一些病毒性疾病的急性感染期升高，可以作为早期诊断的标志。在大部分HEV早期感染患者中，可检测到抗HEV IgM和抗HEV IgA阳性，但抗HEV IgA阳性持续时间比抗HEV IgM长，平均约为（120±23）d，对HEV感染的早期诊断更有意义。

流式微球技术(cytometric bead array，CBA)是流式细胞技术与微球相结合的一项新技术，是近年发展起来的一种定量检测细胞分泌或裂解释放的细胞因子或其他可溶性蛋白的重要方法，与传统的ELISA方法相比，CBA 具有EL ISA 所无法比拟的优点。CBA 的技术原理是利用有机高分子微球为载体，用特异性抗原/抗体(捕获抗体) 进行包被，再与标准品/或待检样本及荧光素标记的特异性抗原/抗体(检测抗体)一起反应，然后用流式细胞仪对其进行定量检测。如果将多种荧光强度具有明显差异的微球, 分别用不同抗原的特异性抗体包被，将包被好的微球(捕获微球) 混合, 并与标准/或待检样本及荧光素标记的特异性检测抗体一起反应, 可对样本中的多种可溶性蛋白质同时进行定量。该技术在液相环境中进行，可保持蛋白质构象不变，有利于抗原抗体结合，且有高通量、快速分析多重生物反应、高的灵敏度和特异性等传统ELISA无法比拟的优越性，已广泛应用于医学领域。

中国专利文献CN102375052A公开了一种在同一体系中检测IgM抗体和IgG抗体的方法，但是关于一种利用流式微球检测技术复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒。

本发明的再一目的是，提供一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒的应用。

本发明的另一的目的是，提供一种利用流式微球检测技术复合检测同一体系中戊型肝炎病毒抗体谱的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒，包括以下组分：

a)捕获微球，所述的捕获微球为包被有不同HEV特异性抗原的聚苯乙烯微球，所述的HEV特异性抗原为HEV病毒基因组ORF 2和ORF 3重要抗原位点融合表达的戊肝抗原；

b)荧光标记的三种二抗，其中三种二抗为针对人HEV IgG、IgM、IgA抗体的二抗，所述的三种二抗标记的荧光基团各不相同；

c)磷酸缓冲液。

所述的a中HEV特异性抗原为人HEV IgG、IgM和IgA抗原。

所述的a中聚苯乙烯微球为羧基表面微球。

所述的b中的三种二抗为羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA，荧光基团选自FITC，PE，PI，CY5，preCP、ECD中的三种。

所述的c中磷酸缓冲液的浓度 0.01mol/L，pH7.4。

所述的a中捕获微球的制备方法为：将偶联液、洗涤液、封闭/储存液放置到室温备用，所述偶联液为NaH₂PO₄ 0.1mol/L，pH6.2，所述洗涤液为PBS 0.01mol/L，pH7.4，所述封闭/储存液为PBS+1%BSA+0.02％NaN₃；①取微球用洗涤液冲洗；②加入活化缓冲液和EDC和NHS活化剂，混匀；③室温下避光摇震；④向活化的微球中加入HEV特异性抗原，混匀；⑤室温下避光摇振；⑥用洗涤液冲洗；⑦加入封闭液；⑧室温下避光摇震；⑨将包被好的微球放在储存液中4℃避光保存。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的试剂盒在制备检测戊型肝炎病毒抗体谱的检测器械中的应用。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种利用流式微球检测技术复合检测同一体系中戊型肝炎病毒抗体谱的方法，包括以下步骤：

    a) 捕获微球的制备，所述的捕获微球为包被有三种不同HEV特异性抗原的聚苯乙烯微球，所述的HEV特异性抗原为人IgG、IgM和IgA抗原；

b) 待检样品的处理：在同一反应器中，加入待检样品、捕获微球、不同荧光标记的三种二抗，孵育后形成微球-抗体-荧光二抗夹心复合物，其中三种二抗为针对人HEV IgG、IgM、IgA抗体的二抗；

c) 检测和结果判读：用流式细胞仪对经过孵育产生的微球复合物进行分析检测，通过分析三种荧光信号结果可获知待检样品的戊型肝炎病毒抗体谱。

所述的b中的三种二抗为羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA，所述的荧光基团选自FITC，PE，PI，CY5，preCP、ECD中的三种。

所述的a中捕获微球的制备方法为：将偶联液、洗涤液、封闭/储存液放置到室温备用，所述偶联液为NaH₂PO₄ 0.1mol/L，pH6.2，所述洗涤液为PBS 0.01mol/L，pH7.4，所述封闭/储存液为PBS+1%BSA+0.02％NaN₃；①取微球用洗涤液冲洗；②加入活化缓冲液和EDC和NHS活化剂，混匀；③室温下避光摇震；④向活化的微球中加入HEV特异性抗原，混匀；⑤室温下避光摇振；⑥用洗涤液冲洗；⑦加入封闭液；⑧室温下避光摇震；⑨将包被好的微球放在储存液中4℃避光保存。

本发明优点在于：

1、本发明提供一种应用流式微球技术联合检测戊型肝炎病毒IgG、IgM、IgA的方法及应用该方法的试剂盒，以克服传统单种抗体检测假阴性、假阳性率高的缺陷，提高检测灵敏度和特异性； 

2、本发明还可用于HEV病毒感染的分期；

3、利用流式微球检测技术，反应过程一步完成，可以提高检测效率和自动化程度。

附图说明

附图1为本发明实施例中对抗HEV IgG, IgM，IgA用流式微球技术进行检测的结果图，图中蓝色、红色、黄色三条图谱分别代表抗HEV IgG，IgM，IgA。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《细胞实验指南》（科学出版社，北京，中国，2001年）、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册中所列方法来实施。

实施例1  检测试剂盒和相应检测试剂的制备

本发明提供一种应用流式微球技术联合检测戊型肝炎病毒IgG、IgM、IgA的试剂盒和相应检测试剂的制备。

用于本发明的检测试剂盒，其中包括：捕获微球，荧光-羊抗人IgG，荧光-羊抗人IgM，荧光-羊抗人IgA，缓冲液。

其中捕获微球为包被有HEV特异性抗原的聚苯乙烯微球。优选微球为羧基表面微球。

捕获微球的制备过程为：将偶联液(NaH₂PO₄ 0.1mol／L，pH6.2)、洗涤液(PBS 0.01mol／L，pH7.4)、封闭／储存液(PBS+ 1%BSA+0.02％NaN₃)放置到室温备用。①取微球用洗涤液冲洗；②加入活化缓冲液和EDC和NHS活化剂，混匀；③室温下避光摇震；④向活化的微球中加入HEV特异性抗原，混匀；⑤室温下避光摇震；⑥用洗涤液冲洗；⑦加入封闭液；⑧室温下避光摇震；⑨将包被好的微球放在储存液中4℃避光保存。其中优选的HEV特异性抗原为HEV病毒基因组ORF 2和ORF 3重要抗原位点融合表达的戊肝抗原。

羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA标记各不相同的荧光基团。优选荧光基团是FITC，PE，PI，CY5，preCP，ECD。

缓冲液优选磷酸缓冲液，浓度 0.01mol／L，pH7.4。

实施例2  检测方法

本发明还提供一种应用流式微球技术联合检测戊型肝炎病毒IgG、IgM、IgA的方法，包括以下步骤：

（1）捕获微球的制备；

（2）在同一反应器中，加入待检样品、捕获微球、三种荧光标记的二抗，孵育反应后形成微球-抗体-荧光二抗复合物；

（3）用流式细胞仪对经过孵育产生的微球复合物处理后的样品进行分析检测，通过分析三种荧光信号结果，可获知感染患者戊型肝炎病毒患者血样中抗体谱。

捕获微球的制备参见实施例1或3。

待检样品的处理过程为：①取待检样品与捕获微球混匀，加入三种荧光标记的二抗；②室温避光摇震以形成微球-抗体-荧光二抗夹心复合物；③用缓冲液冲洗，重悬浮后待测。其中待检样品为血清/血浆。其中三种二抗为羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA。其中，各种二抗标记的荧光基团是不同的，优选荧光基团是FITC，PE，PI，CY5，preCP，ECD。

检测结果的判定方法为：按照流式细胞仪给出三种荧光信号值，获得患者的HEV抗体谱。其中检测到PE荧光信号的为IgM阳性，为急性期感染；检测到CY5荧光信号的为IgA阳性，为急性期感染；仅检测到FITC荧光信号的为IgG阳性，为既往感染。

实施例3  捕获微球的制备：  

本实施例中微球(0.4μm，1×10⁸个／mL)购自Spherotech公司。

将偶联液(NaH₂PO₄ 0.1mol／L，pH6.2)、洗涤液(PBS 0.01mol／L，pH7.4)、封闭／储存液(PBS+I%BSA+0.02%NaN₃)放置到室温备用。①取lμL微球悬液(1×10⁵个/μL) 用洗涤液洗一遍；②加入80μL活化缓冲液和10μLEDC和NHS(5mg/mL)活化剂，混匀；③室温下避光摇震20min；④向活化微球中加入100μL(4μg/mL)HEV抗原，混匀；⑤室温下避光摇震2h；⑥用洗涤液洗3次；⑦加入200μL封闭液；⑧室温下避光摇震lh；⑨将包被好的微球放在l00μL封闭／储存缓冲液中4℃避光保存。

实施例4  微球-抗体-荧光二抗复合物的制备

取100μL血清/血浆与l0μL(约1×10⁶个)检测微球轻轻混匀，加入100μL(1:25倍稀释)荧光二抗(FITC-羊抗人IgG、PE-羊抗人IgM、CY5-羊抗人IgA)，用PBS调至反应体积为500μL；②室温避光摇震2h以形成微球-抗体-荧光二抗复合物；③用洗涤液洗两次，重新悬浮后待测，同时作阴性样本对照。

实施例5  结果判断

检测到二抗荧光信号的判定为HEV阳性样本。其中检测到PE荧光信号的为IgM阳性，为急性期感染；检测到CY5荧光信号的为IgA阳性，为急性期感染；仅检测到FITC荧光信号的为IgG阳性，为既往感染。

附图1显示了本发明实施例中对抗HEV IgG, IgM，IgA用流式微球技术进行检测的结果图，其结果能够清晰检测到并区分三种抗体，显示本发明的检测灵敏度和特异性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

a)捕获微球，所述的捕获微球为包被有人HEV IgG、IgM和IgA的特异性抗原的羧基表面的0.4μm聚苯乙烯微球，所述的特异性抗原为HEV病毒基因组ORF 2和ORF 3重要抗原位点融合表达的戊肝抗原；

b)荧光标记的三种二抗，其中所述荧光标记的三种二抗分别是针对人HEV IgG、IgM和IgA抗体的FITC-羊抗人IgG荧光二抗、PE-羊抗人IgM荧光二抗和CY5-羊抗人IgA荧光二抗；

c)磷酸缓冲液，其中磷酸缓冲液的浓度为0.01mol/L，而且磷酸缓冲液的pH为pH7.4。

2.根据权利要求1所述的试剂盒在制备检测戊型肝炎病毒抗体谱的检测器械中的应用。