CN105980547A - 用于活动性肝炎病毒感染的检测的combo-肝炎抗原测定法 - Google Patents

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Abstract

本文中公开的是用于受试者的肝炎病毒感染的检测和诊断的测定法、系统和试剂盒。

Description

用于活动性肝炎病毒感染的检测的COMBO-肝炎抗原测定法
发明背景
1.发明领域
本发明涉及用于检测和诊断活动性肝炎病毒感染的测定法以及测定系统和试剂盒。
2.相关领域的描述
丙型肝炎病毒(HCV)感染在世界上影响将近1.7亿人，在美国影响4-5百万人。HCV感染与慢性丙型肝炎(CHC)、肝硬化和肝细胞癌(HCC)相关联。最近的研究表明HCV感染仍在筛查和诊断中，这可导致许多受试者延迟获得医学随访和有效治疗。另外，疾病控制与预防中心(CDC)已建议筛查所有1945年至1965出生的个体的HCV感染。
自HCV基因组发现以来，多种抗HCV抗体测试已被开发来筛查HCV感染。抗HCV抗体测试检测由HCV感染的个体产生的抗HCV抗体的存在。因此，抗HCV抗体测试需要免疫应答和抗体形成的时间。这样，抗HCV抗体测试不能用于检测急性HCV感染。虽然相较于抗HCV抗体测试的前几代第三代抗HCV抗体测试已显著提高了灵敏性和特异性，但由于在病毒清除后剩余的抗HCV抗体，其不能区分正在进行的活跃HCV感染与先前的HCV感染。另外，抗HCV测试对于免疫受损、接受免疫抑制疗法或正在经历血液透析的受试者具有很高的假阴性发生率。因此，需要另外的测试，例如，HCV RNA的PCR测定法来确认对于HCV感染使用抗HCV抗体测试测定法呈阳性的那些受试者中的活动性HCV感染。不幸的是，HCV RNA PCR测定是耗时的，昂贵的，并且目前不被推荐作为HCV感染的筛查测试。
其它HCV测量检测HCV核心抗原(HCVcAg)。HCVcAg存在于完整HCV病毒体和不含HCV RNA的核心蛋白结构中。HCVcAg被认为是活动性HCV复制的标志物并且可早于抗-HCV抗体被检测到。主要HCVcAg测试系统是OrthoHCV Core Ag EIA测试(Ortho Clinical Diagnostics,Raritan,NJ)、Architect HCVcAg测试(Abbott,Laboratories,Abbott Park,IL)和Monolisa HCV Ag/Ab ULTRA测定法(Bio-Rad,Hercules,CA)。
Ortho HCV Core Ag EIA测试最初被开发为与抗-HCV测试组合的血液供体筛查测试，以覆盖来源于从抗-HCV阴性至阳性的血清转换的“窗口期”的可能的阴性抗-HCV测试结果。用于人血清或血浆中的丙型肝炎核心抗原检测的是酶联免疫吸附测定法(ELISA或EIA)。这些测定法利用几种对于HCV核心抗原的不同区域是特异性的单克隆抗体来涂覆微量板固相和捕获存在于所测试的血清样品中的HCVcAg。此后，随后将缀合于辣根过氧化物酶的另外的HCVcAg特异性单克隆抗体用于检测捕获的HCVcAg。该测试(HCM V2.0测试)的灵敏度据报导为1.48pg/mL的HCVcAg，对应于9,707IU/mL的HCVRNA(1)。文献综述得出通过该测试在HCV RNA PCR-阳性病例中产生的高假阴性率结果的结论。因此，Ortho HCV Core Ag EIA的低灵敏度限制其临床价值。
Architect HCVcAg测试是用于人血清和血浆样品中的HCVcAg的定量测定法的两步化学发光微粒免疫测定法(CMIA)。所述测定法将吖啶标记的鼠抗-HCV抗体用于液相中并将单克隆抗-HCV涂覆的顺磁性微粒用作固相。对于在3.0-20,000fmol/L的范围内的动态HCVcAg定量，该测试的报导的检测限为3fmol/L或0.06pg/mL的HCVcAg。在临床上，取决于HCV基因分型，这对应于在428-2700IU/mL的范围内的血清HCV RNA水平。虽然一些研究已报导该测试是高度灵敏的，但其它研究也报导其与HCV RNA PCR结果的总体相关性仅为79.7％，这在血清HCV RNA<3log的受试者中可低至19.7％。还已报导，在9/405(2.2％)的具有不可检测的HCV RNA的受试者中，HCVcAg被报导为阳性(HCVcAg>3fmol/L)，这表明假阳性HCVcAg测试导致这些受试者。另外，当血清HCV RNA以低得多的水平(<15IU/mL)存在时，可发生更多的假阳性结果。此外，该测试必需通过由提供商提供的特殊且昂贵的设备来进行自动化，所述设备不易被尤其是发展中国家的常规实验室采用来进行广泛的临床应用。目前，Architect HCV核心抗原测试在美国和许多其它国家未被批准。因此，该HCVcAg测试系统既不经济、灵敏和特异性，也不实用，从而将难以用于广泛的临床应用。
Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA测试是用于同时检测人血清和血浆样品中的抗-HCV和HCVcAg的两步ELISA。其基于抗-HCV的间接测试与用于HCVcAg检测的夹心测试的组合。虽然Monolisa HCV Ag-Ab ultra测定法据报导通过同时检测HCVcAg和抗-HCV抗体而具有提高的性能，但其不能区分HCV-Ab信号与HCVcAg信号，因此，其不能区分正在进行的活跃HCV感染与恢复的或过去的HCV感染。另外，该测试被设计来增加急生HCV感染的诊断率，研究表明将近29％的具有急性HCV感染的受试者将因该测定法的对HCVcAg组分的相对低的灵敏度而被该测试遗漏。
应当指出的是，除了在具有低HCV RNA载量的样品中的低测试灵敏度以外，目前的HCVcAg测定法的另外的主要限制之一是对于血清抗-HCV呈阳性，但对于血清HCV RNA经PCR测定呈阴性的受试者的高阳性率。由于这些个体通常具有过去的，但非活动性HCV感染，因此这些受试者中对于HCVcAg的阳性测试应当被认为是假阳性的。这导致目前的HCVcAg测试不能区分活动性HCV感染与过去的感染。换句话说，当使用目前的HCVcAg测试时，不能判断对于HCVcAg经测试呈阳性的受试者是因活动性HCV感染还是因过去的HCV感染导致的。
因此，存在对可用于以足够的灵敏度和特异度检测受试者的活动性肝炎病毒感染的安全方便的测试的需要。
发明概述
在一些实施方案中，本发明提供了用于将样品鉴定为含有一种或多种肝炎病毒抗原的测定法，所述测定法包括将样品与特异性结合一种或多种肝炎病毒抗原的多种抗体接触，检测结合于多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，并且当结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原被检测为存在时，将样品鉴定为含有肝炎病毒抗原，以及当结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原不存在时，将样品鉴定为不含肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述一种或多种肝炎病毒抗原是HCV抗原和/或乙型肝炎病毒(HBV)抗原。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HBV表面抗原(HBsAg)或由其组成。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HCV抗原或由其组成。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组，并且HCV抗原的至少一种为HCVcAg。在一些实施方案中，所述HCV抗原包含HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a，基本上由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成或由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成。在一些实施方案中，将样品在检测步骤之前经历使免疫复合物解离的条件。在一些实施方案中，在检测步骤之前不将所述样品经历使免疫复合物解离的条件。在一些实施方案中，所述样品是尿。在一些实施方案中，所述样品是全血、血清或血浆。在一些实施方案中，所述多种抗体包含第一抗体和第二抗体，所述第一抗体和第二抗体特异性结合相同肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述测定法还包括将样品与所述多种抗体混合以形成混合物，和随后将所述混合物与具有特异性结合所述多种抗体的捕获试剂的底物接触，所述捕获试剂可在检测步骤之前结合于或可不结合于所述肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述检测步骤包括将可检测标记附接于所述多种抗体中的每一种抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了将受试者诊断为具有活动性肝炎病毒感染的方法，所述方法包括当未曾经历变性条件的来自所述受试者的尿样品或来自所述受试者的另一样品(例如，全血、血清、血浆样品等)已被使用如本文所述的本发明的测定法鉴定为含有游离肝炎病毒抗原时，将受试者诊断为具有活动性肝炎病毒感染。在一些实施方案中，所述测定法用于将样品鉴定为含有游离肝炎病毒抗原，其包括将样品与多种抗体接触，其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，并且当结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原被检测为存在时，将所述样品鉴定为含有游离肝炎病毒抗原，以及当结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原不存在时，将所述样品鉴定为不含游离肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述肝炎病毒感染是丙型肝炎病毒(HCV)感染。在一些实施方案中，所述肝炎病毒感染是乙型肝炎病毒(HBV)感染。在一些实施方案中，所述一种或多种肝炎病毒抗原是HCV抗原和/或HBV抗原。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HBsAg或由其组成。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HCV抗原或由其组成。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组，并且所述HCV抗原的至少一种是HCVcAg。在一些实施方案中，所述HCV抗原包含HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a，基本由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成，或由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成。在一些实施方案中，所述多种抗体包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体和第二抗体特异性结合相同肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述测定法还包括将样品与所述多种抗体混合以形成混合物，和随后将所述混合物与具有特异性结合所述多种抗体的捕获试剂的底物接触，所述捕获试剂可在检测步骤之前结合于或可不结合于所述肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述检测步骤包括将可检测标记附接于所述多种抗体中的每一种抗体。在一些实施方案中，所述方法用于从多个受试者中将受试者鉴定为具有或不具有活动性肝炎病毒感染。
在一些实施方案中，本发明涉及用于将受试者诊断为具有活动性肝炎病毒感染或曾具有过去的且被清除的肝炎病毒感染的方法，所述方法包括从受试者获得第一样品和第二样品，其中至少所述第二样品能够具有免疫复合物，将不能够具有免疫复合物和/或未曾经历使免疫复合物解离的条件的所述第一样品与多种抗体(其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原)接触，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，将已经历使免疫复合物解离的条件的第二样品与所述多种抗体接触，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，并且当结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原被检测为存在于第一样品中时，将所述受试者诊断为具有活动性肝炎病毒感染，以及当在所述第二样品中检测到结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原，并且在所述第一样品中未检测到肝炎病毒抗原时，将所述受试者诊断为具有过去的且被清除的肝炎病毒感染。例如，在一些实施方案中，本发明涉及用于将受试者诊断为具有活动性肝炎病毒感染或曾具有过去的且被清除的肝炎病毒感染的方法，所述方法包括检测和/或测量游离肝炎病毒抗原和检测和/或测量来自受试者的一个或多个样品中的总的肝炎病毒抗原，并且当游离的肝炎病毒抗原被检测为存在时，将所述受试者诊断为具有活动性肝炎病毒感染，以及当总的肝炎病毒抗原被检测为存在并且游离肝炎病毒抗原不存在时，将所述受试者诊断为具有过去的且被清除的肝炎病毒感染。在一些实施方案中，所述肝炎病毒感染是丙型肝炎病毒(HCV)感染。在一些实施方案中，所述肝炎病毒感染是乙型肝炎病毒(HBV)感染。在一些实施方案中，所述一种或多种肝炎病毒抗原是HCV抗原和/或HBV抗原。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HBsAg或由其组成。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HCV抗原或由其组成。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组，并且所述HCV抗原的至少一种是HCVcAg。在一些实施方案中，所述HCV抗原包含HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a或基本上由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成，或由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成。在一些实施方案中，所述第一样品和第二样品是全血、血清或血浆。在一些实施方案中，所述第一样品为尿并且所述第二样品为全血、血清或血浆。在一些实施方案中，所述第一样品和第二样品可以是同一样本的等分试样。在一些实施方案中，所述多种抗体包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体和第二抗体特异性结合相同的肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述测定法还包括将样品与所述多种抗体混合以形成混合物，和随后将所述混合物与具有特异性结合所述多种抗体的捕获试剂的底物接触，所述捕获试剂可在检测步骤之前结合于或可不结合于所述肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述检测步骤包括将可检测标记附接于多种抗体的每一种抗体。
在一些实施方案中，本发明涉及监测曾具有，已具有或可具有活动性肝炎病毒感染的受试者的方法，所述方法包括在第一时间点从所述受试者获得第一样品和第二样品，其中至少所述第二样品能够具免疫复合物，将不能够具有免疫复合物和/或未曾经历使免疫复合物解离的条件的所述第一样品与多种抗体接触，其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒肝炎病毒的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，将已经历使免疫复合物解离的条件的所述第二样品与所述多种抗体接触，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，在第二时间点从所述受试者获得第三样品和第四样品，其中至少所述第四样品能够具有免疫复合物，将不能够具有免疫复合物和/或未曾经历使免疫复合物解离的条件的所述第三样品与多种抗体接触，其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，将已经历使免疫复合物解离的条件的所述第四样品与所述多种抗体接触，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗体抗原的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，和计算第一样品、第二样品、第三样品和第四样品之间结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原的差异。例如，在一些实施方案中，将第一时期的来自受试者的一个或多个样品的游离肝炎病毒抗原和总的肝炎病毒抗原的存在或不存在和/或量，与第二时期的来自受试者的一个或多个样品中的游离肝炎病毒抗原和总的肝炎病毒抗原的存在或不存在和/或量相比较。在一些实施方案中，将来自所述第一时期的游离与总的肝炎抗原的比率与来自所述第二时期的游离与总的肝炎抗原的比率相比较。在一些实施方案中，所述肝炎病毒感染是丙型肝炎病毒(HCV)感染。在一些实施方案中，所述肝炎病毒感染是乙型肝炎病毒(HBV)感染。在一些实施方案中，所述一种或多种肝炎病毒抗原为HCV抗原和/或HBV抗原。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HBsAg或由其组成。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HCV抗原或由其组成。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组，并且所述HCV抗原的至少一种是HCVcAg。在一些实施方案中，所述HCV抗原包含HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a，基本上由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成或由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成。在一些实施方案中，所述样品是全血、血液或血浆。在一些实施方案中，所述第一和第三样品是尿并且所述第二和第四样品是全血、血清或血浆。在一些实施方案中，所述第一样品和第二样品是同一样本的等分试样。在一些实施方案中，所述第三样品和第四样品是同一样本的等分试样。在一些实施方案中，所述多种抗体包含第一抗体和第二抗体，所述第一抗体和第二抗体特异性结合相同肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述测定法还包括将样品与所述多种抗体混合以形成混合物，和随后将所述混合物与具有特异性结合所述多种抗体的捕获试剂的底物接触，所述捕获试剂可在检测步骤之前结合于或可不结合于所述肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述检测步骤包括将可检测标记附接于所述多种抗体中的每一种抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了用于测试样品中的分析物的免疫测定法，其包括将所述测试样品与一种或多种检测抗体混合，所述检测抗体特异性结合所述分析物，和随后将所述混合物与具有捕获抗体的测定底物接触，所述捕获抗体特异性结合涂覆在所述测定底物表面上的或固定在其上的所述分析物。在一些实施方案中，所述免疫测定法是酶促免疫测定法。
在一些实施方案中，本发明提供了用于测试样品中的分析物的侧流测试测定法，其包括将所述测试样品与缀合有可检测标记例如胶体金的特异性结合分析物的检测抗体混合，和随后将所述混合物加载在测试条上，所述测试条具有被固定在测试线上的特异性结合所述分析物的捕获抗体，和被固定在测试线下游的对照线上的特异性结合所述检测抗体的抗体。
根据本发明的受试者是哺乳动物受试者例如人受试者。在一些实施方案中，所述受试者需要根据本发明的测定法。需要根据本发明的测定法的受试者包括怀疑具有活动性和/或过去的肝炎病毒感染的那些受试者和已被暴露于肝炎病毒的那些受试者。在一些实施方案中，所述一种或多种肝炎病毒抗原是HCV抗原和/或HBV抗原。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HBsAg或由其组成。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HCV抗原或由其组成。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组，并且所述HCV抗原的至少一种是HCVcAg。在一些实施方案中，所述HCV抗原包含HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a，基本上由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成，或由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成。
在一些实施方案中，本发明提供了具有样品加载区(例如，其中首先将样品与侧流测试底物接触)、测试区和对照区的侧流测试底物，其中捕获试剂被固定在测试区中，所述捕获试剂是多种抗体，其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述一种或多种肝炎病毒抗原是HCV抗原和/或HBV抗原。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HBsAg或由其组成。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HCV抗原或由其组成。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组，并且所述HCV抗原的至少一种是HCVcAg。在一些实施方案中，所述HCV抗原包含HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a，基本上由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成或由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成。
在一些实施方案中，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含含有多种抗体(其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原)和底物(其具有被涂覆或固定在其上的特异性结合所述多种抗体、所述多种肝炎病毒抗原或两者的捕获试剂)的容器。在一些实施方案中，所述一种或多种肝炎病毒抗原是HCV抗原和/或HBV抗原。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HBsAg或由其组成。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HCV抗原或由其组成。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组，并且所述HCV抗原的至少一种是HCVcAg。在一些实施方案中，所述HCV抗原包含HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a，基本上由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成，或由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成。在一些实施方案中，所述多种抗体是具有非天然发现的所述多种抗体的浓度和/或纯度的组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含具有附接至其的可检测标记或缀合物的单克隆或多克隆抗体，所述单克隆或多克隆抗体特异性结合所述多种抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含具有样品加载区(例如，首先将样品与侧流测试底物在其中接触)、测试区和对照区的侧流测试底物，其中将捕获试剂固定在测试区中，所述捕获试剂是多种抗体，其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合与检测试剂包装在一起的多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原。在一些实施方案中，所述一种或多种肝炎病毒抗原是HCV抗原和/或HBV抗原。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HBsAg或由其组成。在一些实施方案中，所述肝炎病毒抗原包含HCV抗原或由其组成。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组。在一些实施方案中，所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组，并且所述HCV抗原的至少一种是HCVcAg。在一些实施方案中，所述HCV抗原包含HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a，基本上由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成，或由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成。在一些实施方案中，所述多种抗体是具有非天然发现的所述多种抗体的浓度和/或纯度的组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含具有附接至其的可检测标记的单克隆或多克隆抗体，所述单克隆或多克隆抗体特异性结合所述多种抗体。
在其中所述肝炎病毒抗原基本上由多种抗原例如HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成的实施方案中，短语“基本上由……组成”意指所述测定法、系统和试剂盒可包括可以是或可以不是肝炎病毒抗原的其它抗原的检测，只要所述其它抗原的检测不会不利地影响所述多种抗原(例如HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a)中的抗原的检测。
在本发明的实施方案中，结合于一种或多种抗体的一种或多种肝炎病毒抗原的检测可以是通过直接检测结合的肝炎病毒抗原本身或间接地通过检测一种或多种结合于所述肝炎病毒抗原的抗体。例如，特异性结合给定的肝炎病毒抗原的标记的抗体可用于直接检测所述给定的肝炎病毒抗原。或者，特异性结合结合于所述抗原的抗体的标记的抗体可用于间接检测。
前述一般描述和以下详细描述均只是示例性和解释性的，旨在提供所述的本发明的进一步解释。附图被包括来提供本发明的进一步理解并且被并入本说明书以及构成本说明书的部分，举例说明本发明的每一个实施方案，以及与描述一起用于解释本发明的原理。
附图简述
本发明通过参考附图来进一步理解，其中：
图1示意性地显示HCV多蛋白前体如何从HCV基因组翻译而来以及随后被切割成不同HCV结构和非结构蛋白。C：核心蛋白；E：包膜蛋白；NS：非结构蛋白。
图2是用于本文举例的LFT测定法免疫色谱条的示意图。A.样品垫；B.衬靶纸；C.缀合垫；D.缀合有胶体金颗粒的捕获抗体；E.硝酸纤维素膜；F.测试线；G.对照线；和H.吸收垫。
图3A是条形图，其显示在血清样品中，combo-HCV-Ag EIA测定(combo)相较于检测单独的HCVcAg(核心)的EIA测定，具有显著增加的OD值，和从而增加的灵敏度。这些测定还确认了在HCV感染过程中在血液样品中除了HCVcAg以外还存在HCV NS3、NS4b和NS5a抗原。阴性：使用对于抗-HCV呈阴性并且对于血清HCV RNA经PCR测定呈阴性的血清样本的阴性对照；S：经PCR测定为阳性血清HCV RNA的测试血清的样本。每一组中的第一条块是“核心”，每一组中的第二条块是“combo”。
图3B是条形图，其显示在尿样品中，combo-HCV-Ag EIA测定(combo)相较于检测单独的HCVcAg(核心)的EIA测定具有显著增加的OD值和从而增加的灵敏度。这些测定还确认了在HCV感染过程中在尿液样品中除了HCVcAg以外还存在HCV NS3、NS4b和NS5a抗原。阴性：使用经PCR测定为阴性抗-HCV和血清HCV RNA的尿样本的阴性对照；S：经PCR测定为阳性血清HCVRNA的测试尿样本。每一组中的第一条块是“核心”，每一组中的第二条块是“combo”。
图4是显示当测试血清样本时另外的HCVcAg mAb的添加提高了combo-HCV-Ag EIA测定(实施例2)的灵敏度的条形图。“1Core”＝使用一种HCVcAg mAb的用于单独的HCVcAg的EIA测定；“1Core+Combo”＝利用一种HCVcAg mAb+针对NS3、NS4b和NS5a的抗体的combo-HCV-Ag EIA测定；“2Core”＝使用第一HCVcAg mAb和第二HCVcAg mAb进行的单独的HCVcAg的EIA测定；和“2Core+Combo”＝使用第一HCVcAg mAb和第二HCVcAg mAb+针对NS3、NS4b和NS5a的抗体的combo-HCV-Ag EIA测定。PBS：使用PBS缓冲液；阴性对照：使用为阴性抗-HCV和经PCR测定为阴性血清HCV RNA的血清样本；样品：经PCR测定为阳性血清HCV RNA的测试血清样本。
图5，图A-D显示除了HCVcAg以外，利用变性预处理HCV RNA-阳性血清样本也增加通过HCVcAg(图A)、NS3(图B)、NS4b(图C)和NS5a(图D)的EIA测量的OD值或灵敏度。这些测定也确认了在HCV感染过程中含有所有这些HCV-Ag的每一种的免疫复合物在血液样品本的存在。处理的样品：利用变性预处理所述测试血清样品(S1-S3)(实施例2，利用步骤5)；非处理的样品：不预处理(实施例2，省略步骤5)所述测试血清样品(S1-S3)。
图6A是显示combo-HCV-Ag EIA测定在血清测试系列稀释物中的检测限(等同于经PCR测定的约188IU/mL的血清HCV RNA)的条形图。
图6B是显示combo-HCV-Ag EIA测定在另一血清样品测试系列稀释物中的的检测限(等同于经PCR测定的约328IU/mL的血清HCV RNA)的条形图。
图6C是显示combo-HCV-Ag EIA测定对于不同的HCV基因型的检测限(等同于经PCR测定的约250IU/mL的血清HCV RNA)的条形图。所述图代表来自被不同的HCV基因型感染的受试者的5个样品的平均值。
图7A是显示使用血清样品的combo-HCV-Ag EIA测定在121个测试的血清样本(包括38个对于血清HCV RNA经PCR测定呈阴性的样品和83个对于血清HCV RNA经PCR测定呈阳性(在94IU/mL至14,400,000IU/mL的范围内变化)的样品)中提供100％的敏感度和100％的特异度的表。
图7B显示通过combo HCV-Ag EIA测定的光密度测定的血清中的HCV-Ag水平与通过常规HCV RNA PCR测定的血清HCV RNA水平显著相关(r2＝0.812,p<0.01)。
图8A是显示使用尿样品的combo-HCV-Ag EIA测定在100个测试的尿样品(包括20个对于血清HCV RNA经PCR测定呈阴性的样品和80个对于血清HCV RNA经PCR测定呈阳性的样品(在62,000IU/mL至9,960,000IU/mL的范围内变化))中提供98.7％的灵敏度和100％的特异度的表。在100个测试的受试者中，一个假阴性由正在进行血液透析(HD)的终末期肾病(ESRD)受试者产生的。
图8B显示通过combo HCV-Ag EIA测定的光密度测定的尿样品中的HCV-Ag水平与通过常规HCV RNA PCR测定的血清HCV RNA水平显著相关(r2＝0.821,p<0.01)。
图9是概括15个对于血清抗-HCV呈阳性但对于血清HCV RNA经PCR测定呈阴性的个体的血清样本(顶部2行)和尿样本(底部2行)的combo HCV-AgEIA测试结果的表。如表中所示，在变性(方法I)后，6/15(40％)的这些血清样本显示阳性结果，但当变性步骤被省略(方法II)时，所有(100％)这些相同的样本显示阴性结果。这些结果表明使血清样本变性可从IC-HCV复合物释放IC-HCV抗原，并在这些个体中导致假阳性测试结果。然而，来自相同的15个个体的尿样本的变性导致100％的阴性测试结果，与相同样本的非变性完全一致。因此，变性与否将不影响使用尿样本的combo HCV-Ag EIA测试结果。
图10A是显示由混合测试(血清)样品与根据实施例5.5的检测抗体导致的combo-HCV-Ag EIA测定的灵敏度的意外增强的条形图。NC：使用对于抗-HCV呈阴性并且对于HCV RNA经PCR测定呈阴性的血清样本的阴性对照；2Core Abs：使用2种类型的抗-HCVcAg抗体用于EIA；Combo：combo HCV-AgEIA(实施例2)。基于测量的OD值，在与在其上具有捕获抗体的测定底物接触之前，将所述测试样品与检测抗体混合提供了相较于无混合的comboHCV-Ag EIA的约27％的灵敏度的提高；然而，根据实施例5.5的混合步骤相较于无所述混合步骤的相同方法使2core EIA的灵敏度提高了8％。
图10B是显示使用combo-HCV-Ag EIA测定在来自2个经PCR测定呈阳性血清HCV RNA的受试者的系列稀释的血清样本中进行的具有图10A中描述的混合步骤的HCV-Ag的检测的条形图。将样品与检测抗体混合在一起，随后与在其上具有捕获抗体的测定底物接触。NC：阴性对照，来自对于抗-HCV呈阴性并且对于HCV RNA经PCR测定呈阴性的受试者的血清样品。变性方法具有较高的OD，但两种方法具有可比较的检测限，例如等于血清HCVRNA 140IU/mL。
图10C是显示使用combo-HCV-Ag EIA测定在来自5个经PCR测定呈阳性的低血清HCV RNA的受试者的尿样本中进行的具有图10A中描述的混合步骤的HCV-Ag的检测的条形图。将样品与检测抗体混合在一起，随后与在其上具有捕获抗体的测定底物接触。NC：阴性对照，来自对于抗-HCV呈阴性并且对于血清HCV RNA经PCR测定呈阴性的受试者的尿样本。OD值指定的检测限等同于血清HCV RNA 63-94IU/mL。
图10D是显示来自2个来自经临床诊断患有急性丙型肝炎病毒感染的受试者，即对于HCV RNA经PCR测定呈阳性但对于抗-HCV抗体呈阴性的受试者的combo HCV-Ag EIA测试的结果的图。PBS：PBS阴性对照；NC：来自对于抗-HCV呈阴性并且对于HCV RNA经RT PCR测定呈阴性的血清样本的阴性对照。S1和S2：测试的具有急性HCV感染的血清样品1和2。S1和S2图指示在抗-HCV测试变成阳性(使用combo HCV-Ag EIA测试)之前59天(S2)和65天(S1)的阳性测试结果。因此，在抗-HCV抗体出现之前，根据本发明的combo HCV-Ag测定能够检测急性肝炎病毒感染。因此，根据本发明的游离肝炎病毒抗原的检测不依赖于受试者的免疫应答例如抗体形成的产生和/或存在。
图11A是LFT测定的测试条的图。图A)在LFT测试条中使用单独的HCVcAg不能检测任何阳性信号；图B)通过使用combo-HCV-Ag LFT测试条，特定的信号在血清样品中是可检测的，和图3)通过使用combo-HCV-Ag LFT测试条，特定信号在尿样品中是可检测的。这些测定也确认了在HCV感染过程中除了HCVcAg以外HCV NS3、NS4b和NS5a抗原也存在于血清和尿样品中。使用PCR，通过血清HCV RNA确定来自具有活动性HCV感染的受试者的样品。在每一个图中，条1：PBS缓冲液作为阴性对照；条2：对于抗-HCV测试为阳性但对于HCV RNA呈阴性的样品作为阴性对照；条3-5：活跃地HCV感染的样品。
图11B是使用尿样品的combo-HCV-Ag LFT测定的测试条的图，所述图显示将另外的针对HCVcAg的mAb添加至HCV-Ag LFT测试条进一步增加灵敏度。图A显示使用1种HCVcAg mAb+针对NS3、NS4b和NS5a的抗体的测试条；图B显示使用2种不同的HCVcAg mAb+针对NS3、NS4b和NS5a的抗体的测试条。在每一个图中，条C＝阴性对照，具有阴性抗-HCV并且对于血清HCV RNA经PCR测定呈阴性的尿样品；和条1-5分别是HCV基因型1、2、3、4和6。对于GT-5(未显示)显示类似的结果。
图12A是使用combo-HCV-Ag LFT测定的测试条的图，所述图显示根据实施例6.3，在添加至测试垫之前，将测试血清样品与胶体金溶液(缀合有胶体金的检测抗体)混合显著提高根据本发明的combo-HCV-Ag LFT测定对于血清测试样品的敏感度。
图12B显示使用具有根据实施例6.3的混合步骤的combo-HCV-Ag LFT测定测试的经PCR测定为低血清HCV RNA水平的5个血清样本的测试结果，combo HCV-Ag LFT的最低检测限在等于26-63IU/mL的血清HCV RNA水平的范围内。C：利用对于抗-HCV呈阴性并且对于血清HCV RNA经PCR测定呈阴性的血清样本的阴性对照。
图12C是显示使用血清样品的combo-HCV-Ag LFT测定在60个测试的血清样本(包括20个对于血清HCV RNA经PCR测定呈阴性的样本和40个对于血清HCV RNA经PCR测定呈阳性(在240IU/mL至1,740,000IU/mL的范围内变化)的样本)中提供100％的灵敏度和100％的特异度的表。
图13A是使用combo-HCV-Ag LFT测定的测试条的图，其显示在添加至测试垫之前将测试尿样品与胶体金溶液(缀合有胶体金的检测抗体)混合显著提高了根据本发明的combo-HCV-Ag LFT测定对于尿样品的灵敏度。
图13B显示使用combo-HCV-Ag LFT测定(5个具有低血清HCV RNA(经PCR测定)的样本的combo-HCV-Ag LFT测定)的测试结果，HCV-Ag LFT在尿样本中的最低检测限在等于63-94IU/mL的血清HCV RNA水平的范围内。C：利用对于抗-HCV呈阴性并且对于血清HCV RNA经PCR测定呈阴性的尿样本的阴性对照。
图13C是显示使用尿样品的combo-HCV-Ag EIA测定在93个测试的尿样本(包括15个对于血清HCV RNA经PCR测定呈阴性的样本和78个对于血清HCV RNA经PCR测定呈阳性(在570IU/mL至9,960,000IU/mL的范围内的变化)的样本)中提供100％的灵敏度和100％的特异度。
图14A是显示使用来自5个对于血清HBsAg呈阳性的受试者(#1-5)和阴性对照(#6)的尿样本的具有根据实施例5.5的混合步骤的combo HBsAgEIA测定的OD值的图。对于样品1-5，第一条块是使用一种针对HBsAg的抗体的结果，第二条块是使用两种不同的针对HBsAg的抗体的结果。阴性对照，具有阴性血清HBsAg测试的尿样本。
图14B是使用一种针对HBsAg的抗体(利用“a”标记的条)和使用两种不同的针对HBsAg的抗体(利用“b”标记的条)的，来自6个具有阳性HBsAg的受试者的具有根据实施例6.3的混合步骤的尿样品的LFT测试条。NC，具有阴性血清HBsAg测试的阴性对照尿样本。
发明详述
如图1中所示，在HCV复制和生命周期中，大的HCV前体蛋白被翻译和用于产生各种HCV蛋白，包括结构(包膜和核蛋白)和非结构(NS)蛋白。这些蛋白中的一些是高度保守的和具有抗原性的，因为它们的对应抗体在已被HCV感染的受试者中，甚至在感染被清除后，是可检测的。
如本文所公开的，除了HCV核心抗原(HCVcAg)以外，还发现几种其它HCV蛋白，包括高度保守的HCV非结构(HCV NS)蛋白，例如NS3、NS4b和NS5a在具有活动性HCV感染的受试者，例如对于血清HCV RNA使用PCR测定呈阳性的受试者的血液和尿中持续地表达为游离HCV抗原。如本文所用，“游离抗原”是指还未成为受试者的天然免疫复合物的部分，例如，还未被由给定的受试者的免疫应答产生的抗体结合的抗原。术语“游离肝炎病毒抗原”是指还未成为受试者的免疫复合物的部分的肝炎病毒抗原。术语“游离HCV抗原”是指还未成为受试者的免疫复合物的HCV抗原。如本文所用，“IC复合物”是指抗原与由受试者的免疫应答产生的一种或多种抗体之间的复合物。“IC-HCV复合物”是指HCV抗原与由受试者的免疫应答产生的一种或多种抗体之间的HCV抗原免疫复合物。为方便起见，如本文中公开的，为和/或曾为受试者的免疫复合物的的HCV抗原将被称为“IC-HCV抗原”。IC-HCV抗原包括仍然为IC复合物的部分的HCV抗原和已通过非天然条件(例如使IC-HCV复合物变性的实验室测定法)从IC-HCV复合物解离(或释放)的那些HCV抗原。如本文所用，“总的HCV抗原”是指任何游离HCV抗原的总量加上任何IC-HCV抗原的总量。可在来自具有活动性HCV感染(即，对于HCV RNA经PCR测定呈阳性的)的受试者和曾具有过去的但被清除的HCV感染(即，对于HCV RNA经PCR测定呈阴性的)的受试者的样品(除尿外)中发现IC-HCV抗原。在来自具有活动性HCV发的受试者的样品(包括血液和尿)的样品中发现游离HCV抗原。
本发明涉及用于检测多种作为游离肝炎病毒抗原和/或IC-肝炎病毒抗原的肝炎病毒抗原在样品中的存在的测定法、系统和试剂盒。在一些实施方案中，本发明涉及用于检测多种游离HCV抗原和/或多种IC-HCV抗原在样品中的存在的测定法、系统和试剂盒。在一些实施方案中，同时检测和/或在同一测定步骤中检测所述HCV抗原。所述样品可以是生物样品诸如全血、血清、血浆、尿或其中可发现游离HCV抗原和/或IC-HCV抗原的其它体液或组织或合成样品，例如用于对照实验的实验室制造的样品。在一些实施方案中，所述样品是尿样品。
合适的HCV抗原包括HCVcAg、HCV E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b蛋白。在一些实施方案中，检测多种总的HCV抗原(即，游离HCV抗原加上IC-HCV抗原)。所述多种HCV抗原中的HCV抗原可以是游离HCV抗原和/或IC-HCV抗原。在一些实施方案中，只检测多种游离的HCV抗原。如本文所用，对“多种游离HCV抗原”的特定HCV抗原的提及，甚至在未明确地指定每一种HCV为游离HCV抗原的情况下，意指所述多种HCV抗原的每一种提及的HCV抗原是游离HCV抗原。在一些实施方案中，所述多种游离或总的HCV抗原包括HCVcAg。在一些实施方案中，所述多种游离或总的HCV抗原包含HCVcAg和E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b蛋白的一种或多种。在一些实施方案中，所述多种游离或总的HCV抗原包含HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a蛋白。在一些实施方案中，所述多种游离或总的HCV抗原由HCVcAg、HCV NS3、NS4b和NS5a蛋白组成。
如本文中提供的，术语“combo-HCV-Ag”结合测定法、系统或试剂盒的使用是指本发明的测定法、系统或试剂盒(例如，其中检测多种游离或总的HCV抗原的测定法)。因此，例如，“combo-HCV-Ag测定法”是指其中检测多种游离或总的HCV抗原的测定法。本发明的测定法的测定平台可以是任何免疫测定，包括本领域中知的酶免疫测定(EIA)、基于微量板的免疫测定(MIA)、化学发光免疫测定(CIA)、荧光免疫测定(FIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)或侧流测试(LFT)，并且可以是自动化的或手工的。各种测定法可使用任何合适的标记和检测系统。如本文所用，“可检测标记”是可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学装置检测的化合物或组合物。“标记的”用于修饰物质的用途，例如标记的抗体，意指所述物质具有添加至其的可检测标记。具有可检测标记的物质例如抗体意指通常不连接于或缀合于所述物质的可检测标记已通过人的手连接或缀合于所述物质。如本文所用，短语“通过人的手”意指人或在人的指导下的物体(例如，由人操作或编程的机器人或机器)，非其本身天然地，已进行指定的行动。因此，权利要求中所示的步骤通过人的手(例如人或在人指导下的物体)来进行。
如本文中公开的，根据本发明的combo-HCV-Ag测定导致相较于其中仅检测一种HCV抗原的测定的灵敏度的显著提高。因此，在一些实施方案中，本发明涉及用于将受试者诊断为具有或已具有HCV感染的受试者的测定法、系统和试剂盒，其包括检测多种HCV抗原在获自受试者的样品中的存在(或不存在)，和将受试者诊断为具有或已具有其中所述多种HCV抗原存在的HCV感染。
另外，如本文中公开的，将待测试的受试者经历使IC-HCV复合物解离的条件，例如变性条件导致提高的测定灵敏度。事实上，如本文中所示，在检测之前将测试样品经历变性条件导致100％的灵敏度。基于以下实验的结果，据信仍然为免疫复合物的部分的IC-HCV抗原不容易被添加至其的另外的抗体例如检测抗体检测到或结合，这可能是因为结合位点被免疫复合物的抗体占据。因此，在一些实施方案中，在检测之前将待测试的样品经历使IC-HCV复合物解离的变性条件。此类变性条件包括在约56℃下利用具有约0.3％Triton X-100、约1.5％3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)和约15％十二烷基硫酸钠(SDS)的pH约8.5的变性溶液预处理血清样本约30分钟。产生类似作用的条件可由本领域技术人员来容易地确定并且包括在本文中。
如本文中所公开的，HCV抗原可仍然作为IC-HCV复合物存在于已清除HCV感染的受试者，例如对于抗-HCV抗体经测试呈阳性并且对于HCV RNA使用PCR测定呈阴性的受试者的血液中。因此，在检测之前将可具有IC-HCV复合物的样品经历变性条件可在已具有过去的但已被清除的HCV感染的受试者中导致活动性HCV感染的假阳性。因此，在一些实施方案中，为了避免检测IC-HCV抗原，本发明的方法在检测之前不将待测试的样品经历使HCV抗原与IC-HCV复合物解离的变性条件。换句话说，当要避免变性的IC-HCV抗原的检测时，本发明的方法不包括在检测之前使可存在于样品中的IC-HCV复合物变性。或者，用另一种方式来讲，本发明的此类方法在检测之前避免使HCV抗原与IC-HCV复合物解离的条件。
如本文中所公开的，使用根据本发明的combo-HCV-Ag测定法检测未曾经历变性条件(例如，使IC复合物解离的条件)的样品中的多种游离HCV抗原导致在等同于使用HCV RNA PCR检测到的血清HCV RNA 140IU/mL的水平的活动性HCV感染的检测。换句话说，不包括变性条件的本发明的combo-HCV-Ag测定法对于检测活动性HCV感染具有可与血清HCV RNA的PCR测定相比较的灵敏度和特异度。因此，在一些实施方案中，本发明涉及用于将受试者诊断为具有活动性HCV感染的测定法、系统和试剂盒，其包括检测多种游离HCV抗原在获自受试者的样品(其还未经历变性条件)中的存在(或不存在)，并且当存在所述多种游离HCV抗原时，将所述受试者诊断为具有活动性HCV感染。
如本文中所公开的，HCV抗原在对于血清HCV RNA使用PCR测定呈阳的受试者的尿样品中是可检测的，但在对于血清HCV RNA使用PCR测定呈阴性的受试者的尿样品中是不可检测的。另外，IC-HCV复合物不存在于尿样品中，因为在检测之前使所述尿样品变性不产生来自曾具有过去的但被清除的HCV感染的受试者的，对于任何HCV抗原(游离或总的HCV抗原)经测试呈阳性的尿样品。因此，在一些实施方案中，来自受试者的尿样品可用于只检测游离HCV抗原的存在或不存在。随后当检测到游离HCV抗原存在于尿样品中时，可将所述受试者诊断为具有活动性HCV感染，或当在尿样品中未检测到游离HCV抗原时，可将所述受试者诊断为不具有活动性HCV感染。
如本文中所示，使用两种不同的抗体检测给定的单一抗原导致测定灵敏度和特异度的预料之外的优良提高。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于检测肝炎病毒抗原的测定法、系统和试剂盒，其包括使用两种或更多种不同的针对相同肝炎病毒抗原的抗体。在一些实施方案中，使用两种或更多种不同的针对相同肝炎病毒抗原的抗体的测定法、系统和试剂盒是如本文中公开的combo-HCV-Ag测定法、系统或试剂盒。
如本文中所述，当将针对所述多种HCV抗原的检测抗体与待测试的样品混合在一起和孵育时，所述combo-HCV-Ag测试的灵敏度得以显著提高。因此，在一些实施方案中，本发明提供了其中在与在其上涂覆或固定有捕获抗体的测定底物接触之前，将所述测试样品与所述检测抗体混合在一起的免疫测定法。
如图10D中所示，游离肝炎病毒抗原的检测不依赖于受试者的免疫应答例如抗体形成的产生和/或存在。与检测或测量针对肝炎抗体的抗体的测定法不同，根据本发明的combo HCV-Ag测定法可用于在抗-HCV抗体出现之前检测急性肝炎病毒感染。因此，在一些实施方案中，本发明涉及在受试者产生针对所述肝炎病毒的抗体之前，检测受试者的急性肝炎病毒感染、将受试者诊断为具有急性肝炎病毒感染，或两者的方法。
还可通过优化测定条件(例如反应时间和温度)，和/或修饰或替换试剂，例如使用不同的检测和标记系统(使用本领域中已知的方法使用的)进一步提高根据本发明的测定法、系统和试剂盒的灵敏度和特异度。
总之，本发明提供了用于一种或多种肝炎病毒抗原的基于免疫的测定法、系统和试剂盒，其中(1)在同一检测步骤中同时使用两种或更多种针对给定的单一肝炎病毒抗原的抗体，(2)在同一检测步骤中同时检测多种肝炎病毒抗原，(3)在与具有捕获抗体的测定底物接触之前将针对所述肝炎病毒抗原的检测抗体与样品混合，(4)只检测游离肝炎病毒抗原，和/或(5)检测总的肝炎病毒抗原。
除了用于科学和临床研究以外，本发明的测定法和系统还可用于(1)筛查游离肝炎病毒抗原在受试者中的存在，其存在可用于将受试者诊断为具有活动性肝炎病毒感染；(2)仅使用一种测试方法区分正在进行的活动性肝炎病毒感染与已解决的过去的HCV感染/暴露而无需对肝炎病毒RNA的确认PCR测试；(3)在感染的早期阶段，例如特征在于游离肝炎病毒抗原的存在和抗-肝炎病毒抗体和/或肝炎病毒抗原免疫复合物的不存在的血清转换前窗口期鉴定活动性肝炎病毒感染；(4)鉴定免疫受损并且不能产生抗肝炎病毒抗体的个体，诸如正在进行免疫抑制治疗或血液透析的受试者的肝炎病毒感染；(5)监测肝炎病毒RNA水平，例如，使用一定量的游离肝炎病毒抗原作为肝炎病毒RNA水平的指示；和(6)监测治疗对受试者的肝炎病毒感染的作用。
由于本发明的一些实施方案可通过单一步骤(例如将测试样品加载在LFT测试条上以检测肝炎病毒抗原的存在)来进行，因此此类测定法、系统和试剂盒是具有成本效益的，方便的，节省时间的，可承受的，并且可在实验室中进行或由医生在诊所和由受试者在家中现场进行。
以下实施例旨在举例说明而非限制本发明。
实施例
材料
本文中的实施例中举例的单克隆抗体(mAb)和多克隆抗体(pAb)示于如下的表A中：
方法
实施例1-HCV RNA PCR
如本文中公开的，使用本领域中已知的聚合酶链式反应(PCR)法测定血清HCV RNA的存在。具体地，使用RocheAmpliPrep/HCV测定法(其具有43IU/mL的检测下限和100IU/mL的定量限)(RocheMolecular Diagnostics,Pleasanton,CA)，或使用Abbott RealTime HCV测定法(其具有12IU/mL的检测下限和定量限)(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)通过实时聚合酶链式反应(PCR)定量血清HCV RNA。
实施例2–EIA方案
除非另外指出，否则将以下方案用于本文中公开的EIA实验。
步骤1.测定底物的涂覆。将96孔PVC微量板用作测定底物，然而可使用本领域中已知的其它底物例如测定珠粒。用足够量50-200μL，例如约100μL的用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH约7.0-9.5，例如约9.0)稀释的捕获抗体涂覆微量滴定板的每一个测试孔。所述捕获抗体是针对HCVcAg-1(约5-20μg/mL，例如约10μg/mL)、HCVcAg-2(约5-20μg/mL，例如约10μg/mL)、NS3(约5-20μg/mL，例如约5μg/mL)、NS4b(约5-20μg/mL，例如约5μg/mL)和NS5a(约5-20μg/mL，例如约5μg/mL)的的单克隆抗体的混合物。
步骤2.孵育。覆盖来自步骤1的微量滴定板，并将其在4℃下孵育过夜(或在37℃下孵育约15-120分钟，例如约60分钟)。
步骤3.洗涤。在步骤2后，通过用约100-400μL，例如约300μL的TBS-T溶液(洗涤溶液)充满每一个孔并在洗涤槽上方轻轻敲打板来洗涤微量滴定板3次。随后通过用纸巾拍打板来除去剩余的洗涤液。
步骤4.封闭非特异性结合。随后通过添加约150-300μL，例如约300μL的含有约1-5％，例如约3％的BSA的封闭缓冲液来处理每一个孔。随后将板在室温孵育约15-90分钟，例如约60分钟，来封闭涂覆的孔中的剩余的蛋白质结合位点。
任选的步骤5.测试样品的预处理。当例如对血清或血浆样品进行时，将约25-150μL，例如约100μL的测试样品与约50-200μL，例如约50μL的预处理溶液(0.3％Triton X-100，1.5％的3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)和15％的十二烷基硫酸钠(SDS))在1.5mL离心管中混合，随后在56℃孵育约30-60分钟，例如约60分钟。
步骤6.血清/血浆或尿样本加载。在从微量滴定板的每一个孔除去封闭缓冲液后，将约50-300μL，例如约100μL的预处理的血清或血浆样品或约50-300μL，例如约100μL的未处理的尿样品添加至每一个孔。随后覆盖板，并将其在轻轻搅拌的条件下于室温孵育约30-120分钟，例如约90分钟。
步骤7.洗涤。随后通过用约150-300μL，例如约300μL的TBS-T溶液充满每一个孔，并在洗涤槽上方轻轻敲打板来洗涤孔3次。随后通过用纸巾拍打板来除去剩余的洗涤液。
步骤8.加载检测抗体。在步骤7后，将约50-300μL，例如约100μL的检测抗体添加至每一个测试孔。对于根据本发明的combo-HCV-Ag测定法，所述第一检测抗体为针对HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a的多克隆抗体的混合物。对于根据现有技术的测定法，所述检测抗体仅由抗-HCVcAg抗体组成。随后覆盖微量滴定板，并将其在轻轻搅拌的条件下于室温孵育约30-120分钟，例如约90分钟。
步骤9.洗涤。为了除去未结合的检测抗体，通过用约150-300μL，例如约300μL的TBS-T溶液充满每一个孔，并在洗涤槽上方轻轻敲打板来洗涤孔3次。随后通过用纸巾拍打板来除去剩余的洗涤液。
步骤10.加载缀合有HRP的抗体。将约50-300μL，例如约100μL的特异性针对所述检测抗体的种类的缀合有HRP的IgG抗体添加至每一个测试孔。在即将使用时，将缀合有HRP的IgG抗体在封闭缓冲液中稀释至1:3000-1:5000，例如约1:4000的稀释度的浓度。随后覆盖板，并将其在室温下孵育约15-90分钟，例如约30分钟。
步骤11.洗涤。为了除去未结合的检测抗体，通过用约150-300μL，例如约300μL的TBS-T溶液充满每一个孔，并在洗涤槽上方轻轻敲打板来洗涤孔3次。随后通过用纸巾拍打板来除去剩余的洗涤液。
步骤12.显色反应。将约50-300μL，例如约100μL的底物溶液(OPD)添加至每一个测试孔，并在室温下孵育约5-30分钟，通常约15分钟，随后添加约25-50μL，例如约50μL的终止溶液来终止酶促反应。
使用450nm作为主波长在ELX 800通用微量板读数器(Bio-TEKInstruments,Inc.,Winooski,VT)上测量光密度。通过平均阴性OD值加上3x标准偏差(SD)来测定截止值。如果测试的OD值>截止值，则测试结果被认为是阳性的；如果测试的OD值<截止值，则测试结果被认为是阴性的；如果测试的OD值＝截止值，则测试结果被认为是模棱两可的。
实施例3–LFT方案
A.测试条
如图2中所示，本文的实施方案中举例说明的LFT测试条包含以下组分：A＝样品垫，B＝衬靶纸，C＝缀合垫，D＝缀合有胶体金颗粒的捕获抗体，E＝硝酸纤维素膜，F＝测试线，G＝对照线，H＝吸收垫。除非另外指出，否则如下构建测试条。然而，可按照本发明使用本领域中已知的其它测试条、浸渍片等。因此，术语"测试条”在本文中一般指用于LFT测定法的测定底物，其具有将测试样品加载至其中，随后流过如具有下述捕获抗体的测试线和对照线的样品垫。虽然本文中的LFT实验举例说明了胶体金标记系统的用途，但也可使用本领域中已知的其它标记系统。
步骤1.检测抗体的胶体金缀合。利用0.2M的碳酸钾将待使用的胶体金溶液的pH值调整至约7.4-9.0，例如约8.5。对于仅检测HCVcAg本身的测定，将针对HCVcAg的单克隆抗体与胶体金溶液在5.4mL的总体积中混合以产生约5-20μg/mL，例如约10μg/mL的浓度。对于根据本发明的combo-HCV-Ag测定，随后将针对HCVcAg-1、HCVcAg-2、NS3、Ns4b和NS5a的单克隆或多克隆IgG抗体与胶体金溶液在5.4mL的总体积中混合。这些抗HCV抗体的每一种的浓度为约5-20μg/mL，例如约10μg/mL。在于室温下强力搅拌混合物约15-60分钟，例如约30分钟后，添加0.6mL的约5-20％，例如约10％的BSA(pH 9.0)以阻断金胶体的过度反应性。随后在室温下将混合物搅拌约15-60分钟，例如约30分钟。随后在4℃以12,000rpm离心混合物约15-60分钟，例如约30分钟，将所得的缀合的沉淀重悬浮，并用2mM硼砂缓冲液(pH 9.0，含有约1-5％，例如约1％的BSA)洗涤2次。在以1:100稀释缀合物后，调整OD值以在540nM的波长下达到10±0.5。将沉淀重悬浮于硼砂缓冲液(约1-5mM，例如约2mM,pH 9.0，含有20％的蔗糖和约1-5％，例如约1％的BSA)中，并于4℃下保存，直到使用。
步骤2.缀合垫的处理。在室温下用约10-50mM，例如约20mM的磷酸盐缓冲液(含有约1-5％，例如约3％的BSA，约0.5-5％，例如约1％的Tween20，约0.1-1.5％，例如约0.3％的聚乙烯吡咯烷酮K30和约0.02％的叠氮化钠(约7.0-8.0，例如约7.4的pH))处理缀合垫(图2“C”)，持续约5-60分钟，例如约10分钟，随后在37℃下干燥约15-60分钟，例如约30分钟。
步骤3.将缀合有胶体金的检测抗体添加至经处理的缀合垫。如图2“D”中所示的，随后使用BioDot XYZ平台(BioDot,Irvine,CA)以约10-30μL/cm，例如约10μL/cm的速率将步骤1中缀合有胶体金颗粒的HCV-Ag特异性检测抗体分配至经处理的缀合垫(于步骤2中制备的)，随后在37℃干燥约15-60分钟，例如约30分钟。
步骤4.将对于HCV抗原是特异的捕获抗体加载至测试线。以约0.1-2μL/cm，例如约0.9μL/cm的速率和约2-10cm/秒，例如约4cm/秒的速度将约0.5-2mg/mL，例如约1mg/mL的捕获抗体分配至硝酸纤维素膜上的测试线。对于根据本发明的combo-HCV-Ag测定，所述捕获抗体是对于HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a是特异的单克隆捕获抗体或多克隆抗体的混合物。对于仅检测HCVcAg的测定，所述捕获抗体仅由针对HCVcAg的抗体组成。
步骤5.将对于小鼠IgG是特异性的捕获抗体加载至对照线。如图2“G”中所示，以约0.1-2μL/cm，例如约0.9μL/cm的速率，和约2-10cm/秒，例如约4cm/秒的速度将约0.5-2mg/mL，例如约1mg/mL的对于小鼠IgG是特异性的多克隆捕获抗体分配至硝酸纤维素膜上的对照线，随后在37℃下干燥约15-90分钟，例如约30分钟。
步骤6.组装侧流条。随后将吸收垫(图2“H”)、硝酸纤维素膜(如步骤4和5中处理的，图2“E”)、缀合垫(如步骤3中处理的，图2“C”)和样品垫(图2“A”)在衬靶纸上组装为测试条(图2“B:)，随后以1-2mm的重叠连续地将其附接于塑料底板。使用CM 4000切割器(BioDot,Irvine,CA)将所述组装的板切成约2-10mm，例如约3mm的宽的小片。将所产生的测试条包装在具有干燥剂的塑料袋中，并于4℃或室温下贮存以用于实验。
B.LFT测定方案
将稀释的测试的样品(约100-300μL，例如约250μL)或阴性对照(例如，PBS溶液，或来自不具有HCV感染(如通过PCR测定的)的受试者的样品)添加至样品垫，并在室温下放置约5-45分钟，通常约15分钟。
在将测试样本添加至样品垫(图2“A”)后，其快速扩散至缀合垫(图2“C”)中。如果测试的样品含有给定的HCV抗原，所述抗原将与缀合于胶体金颗粒的HCV检测单克隆抗体反应，并将其加载在图2“D”区域。这些HCV Ag/Ab复合物将通过毛细管作用色析法地沿着硝酸纤维素膜移动(图2“E”)。最后，这些HCV Ag/Ab复合物将与预加载的HCV特异性捕获单克隆或多克隆抗体反应，并固定在测试线区域以形成指示阳性测试结果的有色条带(图2“F”)。所述过量的HCV特异性检测抗体缀合物(或未反应的，当测试的样本不含HCV-Ag时)将沿膜迁移，并被预加载的山羊抗-小鼠抗体固定在对照线区域，并在对照线上产生有色的条带(图2“G”)。因此，阳性样品将显示两个条带，一个条带在测试线区域并且一个条带在对照线区域，同时阴性样品在对照线区域将只显示一个条带。
因此，如果在测试线和对照线上均存在有色的线，则所述测试样品被认为对于给定的HCV抗原是阳性的。如果在测试线区域上不存在有色的线，则所述测试的样品被认为对于给定的HCV抗原是阴性的。然而，如果在对照线区域不存在有色的线，则所述测试结果被认为是无效的。
实施例4–样品中的HCV抗原的检测
4.1血液样品
为了确定除了HCVcAg以外，HCV抗原是否存在于具有活动性HCV感染的受试者的血清样品中，进行以下实验。具体地，如实施例1中所示，测试获自对于血清HCV RNA测试为阳性的受试者的血清样品。
免疫印迹显示HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a存在于具有所有6种HCV基因型的活动性HCV感染的受试者的血清样品中(数据未显示)。
4.2尿样品
为了确定HCV抗原是否存在于具有活动性HCV感染的受试者的尿样品中，进行以下实验。具体地，收集从对于血清HCV RNA经测试呈阳性的受试者随机获得的尿样品，并将其于-80℃下贮存直至使用。
免疫印迹显示HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a存在于具有所有6种HCV基因型的活动性HCV感染的受试者的尿样品中(数据未显示)。因为IC-HCV复合物不存在于尿中，因此存在于尿中的HCV抗原均为游离HCV抗原。
实施例5–EIA实验
5.1血清样品
为了确定在一个样品中同时检测多种HCV抗原是否是可行的和将提供足够的对于HCV感染的灵敏度和特异度，使用具有步骤5的实施例2的EIA方案测试来自对于血清HCV RNA经测试呈阳性的受试者的血清和尿样品，然而对于仅检测HCVcAg的测定，只将针对HCVcAg的单克隆抗体涂覆在测定底物上，对于combo-HCV-Ag测定，涂覆在测定底物上的捕获抗体包括针对HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a的单克隆抗体。
图3A和3B中提供的数据显示单个EIA测定系统(例如，combo-HCV-AgEIA测定)中的多种HCV抗原的组合检测对于血清样品是可行的。另外，如图3A中提供的，所述combo-HCV-Ag EIA测定的灵敏度几乎为其中仅检测一种HCV抗原例如HCVcAg的EIA测定的灵敏性的2倍。
使用测定两个具有已知量的血清HCV RNA的血清样品的系列稀释物(如通过PCR测定的)的具有步骤5的实施例2的EIA方案，测定combo-HCV-AgEIA测定法的检测限。用PBS稀释样品。将PBS和来自对于活动性HCV感染经测试呈阴性(即，对于抗-HCV呈阴性并且对于HCV RNA经PCR测定呈阴性的)的受试者的血清样品用作阴性对照。未稀释的血清(对照)具有47,000或82,000IU/mL的基线HCV RNA。如图6A和6B中所示，HCV抗原在1:250的稀释度(等同于等于188IU/mL和328IU/mL的血清HCV RNA)上仍然是可检测的。
为了确定检测限是否不依赖于HCV基因型，类似地测定具有已知量的每一种HCV基因型的血清HCV RNA的血清样品的系列稀释物。图6C代表获得的每一种基因型的结果，并且显示所述combo-HCV-Ag EIA测定法能够具有对应于低至250IU/mL的血清HCV RNA水平的检测下限以及不依赖于HCV基因型。图7A是显示使用血清样品的combo-HCV-Ag EIA测定法提供100％的灵敏度和100％的特异度的表。
如图7B中所示，使用combo-HCV-Ag EIA测定系统针对血清样品测定的光密度(OD)值对应于通过HCV RNA PCR测定的血清HCV RNA量(r2＝0.812,p<0.01)。
5.2尿样品
除进行无步骤5的实施例2的EIA方案外，对尿样品进行与上述5.1中所示那些实验类似的实验。如图8A中所示，通过使用尿样品，所述combo-HCV-Ag EIA测定法具有98.7％的灵敏度和100％的特异度。在100个测试的受试者当中，一个假阴性由正在进行血液透析(HD)的终末期肾病(ESRD)受试者产生。如图8B中所示，通过combo HCV-Ag EIA测定法的光密度测定的尿样品中的HCV-Ag水平与通过HCV RNA PCR测定的血清HCV RNA水平显著相关(r2＝0.821,p<0.01)。
5.3血清测试样品的预处理
可预处理血清样品以使HCV抗原从IC-HCV复合物解离。按照具有步骤5(方法I，变性的)的实施例2测定来自15个已知对于抗-HCV呈阳性，但对于血清HCV RNA呈阴性的受试者(例如，具有过去的HCV感染且无活动性HCV感染的受试者)的血清样品的结果，将该结果与按照无步骤5(方法II，非变性的)的实施例2测定的来自相同的15个受试者的血清样品的结果相比较。如图9中所示，使血清样品变性(方法I)在6/15(40％)的所测试的血清样品中导致阳性测试结果。这些数据表明，IC-HCV抗原可存在于已具有先前的但已被解决的HCV感染的受试者的血液中。由于这些受试者不具有活动性HCV感染，因此这些阳性测试结果是假阳性。在另一方面，如图9中所示，使来自相同的15个受试者的尿样本变性不导致此类假阳性结果，因为IC-HCV抗原不存在于尿样本中。
因此，当想要检测总的肝炎病毒抗原(例如，人们不必只检测游离肝炎病毒抗原，或区分游离肝炎病毒抗原与IC-肝炎病毒抗原)时，可通过在检测之前将待测试的样品经历变性条件来提高测定灵敏度。应当指出的是，由于尿样品不含肝炎病毒免疫复合物，因此将尿样品经历变性条件将不提高测定的灵敏度。
在另一方面，当想要仅检测游离肝炎病毒抗原(例如，将不检测IC-肝炎病毒抗原)例如以将受试者诊断为具有活动性肝炎病毒感染时，可通过测试其中免疫复合物通常未被发现(例如，尿样品)的样品或在检测之前不将可含有IC-肝炎病毒抗原的样品经历变性条件来提高测定特异度。
在一些情况下，可能期望测定受试者中的游离肝炎病毒抗原和总的肝炎病毒抗原。例如，在具有正在进行的HCV感染的受试者中，将游离HCV抗原的量与总的HCV抗原的量相比较以区分受试者的临床表现和监测受试者的免疫应答、临床过程和治疗反应。例如，受试者中IC-HCV抗原的量的增加和游离HCV抗原的量的减少可表明，例如，有利的HCV清除的增强、减少的肝损伤的概率、不同的对HCV治疗的反应和/或减少的患其它临床并发症的风险。在另一方面，受试者中IC-HCV抗原的量的减少和游离HCV抗原的量的增加可表明，例如，对受试者的清除HCV感染的能力的正或负影响，或受试者的免疫系统已被削弱。
5.4使用两种不同的抗体检测HCVcAg
为了测定第二HCVcAg检测抗体的添加是否可进一步增强combo-HCV-AgEIA的测定灵敏度(其中所述多种待检测的游离HCV抗原包括HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a)，使用具有步骤5的实施列2的EIA方案和第二抗-HCVcAg检测抗体测试来自对于HCV RNA经测试呈阳性的受试者的样品。如图4的条形图中所示，所述第二抗-HCVcAg检测抗体至用于血清样本的combo-HCV-AgEIA测定法(实施例2)的添加增强了测定灵敏度(2Core+Combo对比1Core+Combo)，并且优于使用两种不同的对于HCVcAg是特异的抗体仅测量HCVcAg的EIA测定(2Core+Combo对比2Core)。
因此，在一些实施方案中，将不止一种针对相同抗原的抗体例如第二抗体用于本发明的combo-HCV-Ag EIA测定法、系统和试剂盒。在一些实施方案中，所述第一抗体和所述第二抗体均为单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体为单克隆抗体并且所述第二抗体为多克隆抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体和所述第二抗体为捕获抗体、检测抗体或两者。在一些实施方案中，所述第一抗体和和第二抗体特异性结合选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组的抗原。在一些实施方案中，所述第一抗体和第二抗体特异性结合HCVcAg。在一些实施方案中，将第二组针对第二抗原的第一抗体和第二抗体用于本发明的combo-HCV-Ag EIA测定法、系统和试剂盒。如本文中所用，特异性结合给定的抗原的抗体是针对给定的抗原产生的或相对于其它抗原优先结合所述给定的抗原的抗体。
5.5将检测抗体与测试样品混合
为了确定是否可将所有针对所述多种HCV抗原的检测抗体与待测试的样品混合在一起并孵育，使用具有以下改进的实施例2的EIA方案(具有或不具有步骤5)测试对于HCV RNA经测试呈阳性的受试者的血清和尿样品：利用充足量50-200μL，例如约100μL的在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH约7.0-9.5，例如约9.0)中稀释的捕获抗体例如抗-小鼠IgG抗体涂覆微量滴定板的测试孔，而非如步骤1中所述，涂覆抗-HCV特异性抗体。浓度为约0.5-1.5μg/mL，例如约1.0μg/mL。将温量滴定板于4℃孵育过夜(或于37℃孵育约15-120分钟，例如约60分钟)。随后，在加载至测试孔之前，将待测试的样品与针对HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a(例如，包含两种不同的HCVcAg mAb，和针对NS3、NS4b和NS5a的多克隆抗体)的第一和第二检测抗体混合。简言之，将约25-150μL，例如约100μL的测试样品(血浆或尿)与所有检测抗体(各自的浓度为约5-20μg/mL，例如约10μg/mL)混合至总共约100-300μL，例如约250μL的终体积。在从测试孔除去封闭缓冲液后，将所述测试混合物(与所述检测抗体混合的测试样品)以约150-300μL，例如约250μL的体积添加至在其上具有捕获抗体的测试孔。
如图10A所示，将所有抗体与测试样品混合在一起并进行孵育显著地增强了测定灵敏度，并使测试时间缩短约30分钟。因此，本发明还提供了EIA测定方法，其中将所述测试样品与检测抗体混合，随后将所述混合物添加至在其上涂覆或固定有捕获抗体的测定底物。在一些实施方案中，本发明的combo-HCV-Ag EIA测定方法包括将测试样品和检测抗体混合，随后将所述混合物添加至在其上涂覆或固定有捕获抗体的测定底物而非分开地加载测试样品和随后检测抗体。在一些实施方案中，本发明提供了用于进行EIA测定法的试剂盒。所述试剂盒包含含有多种抗体(其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种HCV抗原中的HCV抗原)的容器、包含检测试剂的容器和可在其中混合所述多种抗体、所述检测试剂和待测试的样品的容器，以及具有涂覆或固定在其上的特异性结合所述多种HCV抗原的捕获试剂的底物。在一些实施方案中，用于混合的容器是具有所述多种抗体的容器或具有所述检测试剂的容器。
使用两个具有已知量的HCV RNA的血清样品的系列稀释物测定该combo-HCV-Ag EIA测定法的检测限，在所述combo-HCV-Ag EIA测定法中，可在与在其上涂覆有捕获抗体(抗-小鼠IgG抗体)的测定底物接触之前，将测试样品与所有检测抗体混合。将对于抗-HCV呈阴性并且对于HCV RNA经PCR测定呈阴性的血清样品用作阴性对照。未稀释的血清(对照)具有1、124-1、140IU/mL的基线血清HCV RNA。如图10B中所示，HCV抗原在至等于约140IU/mL的血清HCV RNA的稀释度上仍然是可检测的，无论是否按照实施例2的步骤5使样品变性(对变性的样品，OD值较高，但对于变性与非变性的样品检测限相当)。
类似地，通过RT PCR，使用5个具有已知量的血清HCV RNA的受试者的尿样品的系列稀释物测定combo-HCV-Ag EIA测定法的检测限，在所述combo-HCV-Ag EIA测定法中，可在与在其上涂覆有捕获抗体(抗-小鼠IgG抗体)的测定底物接触之前，将尿测试样品与所有检测抗体混合。将对于抗-HCV经测试呈阴性并且对于HCV RNA经PCR测定呈阴性的受试者的尿样品用作阴性对照。如图10C中所示，检测限在等同于约63-94IU/mL的血清HCV RNA的范围内。
实施例6–LFT实验
尽管本文中举例的所有LFT实验仅检测游离抗原(因为在检测之前未将样品经历变性条件)，但在检测之前，可通过使测试样品例如血清样品变性来检测总抗原。
6.1多种HCV抗原的检测
为了确定使用LFT测定系统检测HCVcAg本身或多种HCV抗原(例如，HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a)的可行性，如实施例3中所示构建测试条并对其进行测试。
如图11A中的图A所示，使用单一针对HCVcAg的单克隆抗体的LFT测定系统不足以在获自具有高滴度的血清HCV RNA(例如14,400,000IU/mL)的受试者的尿样品中产生阳性信号。然而，当使用根据本发明的combo-HCV-Ag LFT测定系统-包含针对所述多种HCV抗原的抗体的测试条时-获得来自具有血清HCV RNA的受试者的血清(图11A，图B)和尿(图11A，图C)样品的阳性信号。第1和第2栏是阴性对照。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了LFT测试条，其包含对于选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组的至少两种不同的HCV抗原是特异的捕获和检测抗体。在一些实施方案中，本发明提供了LFT测试条，其包含针对HCVcAg和选自由E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组的一种或多种抗原的捕获和保留抗体。在一些实施方案中，本发明提供了LFT测试条，其包含针对HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a的捕获和检测抗体。
6.2使用两种不同的抗体检测HCVcAg
为了确定针对HCVcAg的另外的抗体的使用是否可增强实施例6.2的combo-HCV-Ag LFT测定法的灵敏度，如实施例3中所述构建测试条，并对其进行测试，以及将针对HCVcAg的第二抗体添加至针对所述多种HCV抗原的抗体的混合物。如图11B所示，针对HCVcAg的第二抗体的添加增强了根据本发明的combo-HCV-Ag LFT测定法的灵敏度(利用2种抗-HCVcAg mAb的图B对比利用1种抗-HCVcAg mAb的图A)，并且结果是非HCV基因型依赖性的(第C栏，对照；条1-5分别代表HCV GT 1、2、3、4和6)。
因此，在一些实施方案中，不止一种针对相同抗原的抗体，例如第二抗体用于本发明的combo-HCV-Ag LFT测定法、系统和试剂盒。在一些实施方案中，所述第一抗体和所述第二抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体是单克隆抗体并且所述第二抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体和所述第二抗体是捕获抗体、检测抗体或两者。在一些实施方案中，所述第一抗体和第二抗体特异性结合选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组的抗原。在一些实施方案中，所述第一抗体和第二抗体特异性结合HCVcAg。在一些实施方案中，将第二组针对第二抗原的第一抗体和第二抗体用于本发明的combo-HCV-Ag LFT测定法、系统和试剂盒中。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含不止一种针对相同抗原的抗体例如第二抗体的LFT测试条。在一些实施方案中，所述第一抗体和第二抗体均为单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体是单克隆抗体并且所述第二抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体和所述第二抗体是捕获抗体、检测抗体或两者。在一些实施方案中，所述第一抗体和第二抗体特异性结合选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组的抗原。在一些实施方案中，所述第一抗体和第二抗体特异性结合HCVcAg。在一些实施方案中，将第二组针对第二抗原的第一抗体和第二抗体用于本发明的combo-HCV-Ag LFT测试条。
6.3将缀合有金的溶液与测试样品混合
为了确定是否可将针对所述多种HCV抗原的检测抗体与待测试的样品混合(而非预加载在所述测试条上)而无根据本发明的combo-HCV-Ag LFT测定法的测定灵敏度和特异度的损失，省略实施例3的步骤3。为了使用在缀合垫上无缀合有胶体金的检测抗体的测试条进行测定，将测试样品与在实施例3步骤1中产生的胶体金溶液混合，随后将其添加至样品垫。
如图12A和12B中所示，在添加至样品垫之前混合测试血清样品与胶体金溶液(缀合有胶体金的检测抗体)显著提高了根据本发明的combo-HCV-Ag LFT测定法对于血清测试样品的灵敏度，检测限在等同于26-63IU/mL的血清HCV RNA水平的范围内。通过使用血清样品，combo-HCV-Ag LFT测定法表现出100％的灵敏度和100％的特异度(图12C)。
类似地，如图13A和13B中所示，在添加至样品垫之前将测试尿样品与胶体金溶液(缀合有胶体金的检测抗体)混合显著提高了根据本发明的combo-HCV-Ag LFT测定法对于尿检测样品的灵敏度，检测限在等同于63-94IU/mL的血清HCV RNA水平的范围内。通过使用尿样品，combo-HCV-Ag LFT测定法表现出100％的灵敏度和100％的特异度(图13C)。
因此，本发明还提供了LFT测定方法，其中在添加至测试条的LFT样品垫之前将测试样品与缀合有可检测标记的检测抗体混合。在一些实施方案中，本发明的combo-HCV-Ag LFT测定方法包括将测试样品与缀合有可检测标记例如胶体金的检测抗体混合，随后将所述混合物添加至测试条的样品垫，而非使用加载有缀合有可检测标记的检测抗体的测试条和将未混合的测试样品添加至样品垫。然而，在一些实施方案中，将加载有缀合有可检测标记例如胶体金的检测抗体的测试条用于测试已与缀合有可检测标记的检测抗体混合的测试样品。
在一些实施方案中，本发明提供了用于进行LFT测定法的试剂盒，所述试剂盒包含与包含可检测标记例如胶体金溶液、抗体的组合物包装在一起的测试条，和其中可将可检测标记与抗体混合以产生缀合有可检测标记的检测抗体，以及在加载在测试条上之前与待测试的样品混合的容器。在一些实施方案中，所述试剂盒包含与缀合于可检测标记例如胶体金的检测抗体包装在一起的测试条，和其中可将待测试的样品与检测抗体混合的容器。所述试剂盒中提供的测试条可预加载或可以不预加载缀合有可检测标记例如胶体金的检测抗体。
在一些实施方案中，所述试剂盒用于检测活动性HCV感染，因此所述检测抗体包含抗体的混合物，其特异性结合选自由HCVcAg、E1、E1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组的至少两种HCV抗原，例如，所述混合物包含对于第一HCV抗原是特异的第一抗体、对于第二HCV抗原是特异的第二抗体等。
实施例7–使用两种不同的针对HBsAg的抗体的HBV测定法
乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)在来自对于血清HBsAg呈阳性的受试者的尿样品中的存在。具体地，无步骤5的实施列5.5的EIA方案(在与在其上具有捕获抗体的测定底物接触之前，将样品与检测抗体混合)和使用一种或两种针对HBsAg的抗体。针对HBsAg的抗体示于表A中。未检测到其它HBV抗原。如图14A中所示，两种不同的针对HBsAg的抗体的使用使测定灵敏度提高约0.26至1.6倍。
HBsAg在来自对于血清HBsAg呈阳性的受试者的尿样品中的存在。具体地，实施例6.3的LFT方案(在与测试条接触之前，将样品与检测抗体混合)和使用一种或两种针对HBsAg的抗体。所述HBsAg抗体示于表A中。未检测到其它HBV抗原。如图14B中所示，使用两种不同的针对HBsAg的抗体的LFT测定法(参见标记有“b”的测试条)相较于仅使用一种针对HBsAg的抗体的LFT测定法(参见标记有“a”的测试条)产生显著更优的结果。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于检测样品中的HBsAg的基于免疫的测定法、系统和试剂盒，其包括至少两种不同的抗体，例如针对HBsAg的第一抗体和针对HBsAg的第二抗体的使用。在一些实施方案中，所述第一抗体和所述第二抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体是单克隆抗体并且所述第二抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体和所述第二抗体是捕获抗体、检测抗体或两者。在一些实施方案中，在与在其上具有捕获抗体的测定底物接触之前，将所述第一抗体和第二抗体与测试样品混合。在一些实施方案中，在检测之前使样品变性。在一些实施方案中，所述样品是尿样品。在一些实施方案中，所述样品是全血、血清或血浆样品。在一些实施方案中，所述测定法是EIA测定法。在一些实施方案中，所述测定法是LFT测定法。
到必需理解或完成本发明的公开内容的程度，本文中提及的所有出版物、专利和专利明确地通过引用并入本文，其引用程度就如同每一个被单独地如此并入。
在具有所描述的本发明的示例性实施方案后，本领域技术人员应当指出的是，在本公开内容之内仅是示例性的，并且可本发明的范围内进行各种其它替代、改造和修改。因此，本发明并不限于如本文中举例说明的特定实施方案，但仅受以下权利要求限制。

Claims (23)

1.一种用于将样品鉴定为含有肝炎病毒抗原的测定法，所述测定法包括：
将所述样品与多种抗体接触，其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原，
检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，
任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，和
当结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原被检测为存在时，将所述样品鉴定为含有肝炎病毒抗原，以及当结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原不存在时，将所述样品鉴定为不含肝炎病毒抗原，
其中所述肝炎病毒抗原是丙型肝炎病毒(HCV)抗原、乙型肝炎病毒(HBV)抗原或两者。
2.根据权利要求1所述的测定法，其中在所述检测步骤之前将所述样品经历使免疫复合物解离的条件。
3.根据权利要求1所述的测定法，其中在所述检测步骤之前不将所述样品经历使免疫复合物解离的条件。
4.根据权利要求1所述的测定法，其中所述样品是尿。
5.根据权利要求1所述的测定法，其中所述样品是全血、血清或血浆。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的测定法，其中所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的测定法，其中所述HCV抗原选自由HCVcAg、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b组成的组，并且所述HCV抗原的至少一种是HCVcAg。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的测定法，其中所述HCV抗原包含HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a，基本上由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成或由HCVcAg、NS3、NS4b和NS5a组成。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的测定法，其中所述多种抗体包含第一抗体和第二抗体，所述第一抗体和第二抗体特异性结合所述相同的肝炎病毒抗原。
10.根据权利要求1所述的测定法，所述测定法还包括将所述样品与所述多种抗体混合以形成混合物，和随后将所述混合物与具有特异性结合所述多种抗体的捕获试剂的底物接触，所述捕获试剂可在所述检测步骤之前结合于或可不结合于所述肝炎病毒抗原。
11.根据权利要求1或权利要求10所述的测定法，其中所述检测步骤包括将可检测标记附接于所述多种抗体中的每一种抗体。
12.一种将受试者诊断为具有活动性肝炎病毒感染的方法，所述方法包括：
当已根据权利要求3或权利要求4的测定方法将来自所述受试者的样品鉴定为含有HCV抗原时，将所述受试者诊断为具有活动性丙型肝炎病毒(HCV)感染，
当已根据权利要求3或权利要求4的测定方法将来自所述受试者的样品鉴定为含有HBV抗原时，将所述受试者诊断为具有活动性乙型肝炎病毒(HBV)感染，或
当已根据权利要求3或权利要求4的测定方法将来自所述受试者的样品鉴定为不含肝炎病毒抗原时，将所述受试者诊断为不具有活动性肝炎病毒感染。
13.一种从多个受试者中将受试者鉴定为具有或不具有活动性肝炎病毒感染的方法，所述方法包括：
根据权利要求3或权利要求4的测定方法测试来自所述多个受试者的样品，和
当来自所述受试者的样品已被鉴定为含有HCV抗原时，将所述受试者鉴定为具有活动性丙型肝炎病毒(HCV)感染，
当来自所述受试者的样品已被鉴定为含有HBV抗原时，将所述受试者鉴定为具有活动性乙型肝炎病毒(HBV)感染，或
当来自所述受试者的样品已被鉴定为不含肝炎病毒抗原时，将所述受试者鉴定为不具有活动性肝炎病毒感染。
14.一种用于将受试者诊断为具有活动性肝炎病毒感染或曾具有过去的且被清除的肝炎病毒感染的方法，所述方法包括：
从所述受试者获得第一样品和第二样品，其中所述第一样品可以能够或可以不能够具有免疫复合物并且所述第二样品能够具有免疫复合物，
将不能够具有免疫复合物和/或未曾经历使免疫复合物解离的条件的所述第一样品与多种抗体接触，其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，
将已经历使免疫复合物解离的条件的所述第二样品与所述多种抗体接触，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，和
当结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原被检测为存在于所述第一样品中时，将所述受试者诊断为具有活动性肝炎病毒感染，以及当在所述第二样品中检测到结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原，并且在所述第一样品中未检测到肝炎病毒抗原时，将所述受试者诊断为具有过去的且被清除的肝炎病毒感染，
其中所述肝炎病毒是丙型肝炎病毒(HCV)并且所述肝炎病毒抗原是HCV抗原，或所述肝炎病毒是乙型肝炎病毒(HBV)并且所述肝炎病毒抗原是HBV抗原。
15.一种监测曾具有，已具有或可具有活动性肝炎病毒感染的受试者的方法，所述方法包括
在第一时间点从所述受试者获得第一样品和第二样品，其中至少所述第二样品能够具有免疫复合物，
将不能够具有免疫复合物和/或未曾经历使免疫复合物解离的条件的所述第一样品与多种抗体接触，其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒肝炎病毒的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，
将已经历使免疫复合物解离的条件的所述第二样品与所述多种抗体接触，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，
在第二时间点从所述受试者获得第三样品和第四样品，其中至少所述第四样品能够具有免疫复合物，
将不能够具有免疫复合物和/或未曾经历使免疫复合物解离的条件的所述第三样品与多种抗体接触，其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，
将已经历使免疫复合物解离的条件的所述第四样品与所述多种抗体接触，检测结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原的存在或不存在，和任选地测量结合于所述多种抗体中的抗体的任何肝炎病毒抗原，和
计算所述第一样品、第二样品、第三样品和第四样品之间的结合于所述多种抗体中的抗体的肝炎病毒抗原的差异，
其中所述肝炎病毒是丙型肝炎病毒(HCV)并且所述肝炎病毒抗原是HCV抗原，或所述肝炎病毒是乙型肝炎病毒(HBV)并且所述肝炎病毒抗原是HBV抗原。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
包含多种抗体的容器，其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原，和
在其上涂覆或固定有特异性结合所述多种抗体和/或所述多种肝炎病毒抗原的捕获试剂的底物，
其中所述肝炎病毒抗原是丙型肝炎病毒(HCV)抗原、乙型肝炎病毒(HBV)或两者。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述多种抗体是具有未在自然界中发现的所述多种抗体的浓度和/或纯度的组合物。
18.根据权利要求16所述的试剂盒，所述试剂盒还包含具有附接于其的可检测标记的单克隆抗体、具有附接于其的可检测标记的多克隆抗体或两者，并且其中具有可检测标记的所述抗体特异性结合所述多种抗体。
19.一种具有样品加载区、测试区和对照区的侧流测试底物，其中将捕获试剂固定在所述测试区，所述捕获试剂是多种抗体，其中所述多种抗体中的每一种抗体特异性结合多种肝炎病毒抗原中的肝炎病毒抗原，
其中所述肝炎病毒抗原是丙型肝炎病毒(HCV)抗原、乙型肝炎病毒(HBV)或两者。
20.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
权利要求19的侧流测试底物，和
检测试剂。
21.一种用于测试样品中的分析物的免疫测定法，所述测定法包括：
将所述测试样品与一种或多种特异性结合所述分析物的检测抗体混合，以及随后将所述混合物与具有捕获抗体的测定底物接触，所述捕获抗体特异性结合涂覆或固定在所述测定底物的表面上的所述分析物。
22.一种用于测试样品中的分析物的侧流测试测定法，所述测定法包括：
将所述测试样品与缀合有胶体金的检测抗体混合，所述检测抗体特异性结合所述分析物，和随后
将所述混合物加载在测试条上，所述测试条具有固定在测试线上的特异性结合所述分析物的捕获抗体和固定在处于所述测试线的下游的对照线上的特异性结合所述检测抗体的抗体。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的测定法，其中所述分析物是HBsAg，并且使用第一抗体和第二抗体，所述第一抗体和第二抗体特异性结合HBsAg。
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