JP2020180915A - 免疫測定の検体前処理用試薬及び検体前処理方法、並びに免疫測定用キット - Google Patents
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Abstract
【課題】 検体中に含まれる抗原に反応するヒト由来抗体(自己抗体）の影響による測定値の偽低値化または偽高値化を抑制することができ、それでいて冷蔵状態でも沈殿が生じにくい、陰イオン性界面活性剤を含む検体前処理用試薬、及び該試薬を用いた検体前処理方法を提供すること。【解決手段】 免疫測定の検体前処理用試薬は、１〜１５w/v％の陰イオン性界面活性剤と、該陰イオン性界面活性剤の濃度の1/4〜1/2の濃度の両イオン性界面活性剤と、０〜５００ｍＭのイミダゾール化合物とを含む。【選択図】なし
Description
本発明は、免疫測定の検体前処理用試薬及びそれを用いた検体前処理方法に関する。
検体中成分の免疫測定に際し、検体中に含まれる抗原に反応するヒト由来抗体(自己抗体）の影響による測定値の偽低値化または偽高値化を抑制するため、免疫反応の前に検体を陰イオン性界面活性剤を含む溶液と混合させて抗体の影響を低減する方法が知られている（特許文献１及び特許文献２）。
しかし、陰イオン性界面活性剤の高濃度溶液は、低温または常温で静置すると析出しやすい、という問題がある。特に、高濃度の陰イオン性界面活性剤を含む前処理用の溶液を、免疫測定に使用する他の試薬・溶液と共にキットとしてパッケージする場合、他の試薬と共に冷蔵状態で保管・運搬されることが想定されることから、析出の問題はさらに生じやすくなる。免疫測定を前処理の段階から自動分析器等で全自動で実施しようとすると、溶液中の析出は、試薬吸引ノズルのつまり等を引き起こす可能性があり、それを防ぐためには、例えば、使用前に溶液を３７℃〜６０℃程度で３０分間程加温し、析出した沈殿を再溶解させる必要があった。
本発明の目的は、検体中に含まれる抗原に反応するヒト由来抗体(自己抗体）の影響による測定値の偽低値化または偽高値化を抑制することができ、それでいて冷蔵状態でも沈殿が生じにくい、陰イオン性界面活性剤を含む検体前処理用試薬、及び該試薬を用いた検体前処理方法を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の濃度範囲の陰イオン性界面活性剤に加え、特定の濃度範囲の両イオン性界面活性剤及び必要に応じて特定の濃度範囲のイミダゾール化合物を配合することにより、検体中に含まれる抗原に反応するヒト由来抗体(自己抗体）の影響による測定値の偽低値化または偽高値化を抑制することができ、それでいて４℃程度の冷蔵条件下でも析出を生じない、または生じてもごくわずかであることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1) １〜１５w/v％の陰イオン性界面活性剤と、該陰イオン性界面活性剤の濃度の1/4〜1/2の濃度の両イオン性界面活性剤と、０〜５００ｍＭのイミダゾール化合物とを含む、免疫測定の検体前処理用試薬。
(2) ４℃で７日間保存後に析出が認められない、(1)記載の試薬。
(3) 前記陰イオン性界面活性剤の濃度が１０〜１５w/v％である(1)又は(2)記載の試薬。
(4) 前記イミダゾール化合物の濃度が２０〜５００ｍＭである、(1)〜(3)のいずれかに記載の試薬。
(5) 前記イミダゾール化合物の濃度が１００〜２５０ｍＭである、(4)記載の試薬。
(6) 前記陰イオン性界面活性剤が、分子内に炭素数９以上のアルキル基を含む陰イオン性界面活性剤である(1)〜(5)のいずれかに記載の試薬。
(7) 前記陰イオン性界面活性剤が、SDS、STS及びNLSから成る群より選ばれる少なくとも１種である、(6)記載の試薬。
(8) 前記陰イオン性界面活性剤がSDSである、(7)記載の試薬。
(9) 前記両イオン性界面活性剤が、分子内に第四級アンモニウム基と硫酸基を含む両イオン性界面活性剤である、(1)〜(8)のいずれかに記載の試薬。
(10) 前記両イオン性界面活性剤が、CHAPS及びC10APSから成る群より選ばれる少なくとも１種である、(9)記載の試薬。
(11) 前記両イオン性界面活性剤がCHAPSである(10)記載の試薬。
(12) 前記イミダゾール化合物がイミダゾールである、(1)〜(11)のいずれかに記載の試薬。
(13) pHが5.0〜8.0である(1)〜(12)のいずれかに記載の試薬。
(14) pHが6.0〜7.2である(13)記載の試薬。
(15) 免疫測定に供する検体を、(1)〜(14)のいずれかに記載の検体前処理用試薬と混合し、加熱処理することを含む、検体前処理方法。
(16) (1)〜(14)のいずれかに記載の検体前処理用試薬を構成試薬として含む、免疫測定用キット。
(1) １〜１５w/v％の陰イオン性界面活性剤と、該陰イオン性界面活性剤の濃度の1/4〜1/2の濃度の両イオン性界面活性剤と、０〜５００ｍＭのイミダゾール化合物とを含む、免疫測定の検体前処理用試薬。
(2) ４℃で７日間保存後に析出が認められない、(1)記載の試薬。
(3) 前記陰イオン性界面活性剤の濃度が１０〜１５w/v％である(1)又は(2)記載の試薬。
(4) 前記イミダゾール化合物の濃度が２０〜５００ｍＭである、(1)〜(3)のいずれかに記載の試薬。
(5) 前記イミダゾール化合物の濃度が１００〜２５０ｍＭである、(4)記載の試薬。
(6) 前記陰イオン性界面活性剤が、分子内に炭素数９以上のアルキル基を含む陰イオン性界面活性剤である(1)〜(5)のいずれかに記載の試薬。
(7) 前記陰イオン性界面活性剤が、SDS、STS及びNLSから成る群より選ばれる少なくとも１種である、(6)記載の試薬。
(8) 前記陰イオン性界面活性剤がSDSである、(7)記載の試薬。
(9) 前記両イオン性界面活性剤が、分子内に第四級アンモニウム基と硫酸基を含む両イオン性界面活性剤である、(1)〜(8)のいずれかに記載の試薬。
(10) 前記両イオン性界面活性剤が、CHAPS及びC10APSから成る群より選ばれる少なくとも１種である、(9)記載の試薬。
(11) 前記両イオン性界面活性剤がCHAPSである(10)記載の試薬。
(12) 前記イミダゾール化合物がイミダゾールである、(1)〜(11)のいずれかに記載の試薬。
(13) pHが5.0〜8.0である(1)〜(12)のいずれかに記載の試薬。
(14) pHが6.0〜7.2である(13)記載の試薬。
(15) 免疫測定に供する検体を、(1)〜(14)のいずれかに記載の検体前処理用試薬と混合し、加熱処理することを含む、検体前処理方法。
(16) (1)〜(14)のいずれかに記載の検体前処理用試薬を構成試薬として含む、免疫測定用キット。
本発明によれば、検体中に含まれる抗原に反応するヒト由来抗体(自己抗体）や他の抗原結合性物質等の影響による測定値の偽低値化または偽高値化を抑制することができ、それでいて冷蔵状態でも沈殿が生じにくい、陰イオン性界面活性剤を含む検体前処理用試薬及びそれを用いた検体の前処理方法が初めて提供された。本発明の試薬は、冷蔵保存しても析出しないか、析出しても短時間で溶解する程度の沈殿しか生じないため、この試薬を用いた前処理工程を、全自動装置による免疫測定方法に容易に組み込むことが可能となる。また、本発明によれば、検体中に含まれる抗原に反応するヒト由来抗体(自己抗体）の影響による測定値の偽低値化または偽高値化を抑制することができ、それでいて冷蔵状態でも沈殿が生じにくい、陰イオン性界面活性剤を含む検体前処理用試薬を構成試薬として含む、免疫測定用キットが初めて提供された。
上記のとおり、本発明は、免疫測定の検体前処理用試薬に係る。本明細書において「検体」とは、ヒトまたは動物から体外に取り出した試料を示し、好ましくは、ヒト由来の試料を示す。具体的には、例えば、血清、血漿、全血、尿、便、口腔粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜および生検試料（例、腸管試料、肝臓試料）が挙げられる。好ましくは、検体は、血清または血漿である。
本明細書において、「冷蔵保存」とは、２℃以上１０℃以下の温度において、目的物を凍結させずに低温貯蔵することを示す。本発明の検体前処理用試薬は、冷蔵保存において析出を生じにくいものであるが、特に７日間の冷蔵保存で目視可能な析出を生じないことが好ましい。さらに、３〜５℃、特に４℃で７日間保管後、目視可能な析出を生じないことが好ましい。
本発明の免疫測定の検体前処理用試薬は、陰イオン性界面活性剤を含む。陰イオン性界面活性剤を含有することにより、自己抗体の影響による測定値の偽低値化または偽高値化を抑制することができる。陰イオン性界面活性剤は、分子内に炭素数９以上のアルキル基を含むものが好ましく、さらに好ましくは炭素数１１〜１６のアルキル基を含むものが好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、好ましい例として、SDS（ラウリル硫酸ナトリウム）、STS（トリデシル硫酸ナトリウム）、NLS（N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム）、ドデシル硫酸リチウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、デオキシコール酸等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、特にSDSが好ましい。陰イオン性界面活性剤は、単独で用いることもできるし、２種以上の陰イオン性界面活性剤を組み合わせて用いることもできる。
検体前処理用試薬中の陰イオン性界面活性剤の濃度（２種以上の陰イオン性界面活性剤を用いる場合にはそれらの合計濃度）は、１〜１５％、好ましくは１０〜１５％である。なお、本明細書において、濃度を表す「％」は、特に断りがない限り重量／容量％（w/v%）を示す。陰イオン性界面活性剤の濃度が１％未満であると、自己抗体の影響による測定値の偽低値化または偽高値化を抑制する効果が少なくなり、一方、１５％を超えると、析出を防止するために必要な両イオン性界面活性剤の添加量が多くなり、免疫反応が阻害される恐れがある。
本発明の検体前処理用試薬は、両イオン性界面活性剤を含む。両イオン性界面活性剤を配合することにより、析出を効果的に抑制することができる。両イオン性界面活性剤としては、分子内に第四級アンモニウム基と硫酸基を含むものが好ましい。好ましい両イオン性界面活性剤の例として、CHAPS（3-3-コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルフォネート）、C10APS (N-デシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルフォネート）、C12APS (N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルフォネート、C14APS(N-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルフォネート、C16APS (N-ヘキササデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルフォネート、C18APS(Ｎ−オクタデシル１−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロポンスルホネート)等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、CHAPS及びC10APSがさらに好ましく、CHAPSが特に好ましい。両イオン性界面活性剤は、単独で用いることもできるし、２種以上の両イオン性界面活性剤を組み合わせて用いることもできる。
両イオン性界面活性剤の濃度(w/v%)（２種以上の両イオン性界面活性剤を用いる場合にはそれらの合計濃度）は、陰イオン性界面活性剤の濃度の1/4〜1/2であり、好ましくは1/3〜1/2である。両イオン性界面活性剤の濃度が陰イオン性界面活性剤の濃度の1/4未満の場合には、析出防止効果が不十分となり、一方、1/2を超えると免疫反応を阻害する恐れがある。
本発明の検体前処理用試薬は、必要に応じ、イミダゾール化合物を含む。イミダゾール化合物を配合することにより、析出防止効果をより一層高めることができる。イミダゾール化合物を添加しなくても７日間の冷蔵保存後に析出が認められない場合には、イミダゾール化合物は不要である（ただし、念のために添加しておいてもよい）。陰イオン性界面活性剤と両イオン性界面活性剤のみでは７日間の冷蔵保存後に析出が認められる場合であっても、イミダゾール化合物を添加すれば、析出を防止できる。イミダゾール化合物の具体例としては、イミダゾール、2-メルカプトベンズイミダゾール、2-メルカプト-1-メチルイミダゾール、2-メチルベンズイミダゾール等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。イミダゾール化合物は、単独で用いることもできるし、２種以上のイミダゾール化合物を組み合わせて用いることもできる。
イミダゾール化合物の濃度（２種以上のイミダゾール化合物を用いる場合にはそれらの合計濃度）は、０〜５００ｍＭであり、好ましくは２０〜５００ｍＭ、さらに好ましくは１００〜２５０ｍＭである。イミダゾール化合物の濃度が５００ｍＭを超えると、免疫反応を阻害する恐れがある。
本発明の検体前処理用試薬は、上記各成分を液状の媒体中に含むものである。媒体としては、水系緩衝液が好ましい。水系緩衝液としては、免疫測定に通常用いられている緩衝液を用いることができ、例として、MES緩衝液、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、炭酸緩衝液等を挙げることができる。また、検体前処理用試薬のpHは5.0〜8.0が好ましく、さらには6.0〜7.2が好ましい。pHが5.0未満の場合には、免疫測定が阻害される恐れがあるため、中和操作が必要となるので好ましくなく、一方、8.0を超えると析出が生じやすくなるので好ましくない。したがって、水系緩衝液としては、上記した好ましいpHを達成するものを選択することが好ましい。
本発明の検体前処理用試薬には、上記各成分に加え、本発明の効果及び免疫測定に悪影響を与えない範囲で任意的に他の添加剤を添加することができる。このような添加剤の例として、EDTA等のようなキレート剤、TCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）、2MEA(2-メルカプトエチルアミン)、DTT(ジチオトレイトール)、DEAET(2-(ジエチルアミノ)エタンチオール塩酸塩)のような還元剤、スクロース、ラクトース、マルトースのような糖類、AFSI（Antiform SI）等の消泡剤を挙げることができる。
本発明の検体前処理用試薬で検体を前処理する場合、免疫測定を行う前に、免疫測定に供する検体を本発明の検体前処理用試薬と混合し、加熱処理する。検体と試薬との混合比率は、特に限定されないが、通常、検体の体積を１００として、前処理試薬の体積は、通常、１０〜４００、好ましくは１００〜２５０である。また、加熱処理の条件としては、通常、３７℃〜９５℃、好ましくは７０℃〜９０℃、より好ましくは７５℃〜８５℃で、通常、２分間〜１０分間、好ましくは３分間〜７分間である。
上記のとおり前処理した検体は、通常の免疫測定に供することができる。免疫測定は、何ら限定されるものではなく、生体内に含まれる成分を検出又は定量する任意の免疫測定に供することができる。上記した前処理方法は、市販の全自動免疫測定装置に容易に組み込むことができ、全自動にて免疫測定を行うことができる。
本発明の免疫測定用キットは、上記した検体前処理液を構成試薬として含む。ここでいう「免疫測定」は、検体中の成分を抗原抗体反応を用いて測定する方法であれば、特に限定はされないが、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このような免疫測定としては、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定（ＣＬＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）、及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。本発明の免疫測定用キットは、検体前処理液に加え、他の構成試薬として、上記いずれかの免疫測定に必要な試薬を含む。例えば、ＣＬＥＩＡ用のキットにおいては、検体前処理液の他に、抗体固相化粒子液、標識抗体液、洗浄液、基質液を構成試薬として含む。これらの試薬は、１つの包装内に収容されていてもよく、２つ以上の包装に分割して収容されていてもよい。上記した免疫測定用キットは、冷蔵保存が必要な他の構成試薬と検体前処理液とを同じ包装内に収容した状態で、冷蔵条件下での保管、運搬等を容易に行うことができる。
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］検体前処理液の析出試験
主成分として陰イオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を含む検体前処理用の試薬（以下、「検体前処理液」）を、濃度及び共存物質等の条件を変えて計３０種類調製した。各検体前処理液の組成を表１〜４に示す。条件の検体前処理液を、４℃で７日間静置して、溶液内の沈殿の析出を目視で確認した。表中の「析出度」とは、溶解させたＳＤＳの全量が析出したのと同等の沈殿物体積が目視で確認された場合を「１００」として、沈殿物体積量の度合いを示したものである。また、表中の「ＡＦＳＩ」とは、消泡剤であり、具体的には、富士フイルム和光純薬(株)社製消泡剤SI（商品名）を使用した。また、以下の全ての例において、各試薬の媒体としては、Tris緩衝液、或いはMES緩衝液を用いた。
主成分として陰イオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を含む検体前処理用の試薬（以下、「検体前処理液」）を、濃度及び共存物質等の条件を変えて計３０種類調製した。各検体前処理液の組成を表１〜４に示す。条件の検体前処理液を、４℃で７日間静置して、溶液内の沈殿の析出を目視で確認した。表中の「析出度」とは、溶解させたＳＤＳの全量が析出したのと同等の沈殿物体積が目視で確認された場合を「１００」として、沈殿物体積量の度合いを示したものである。また、表中の「ＡＦＳＩ」とは、消泡剤であり、具体的には、富士フイルム和光純薬(株)社製消泡剤SI（商品名）を使用した。また、以下の全ての例において、各試薬の媒体としては、Tris緩衝液、或いはMES緩衝液を用いた。
(1) １〜１５％ＳＤＳ溶液の析出試験
表１に示す試験例１〜４は、１〜１５％のＳＤＳを含む検体前処理液を、いずれも両性界面活性剤、イミダゾール化合物を含まない条件で調製し、析出試験を行った結果である。表１に示す通り、いずれの条件においても、ほぼ全量が析出した。
表１に示す試験例１〜４は、１〜１５％のＳＤＳを含む検体前処理液を、いずれも両性界面活性剤、イミダゾール化合物を含まない条件で調製し、析出試験を行った結果である。表１に示す通り、いずれの条件においても、ほぼ全量が析出した。
(2) 両性界面活性剤による析出防止効果確認
表２に示す試験例５〜１２は、１〜１５％のＳＤＳを含む溶液に、ＳＤＳの１／２濃度、１／４濃度のＣＨＡＰＳを添加した検体前処理液を調製し、析出試験を行った結果である。１％ＳＤＳを含む溶液は、１／４濃度のＣＨＡＰＳを添加することで、析出を抑制できたが（試験例５、６）、５％ＳＤＳ、１０％ＳＤＳ、１５％ＳＤＳを含む溶液では、１／４濃度のＣＨＡＰＳでは析出を抑制できず（試験例７，９，１１）、１／２濃度のＣＨＡＰＳの添加によって析出を抑制できた（試験例８，１０，１２）。
表２に示す試験例５〜１２は、１〜１５％のＳＤＳを含む溶液に、ＳＤＳの１／２濃度、１／４濃度のＣＨＡＰＳを添加した検体前処理液を調製し、析出試験を行った結果である。１％ＳＤＳを含む溶液は、１／４濃度のＣＨＡＰＳを添加することで、析出を抑制できたが（試験例５、６）、５％ＳＤＳ、１０％ＳＤＳ、１５％ＳＤＳを含む溶液では、１／４濃度のＣＨＡＰＳでは析出を抑制できず（試験例７，９，１１）、１／２濃度のＣＨＡＰＳの添加によって析出を抑制できた（試験例８，１０，１２）。
(3) 両性界面活性剤及びイミダゾール化合物による析出防止効果確認
表３−１〜表３−３に示す試験例１３〜３０は、５〜１５％のＳＤＳを含む溶液に、ＳＤＳの１／４濃度のＣＨＡＰＳ、及び２０〜５００ｍＭのイミダゾールを含む検体前処理液を調製し、析出試験を行った結果である。５％ＳＤＳを含む溶液においては、１／４濃度のＣＨＡＰＳと２０ｍＭ以上のイミダゾールを添加することで、ＳＤＳの析出を抑制できた（試験例１３〜１８）。１０％ＳＤＳを含む溶液においては、１／４濃度のＣＨＡＰＳと５０ｍＭ以上のイミダゾールを添加することで、ＳＤＳの析出を抑制できた（試験例２０〜２４）。１５％ＳＤＳを含む溶液においては、１／４濃度のＣＨＡＰＳと５０〜２５０ｍＭ以上のイミダゾールを添加することで、ＳＤＳの析出を抑制できたが（試験例２６〜２９）、５００ｍＭのイミダゾールを添加すると、溶液がゲル化してしまった（試験例３０）。いずれのＳＤＳ濃度においても、ＳＤＳの１／４濃度のＣＨＡＰＳと１００ｍＭのイミダゾールを添加することで、ＳＤＳの析出を０とすることができた。
表３−１〜表３−３に示す試験例１３〜３０は、５〜１５％のＳＤＳを含む溶液に、ＳＤＳの１／４濃度のＣＨＡＰＳ、及び２０〜５００ｍＭのイミダゾールを含む検体前処理液を調製し、析出試験を行った結果である。５％ＳＤＳを含む溶液においては、１／４濃度のＣＨＡＰＳと２０ｍＭ以上のイミダゾールを添加することで、ＳＤＳの析出を抑制できた（試験例１３〜１８）。１０％ＳＤＳを含む溶液においては、１／４濃度のＣＨＡＰＳと５０ｍＭ以上のイミダゾールを添加することで、ＳＤＳの析出を抑制できた（試験例２０〜２４）。１５％ＳＤＳを含む溶液においては、１／４濃度のＣＨＡＰＳと５０〜２５０ｍＭ以上のイミダゾールを添加することで、ＳＤＳの析出を抑制できたが（試験例２６〜２９）、５００ｍＭのイミダゾールを添加すると、溶液がゲル化してしまった（試験例３０）。いずれのＳＤＳ濃度においても、ＳＤＳの１／４濃度のＣＨＡＰＳと１００ｍＭのイミダゾールを添加することで、ＳＤＳの析出を０とすることができた。
［実施例２］Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）測定における前処理効果の確認
ＨＢｓＡｇ陽性血清（ProMed Dx 9990650 CPD Plasma）を陰性血清（TRINA Normal Human Serum off the clot）で36,860倍希釈した血清をＨＢｓＡｇ陽性モデル検体として使用した。ＨＢｓＡｇ陽性モデル検体に、さらに抗ＨＢｓＡｇ抗体（ヘブスブリン筋注用1000単位）を最終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加して、自己抗体陽性ＨＢｓＡｇ陽性モデル検体を調製した。
ＨＢｓＡｇ陽性血清（ProMed Dx 9990650 CPD Plasma）を陰性血清（TRINA Normal Human Serum off the clot）で36,860倍希釈した血清をＨＢｓＡｇ陽性モデル検体として使用した。ＨＢｓＡｇ陽性モデル検体に、さらに抗ＨＢｓＡｇ抗体（ヘブスブリン筋注用1000単位）を最終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加して、自己抗体陽性ＨＢｓＡｇ陽性モデル検体を調製した。
調製したＨＢｓＡｇ陽性モデル検体（以下、「抗体陰性検体」）と自己抗体陽性ＨＢｓＡｇ陽性モデル検体（以下、「抗体陽性検体」）を、それぞれ前処理液（１２．５％ ＳＤＳ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎａ、１００ｍＭ イミダゾール、３．０％ ＣＨＡＰＳ、１．７５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、０．２５％ ＳＴＳ、１％ スクロース、２０ｍＭ ＤＥＡＥＴ、０．０１％ ＡＦＳＩ、ｐＨ６．５）と体積比１：２となるように混合し、８０℃で５分間反応させた（前処理あり検体）。一方、前処理液と検体を同様に混合した後、加熱処理を省略したものを準備した（前処理なし検体）。前処理あり検体、前処理なし検体のそれぞれを、検体希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．３２％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．９６％ Ｃ１６ＴＡＣ、２．０ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ、１．０％ スクロース、ｐＨ７．２）と体積比２：１で混合した。
各検体について、自動分析機器ルミパルスＬ２４００及びルミパルスプレストＨＢｓＡｇ（いずれも富士レビオ社製）を用いて、ＨＢｓＡｇの測定を行った。各検体のカウントを表４に示す。なお、表４中のカウントは２重測定を行った平均値である。
表４に示す通り、前処理を行うことで、測定時のカウントが上昇し、測定感度が向上した。また、自己抗体陽性検体について、前処理により、抗体による測定値の低減を抑制できることが示された。
［実施例３］ＣＡ１９−９測定における前処理効果の確認
ＣＡ１９−９陽性血清（i-Laboratory LLP）を陰性血清（TRINA Normal Human Serum off the clot）で487.7倍希釈した血清をＣＡ１９−９陽性モデル検体として使用した。ＣＡ１９−９陽性モデル検体に、さらにマウス抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（1116-NS-19-9, Fujirebio Diagnostics Inc.製）を最終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように添加して、自己抗体陽性ＣＡ１９−９陽性モデル検体を調製した。
ＣＡ１９−９陽性血清（i-Laboratory LLP）を陰性血清（TRINA Normal Human Serum off the clot）で487.7倍希釈した血清をＣＡ１９−９陽性モデル検体として使用した。ＣＡ１９−９陽性モデル検体に、さらにマウス抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（1116-NS-19-9, Fujirebio Diagnostics Inc.製）を最終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように添加して、自己抗体陽性ＣＡ１９−９陽性モデル検体を調製した。
調製したＣＡ１９−９陽性モデル検体（抗体陰性検体）と自己抗体陽性ＣＡ１９−９陽性モデル検体（抗体陽性検体）を、それぞれ前処理液（１２．５％ ＳＤＳ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎａ、１００ｍＭ イミダゾール、３．０％ ＣＨＡＰＳ、１．７５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、０．２５％ ＳＴＳ、１％ スクロース、２０ｍＭ ＤＥＡＥＴ、０．０１％ ＡＦＳＩ、ｐＨ６．５）と体積比１：２となるように混合し、８０℃で５分間反応させた（前処理あり検体）。一方、前処理液と検体を同様に混合した後、加熱処理を省略したものを準備した（前処理なし検体）。前処理あり検体、前処理なし検体のそれぞれを、検体希釈液（５．０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１０８、４．０％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ ポリオキシエチレンラウリルエーテル、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１．２％ Ｃ１０ＡＰＳ、 Ｔｒｉｓ、２．３２％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．９６％ Ｃ１６ＴＡＣ、２．０ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ、１．０％ スクロース、ｐＨ７．２）と体積比２：５で混合した。
各検体について、自動分析機器ルミパルスＬ２４００及びルミパルスプレストＣＡ１９−９（いずれも富士レビオ社製）を用いて、ＣＡ１９−９の測定を行った。各検体のカウントを表５に示す。なお、表５中のカウントは２重測定を行った平均値である。
表５に示す通り、前処理により、自己抗体陽性検体において、自己抗体による測定値の低減を抑制できることが示された。
［実施例４］各種前処理条件下でのＨＢｓＡｇ測定
表６に示す試験例３１〜４２の検体前処理液を調製した。実施例２の抗体陰性検体、抗体陽性検体について、それぞれ試験例３１〜４２の各検体前処理液と体積比１：２で混合し、８０℃で５分間加熱処理を行った。各検体について、実施例２と同様にＨＢｓＡｇの測定を行った。その際、ＳＤＳの析出が見られる検体前処理液については、使用前に加温し、沈殿を溶解した後に使用した。測定結果を表７に示す。なお、表７中のカウントは２重測定を行った平均値である。
表６に示す試験例３１〜４２の検体前処理液を調製した。実施例２の抗体陰性検体、抗体陽性検体について、それぞれ試験例３１〜４２の各検体前処理液と体積比１：２で混合し、８０℃で５分間加熱処理を行った。各検体について、実施例２と同様にＨＢｓＡｇの測定を行った。その際、ＳＤＳの析出が見られる検体前処理液については、使用前に加温し、沈殿を溶解した後に使用した。測定結果を表７に示す。なお、表７中のカウントは２重測定を行った平均値である。
試験例３４〜３６及び試験例４０〜４２は、いずれも４℃保存で析出しなかった。また、いずれの試験例においても、抗体陽性検体における自己抗体の影響を抑制できた。
［実施例５］各種前処理条件下でのＣＡ１９−９測定
実施例３の抗体陰性検体、抗体陽性検体について、それぞれ実施例４で調製した試験例３１〜４２の各検体前処理液と体積比１：２で混合し、８０℃で５分間加熱処理を行った。各検体について、実施例３と同様にＣＡ１９−９の測定を行った。その際、ＳＤＳの析出が見られる検体前処理液については、使用前に加温し、沈殿を溶解した後に使用した。測定結果を表８に示す。なお、表８中のカウントは２重測定を行った平均値である。
実施例３の抗体陰性検体、抗体陽性検体について、それぞれ実施例４で調製した試験例３１〜４２の各検体前処理液と体積比１：２で混合し、８０℃で５分間加熱処理を行った。各検体について、実施例３と同様にＣＡ１９−９の測定を行った。その際、ＳＤＳの析出が見られる検体前処理液については、使用前に加温し、沈殿を溶解した後に使用した。測定結果を表８に示す。なお、表８中のカウントは２重測定を行った平均値である。
いずれの試験例においても、抗体陽性検体における自己抗体の影響を抑制できた。
Claims (16)
- １〜１５w/v％の陰イオン性界面活性剤と、該陰イオン性界面活性剤の濃度の1/4〜1/2の濃度の両イオン性界面活性剤と、０〜５００ｍＭのイミダゾール化合物とを含む、免疫測定の検体前処理用試薬。
- ４℃で７日間保存後に析出が認められない、請求項１記載の試薬。
- 前記陰イオン性界面活性剤の濃度が１０〜１５w/v％である請求項１又は２記載の試薬。
- 前記イミダゾール化合物の濃度が２０〜５００ｍＭである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬。
- 前記イミダゾール化合物の濃度が１００〜２５０ｍＭである、請求項４記載の試薬。
- 前記陰イオン性界面活性剤が、分子内に炭素数９以上のアルキル基を含む陰イオン性界面活性剤である請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬。
- 前記陰イオン性界面活性剤が、SDS、STS及びNLSから成る群より選ばれる少なくとも１種である、請求項６記載の試薬。
- 前記陰イオン性界面活性剤がSDSである、請求項７記載の試薬。
- 前記両イオン性界面活性剤が、分子内に第四級アンモニウム基と硫酸基を含む両イオン性界面活性剤である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の試薬。
- 前記両イオン性界面活性剤が、CHAPS及びC10APSから成る群より選ばれる少なくとも１種である、請求項９記載の試薬。
- 前記両イオン性界面活性剤がCHAPSである請求項１０記載の試薬。
- 前記イミダゾール化合物がイミダゾールである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の試薬。
- pHが5.0〜8.0である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の試薬。
- pHが6.0〜7.2である請求項１３記載の試薬。
- 免疫測定に供する検体を、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の検体前処理用試薬と混合し、加熱処理することを含む、検体前処理方法。
- 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の試薬を構成試薬として含む、免疫測定用キット。
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