JP2020052012A - 不溶性担体を使用する免疫学的測定試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】不溶性担体を使用する免疫学的測定試薬において、オンボードでの反応性低下を抑制し、そのオンボード安定性を向上させる方法、およびオンボード安定性を向上させた免疫学的測定試薬を提供する。【解決手段】前記免疫学的測定試薬は、酸素ラジカル吸収剤を含む。前記のオンボード安定性を向上させる方法では、分析対象物質に対する抗原または抗体を固定化した不溶性担体を含む免疫学的測定試薬に酸素ラジカル吸収剤を添加する。【選択図】なし

Description

本発明は、不溶性担体を使用する免疫学的測定試薬に関する。

血液や尿などの生体試料中の成分を分析する自動分析装置は、同時に大量の成分分析や調査を行えるため、病院や検査機関等において広く利用されている。なかでも、不溶性担体を使用する免疫学的測定法は、自動分析装置による測定に適しているため、広く用いられている。例えば、ラテックス粒子の凝集反応を利用したラテックス凝集免疫測定法や、磁性粒子を利用したＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）などが挙げられる。
大型の自動分析装置では、測定試薬を装置にセットする手間や時間を省くために、被検試料の測定終了後も、各試薬容器をそのまま装置内の試薬庫に保存し、そのまま次回の測定に使用できるようになっている。そのため、温度変化による試薬の劣化を防止するために、試薬庫は保冷機能を有しているのが一般的である。
さらに、特許文献１のように、試薬分注時に自動的に開閉する蓋を取り付けたり、特許文献２のように、試薬庫内の湿度を上昇させたりすることにより、試薬庫内での試薬の蒸発を抑制し、揮発による試薬の濃縮、および揮発した試薬の他の試薬へのコンタミネーションに対する対策も講じられている。
それにもかかわらず、一部の測定試薬では、自動分析装置の試薬庫内で保存すると、経時的に反応性が低下する（オンボード安定性不良）という問題が見られた。

特開２００６−０３０１７０号公報 特開２０１１−１９１１１７号公報

したがって、本発明の課題は、不溶性担体を使用する免疫学的測定試薬、たとえば、感作ラテックス粒子を含むラテックス凝集免疫測定試薬において、オンボードでの反応性低下を抑制し、そのオンボード安定性を向上させる方法、およびオンボード安定性を向上させた免疫学的測定試薬を提供することにある。

本発明者らは、前記の問題点を解決すべく鋭意検討した結果、不溶性担体を使用する免疫学的測定試薬に、酸素ラジカル吸収剤を添加することにより、反応性低下を抑制し、オンボード安定性を向上できることを見出し、本発明に至った。

本発明は、以下の発明に関する：
［１］酸素ラジカル吸収剤を含む、不溶性担体を用いる免疫学的測定試薬。
［２］免疫学的測定が、ラテックス凝集免疫測定、あるいは、磁性粒子を用いる免疫学的測定法である、［１］の測定試薬。
［３］前記酸素ラジカル吸収剤が、分析対象物質に対する抗原または抗体を固定化した不溶性担体と共に含まれる、［１］又は［２］の測定試薬。
［４］自動分析装置用の試薬である、［１］〜［３］のいずれかの測定試薬。
［５］前記酸素ラジカル吸収剤が、メチオニン、シスチン、グルタチオン（酸化型）、ヒドロキシメチルＥＤＯＴ、亜硝酸ナトリウムからなる群から選んだ化合物である、［１］〜［４］のいずれかの測定試薬。
［６］前記酸素ラジカル吸収剤の濃度が１．０×１０^−６重量％〜２．０重量％である、［１］〜［５］のいずれかの測定試薬。
［７］分析対象物質に対する抗原または抗体を固定化した不溶性担体を含む免疫学的測定試薬に酸素ラジカル吸収剤を添加する、前記免疫学的測定試薬のオンボード安定性を向上させる方法。

本発明の免疫学的測定試薬によれば、オンボードでの反応性低下を抑制し、前記測定試薬のオンボード安定性を向上させることができる。

次亜塩素酸ナトリウムの存在に起因する抗可溶性フィブリン（ＳＦ）抗体感作ラテックス溶液の反応性低下に対して、各種物質の反応性低下抑制効果を示すグラフである。 次亜塩素酸ナトリウムの存在に起因する抗可溶性フィブリン（ＳＦ）抗体感作ラテックス溶液の反応性低下に対して、各種酸素ラジカル吸収剤の反応性低下抑制効果を示すグラフである。 次亜塩素酸ナトリウムの存在に起因する抗可溶性フィブリン（ＳＦ）抗体感作ラテックス溶液の反応性低下に対して、各種濃度のＬ−メチオニンの反応性低下抑制効果を示すグラフである。 次亜塩素酸ナトリウムの存在に起因する抗可溶性フィブリン（ＳＦ）抗体感作ラテックス溶液の反応性低下に対して、各種濃度のＬ−（−）−シスチンの反応性低下抑制効果を示すグラフである。 次亜塩素酸ナトリウムの存在に起因する抗可溶性フィブリン（ＳＦ）抗体感作ラテックス溶液の反応性低下に対して、各種濃度のグルタチオン（酸化型）の反応性低下抑制効果を示すグラフである。 次亜塩素酸ナトリウムの存在に起因する抗可溶性フィブリン（ＳＦ）抗体感作ラテックス溶液の反応性低下に対して、各種濃度の亜硝酸ナトリウムの反応性低下抑制効果を示すグラフである。 次亜塩素酸ナトリウムの存在に起因する抗組織プラスミノゲンアクチベータ・プラスミノゲンアクチベータインヒビター１複合体（ｔ−ＰＡ・ＰＡＩ−１複合体）抗体感作ラテックス溶液の反応性低下に対して、Ｌ−メチオニンの反応性低下抑制効果を示すグラフである。

本発明の測定試薬は、不溶性担体を使用する免疫学的測定試薬であって、酸素ラジカル吸収剤を含むものである。

本明細書において、酸素ラジカルとは、不対電子を持った原子（または分子）であるフリーラジカルのうち、酸素原子をもつものを意味する。例えば、スーパーオキシドアニオンラジカル（・Ｏ_２ ⁻）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）が挙げられる。不対電子を持つ分子は非常に不安定であり、対をなすために相手から電子を奪って安定になろうとするため、反応性が高く、脂質、たんぱく質、核酸、糖質などを攻撃し、その機能を傷害しうる。例えば、次亜塩素酸ナトリウムは常温では比較的不安定で分解しやすい性質を持ち、それは自然分解、光分解、加熱分解、酸分解、重金属による触媒的分解によって、酸素を放出し、酸素ラジカルを発生させる。保管温度が高いと分解しやすいが、低温では比較的安定していることが知られている。ところが、意外にも、暗所で２〜１０℃程度に保たれる自動分析装置の試薬庫内でも、次亜塩素酸ナトリウムは分解され、測定試薬に影響を与えうることが本課題を解決しようとする中で判明した。

本発明で用いる酸素ラジカル吸収剤としては、酸素ラジカルを吸収するものであれば特に制限されないが、−Ｓ−や−Ｎ−、−Ｏ−の構造を有する低分子化合物が好ましい。また、沈殿等の不具合を生じやすいことから、水溶解度が０．１ｇ／Ｌ（２５℃）以上、好ましくは水溶解度が１ｇ／Ｌ（２５℃）以上であり、さらに好ましくは１０ｇ／Ｌ（２５℃）以上であり、溶液としたときにｐＨがｐＨ５〜１０の範囲となる化合物が望ましい。

具体的には、−Ｓ−の構造を持つアミノ酸またはその化合物としては、メチオニン、シスチン、システイン、グルタチオン（酸化型）、グルタチオンの前駆体であるＮ−アセチルシステイン、合成化合物である（２，３−ジヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキシン−２−イル）メタノール（別称：ヒドロキシメチルＥＤＯＴ）、亜硫酸塩（亜硫酸ナトリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナトリウム）等が挙げられる。−Ｎ−の構造を持つ化合物としては、亜硝酸塩（亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸カルシウム）が挙げられる。−Ｏ−の構造を持つ化合物としては、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、尿酸、トコフェロール類（αートコフェロール（ビタミンＥ））、ポリフェノール類（カテキン、タンニン、ルチン、イソフラボン、レビレチン、クロロゲン酸、エラグ酸、リグナン、セサミン、クルクミン、クマリン、オレオカンタール、クエルセチン）、合成化合物であるブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等が挙げられる。また、これらの化合物を２種類以上併用してもよい。

酸素ラジカル吸収剤の濃度は、オンボードで酸素ラジカルの影響を吸収できる濃度であれば特に限定されない。当業者であれば、酸素ラジカル吸収剤の溶解度やｐＨ、抗原抗体反応への影響等を考慮し、測定試薬毎に最適な添加濃度を決定することができる。通常、１．０×１０^−６重量％以上で効果が得られ、１．０×１０^−４重量％以上で優れた効果が得られ、１．０×１０^−２重量％以上で特に優れた効果を得ることができる。特に、−Ｓ−を有する化合物は低濃度でも効果が得られる傾向にあり、メチオニンでは１．０×１０^−７重量％から２．０重量％と広い濃度範囲で効果が得られる。添加量の上限は、酸素ラジカル吸収剤の溶解度等にもよるが、２．０重量％以下、より好ましくは１．０重量％以下、さらに好ましくは０．３重量％以下が適当である。

本発明の試薬は、用手法によっても測定可能であるが、自動分析装置に搭載される試薬として、特に好適に用いられる。本発明において、自動分析装置とは、主に臨床検査における使用を目的として各社より製造・販売されているものを指す。とくに、測定に用いる各試薬容器をそのまま次回測定時まで装置内で保存するための試薬庫を有する自動分析装置において、本発明の効果が得られやすい。具体的な例として、日立ハイテクノロジーズ社製の自動分析装置シリーズ、東芝メディカルシステムズ社製のＴＢＡシリーズ、日本電子社製のＢＭシリーズ、ベックマン・コールター・バイオメディカル社製、ロッシュ社製、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製などのいわゆる多項目（汎用試薬型）自動分析装置や、近赤外測定装置ＬＰＩＡ（登録商標）（ＬＳＩメディエンス社製）、散乱光強度測定装置（デイド・ベーリング社製）などのいわゆる専用試薬型自動分析装置、さらにシスメックス社製のＣＳ・ＣＡシリーズ、積水メディカル社製のＣＰシリーズ、アイ・エル社製のＡＣＬＴＯＰシリーズ、ＬＳＩメディエンス社製のＳＴＡＣＩＡ、アボット社製のＡＲＣＨＩＴＥＣＴアナライザーシリーズやシーメンス社製のＡＤＶＩＡ Ｃｅｎｔａｕｒシリーズなど、光学的測定が可能な血液凝固測定装置、発光免疫測定装置などを挙げることができる。

自動分析装置の試薬庫は、保存する測定試薬に合わせて所定の温度範囲で保管するための保冷機能を有しており、結露や試薬の蒸発等を防止するための手段が講じられていることが好ましい。自動分析装置によっては、測定に用いられるノズルやキュベットを洗浄するための洗浄液やリンス液等も、測定試薬とともに試薬庫に保存される。洗浄液には、アルカリ液、酸性液、中性洗剤（界面活性剤）、次亜塩素酸塩剤などがあるが、なかでも次亜塩素酸塩系の洗浄液と共に保存される場合、測定試薬が酸素ラジカルの影響を受けやすくなる。本発明の測定試薬は、試薬庫内で酸素ラジカルを発生しうる試薬や洗浄液と共に保存される場合も、反応性低下を抑制し、オンボード安定性を保つことができる。

本発明の測定試薬は、１試薬からなる試薬形態の他、第一試薬と第二試薬からなる２試薬系等の複数の試薬からなる試薬形態（すなわち、キット）であってもよい。たとえばラテックス凝集免疫測定法の場合、第一試薬と第二試薬からなる２試薬系が一般的によく用いられており、第一試薬は抗原抗体反応時の条件を整えるための緩衝液からなり、第二試薬は分析対象物質に対する抗原又は抗体を固定化したラテックス粒子からなる。複数の試薬からなる試薬形態の場合は、少なくとも抗原又は抗体を固定化したラテックス粒子と共に酸素ラジカル吸収剤が含まれていればよく、各試薬に酸素ラジカル吸収剤が含まれていてもよい。Ｂ／Ｆ分離を行う磁性粒子を使用する免疫学的測定法の場合、２から３液系で構成されることが多いが、上記と同様に、少なくとも抗原又は抗体を固定化した磁性粒子と共に酸素ラジカル吸収剤が含まれていればよい。

分析対象物質は、一般に抗原抗体反応を利用して分析することのできる物質（特に生理活性物質）であれば特に限定されない。分析対象物質の代表例としては、タンパク質や脂質等を挙げることができ、より詳しくは、例えば、各種抗原、抗体、レセプター、又は酵素等を挙げることができる。具体的には、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、リウマチ因子、フェリチン、β−２マイクログロブリン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、抗ストレプトリジンＯ抗体、ＩｇＥ、梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＳ抗体、ＨＢＳ抗原、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗体）、Ｄダイマー、フィブリン・フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）、可溶性フィブリン（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｉｂｒｉｎ：ＳＦ）、プラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体（ＰＰＩ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エラスターゼ１、エラスターゼＸＤＰ、トロンボモジュリン、トロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）、組織プラスミノゲンアクチベータ・プラスミノゲンアクチベータインヒビター１複合体（ｔ−ＰＡ・ＰＡＩ−１複合体）ヒアルロン酸、プレセプシン、ＩＬ−２Ｒ、抗ＤＮＡ抗体等を挙げることができる。

本発明に係る不溶性担体としては、通常この分野で用いられているものであれば特に限定はされないが、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーを重合させてなる単一重合体（例えば、ポリスチレン）の不溶性担体を挙げられる。また、共重合体（例えば、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体等）からなる不溶性担体、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体からなる不溶性担体を挙げられる。官能基としてカルボキシル基、１級アミノ基、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ_２）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ、基体が上記有機系微粒子からなる不溶性担体を挙げられる。

本発明では、不溶性担体として磁性粒子を用いることができる（特開平７−１５１７５５号公報参照）。磁性粒子は、磁気誘導により容易に磁化され得るもので、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ_２Ｏ_３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属や、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金を内部に含んだポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体、もしくはそれぞれのモノマーの２〜４種程度の共重合体などのラテックス、ゼラチン、リポソームからなる磁性粒子を例示できる。

不溶性担体に固定化する抗原又は抗体は、それぞれ分析対象物質と抗原抗体反応を起こす抗原又は抗体であれば特に限定されず、抗体（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む）としては、免疫グロブリン分子それ自体、あるいは抗体フラグメント［例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又はＦｖ］を用いることができる。なお、モノクローナル抗体を用いる場合には、分析対象物質である抗原に対して異なる部位で結合する２種類以上のモノクローナル抗体を用いる場合と、抗原の認識部位が２つ以上存在するときは１種類のモノクローナル抗体を用いる場合がある。

不溶性担体に抗原又は抗体を固定化する方法は、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、抗体と不溶性担体とを緩衝液中で懸濁させ、２５℃で１時間反応させた後、遠心分離、ブロッキング処理等、通常この分野で行われる処理により得ることができる。また、抗原又は抗体と不溶性担体とを化学結合により固相する方法や、ビオチン−アビジン反応により固相する方法も選択できる。

不溶性担体のブロッキング処理に使用する成分としては、公知のブロッキング剤を適宜選択して使用できるが、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、セリシン等のタンパク質成分のブロッキング剤の他、親水性ブロックと疎水性ブロックとからなる合成ポリマーのブロッキング剤を挙げることができる。

本発明の測定試薬は、免疫学的測定試薬に添加可能な添加剤、例えば、緩衝液、非特異反応抑制剤、増感剤などをさらに含有することができる。

前記緩衝液としては、分析対象物質の種類に応じて適切な各種緩衝液を選択することができる。この緩衝液は、分析対象物質を失活させることがなく、しかも抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよい。例えば、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、又はトリス緩衝液を使用することができる。

本発明の測定試薬に添加可能な非特異反応抑制剤としては、非特異反応の原因物質に対する抗体やレセプター；トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液又はグッド緩衝液などの緩衝液類；ＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰなどのキレート剤；塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムなどの塩類；脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルグリコシドなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

また、本発明の測定試薬に添加可能な増感剤としては、水溶性高分子やタンパク質が好適に用いられる。例えば、アルギン酸ナトリウムやアルギン酸プロピレングリコール、デキストランやデキストラン硫酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性高分子や、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン類、γ−グロブリンなどのグロブリン類などが挙げられる。

被検試料は、分析対象物質である抗原又は抗体を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、臨床診断に一般的に用いられる生体由来液、例えば、血液、血清、血漿、又は尿、あるいは実験サンプルなどを挙げることができる。

本発明はまた、免疫学的測定試薬のオンボードでの反応性低下を抑制し、オンボード安定性を向上させるための方法を含む。本発明において、オンボード安定性とは、自動分析装置の試薬庫内に測定試薬を設置した状態での保存安定性のことを意味する。オンボード安定性が向上するとは、自動分析装置の試薬庫内に試薬を設置した状態で一定期時間経過した後、試薬の反応性の変動が抑えられていることを意味する。

オンボード安定性の評価方法は、自動分析装置の試薬庫内に、装置の取扱い説明書及び試薬の添付文書に従った状態で搭載し、一定期間内の安定性を評価する。開封時間、及び試薬庫への搭載期間は限定されるものではないが、一般的には、１日あたり５時間〜２４時間開封した状態で、５日間から１０５日間（１５週間）の安定性が評価される。安定性としては、開封直後の試薬に対して、一定期間装置に搭載後の試薬の反応性が１００±２０％以内であることが望ましく、好ましくは１００±１５％以内であることが望ましい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：反応性低下を抑制する物質の検討》
検討には、汎用の自動分析装置用試薬であるイアトロＳＦ II（ＬＳＩメディエンス社製）を使用した。
反応性低下を抑制する物質の検討を、活性炭（アズワン株式会社）、５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液（Ｗａｋｏ）、エージレス（登録商標）（三菱ガス化学）で行った。試薬庫内の状況を再現するため、自動分析装置に用いられる次亜塩素酸ナトリウム系の洗浄液をポリエチレン製容器（５０ｍＬ用、アイボーイ）に５０ｍＬ用意した。イアトロＳＦ IIの第二試薬（抗ＳＦ（可溶性フィブリン）抗体感作ラテックス溶液）をポリエチレン製容器（１１ｍＬ用、正栄樹脂）に９ｍＬ入れ、フタを空けた状態でチャック式ポリ袋（セイニチ）に入れ、ここに、洗浄液と各検討物質とを入れ、チャックを閉めて２〜１０℃で２１日間保管した。
洗浄液の対照として、ＲＯ水５０ｍＬを同じようにラテックス溶液及び各検討物質と共に保管した。

２１日間経過した試薬を用いて、反応性の評価を日立７１７０Ｓ型自動分析装置にて行った。ＳＦ標準品３μＬとイアトロＳＦ IIの第一試薬を混合し、３７℃で約５分間保持した後、各検討物質と共に保管した第二試薬を添加し、約５分間経過後の吸光度変化を波長８００ｎｍで測定した。
洗浄液と共存させた試薬、ＲＯ水と共存させた試薬それぞれで測定を実施し、ＲＯ水と共存させた試薬に対しての吸光度変化率％を求めた。

結果を図１に示す。その結果、ヒドロキシラジカル吸収作用のある水酸化ナトリウム、及び、密閉容器中で脱酸素状態を作り出す脱酸素剤であるエージレスに反応性低下抑制の効果が認められ、自動分析装置の試薬庫内において、測定試薬はエアコンタミによる酸素や酸素ラジカルの影響を受けることが判明した。

《実施例２：酸素ラジカル吸収剤の検討》
測定試薬に添加して使用することのできる酸素ラジカル吸収剤を探索した。イアトロＳＦ IIの第二試薬（抗ＳＦ（可溶性フィブリン）抗体感作ラテックス溶液）に、酸素ラジカル吸収剤の候補化合物として、Ｌ−（−）−シスチン（ナカライテスク）、ヒドロキシメチルＥＤＯＴ（Ｓｉｇｍａ−ＡＬＤＲＩＣＨ）、亜硝酸ナトリウム（和光）、酸化型グルタチオン（Ｗａｋｏ）、Ｌ−メチオニン（Ｗａｋｏ）をそれぞれ０．１％添加した。洗浄液の代わりに、次亜塩素酸ナトリウム溶液（Ｗａｋｏ）をポリエチレン製容器（５０ｍＬ用、アイボーイ）に５０ｍＬ入れたものを用意した。各酸素ラジカル吸収剤を添加したラテックス溶液をポリエチレン製容器（１１ｍＬ用、正栄樹脂）に４ｍＬ入れ、フタを空けた状態でチャック式ポリ袋（セイニチ）に、次亜塩素酸ナトリウム溶液と共に入れ、チャックを閉めて２〜１０℃で１４日間保管した。次亜塩素酸ナトリウム溶液５０ｍＬに対し、５本のラテックス溶液を共に入れた。
次亜塩素酸ナトリウム溶液の対照として、ＲＯ水５０ｍＬを同じように各吸収剤を添加したラテックス溶液と共に保管した。

１４日間経過した試薬を用いて、反応性の評価を日立７１７０Ｓ型自動分析装置にて行った。ＳＦ標準品３μＬとイアトロＳＦ IIの第一試薬を混合し、３７℃で約５分間保持した後、各種酸素ラジカル吸収剤を含む第二試薬を添加し、約５分間経過後の吸光度変化を波長８００ｎｍで測定した。
次亜塩素酸ナトリウム溶液と共存させた試薬、ＲＯ水と共存させた試薬それぞれで測定を実施し、ＲＯ水と共存させた試薬に対しての吸光度変化率％を求めた。

結果を図２に示す。ＲＯ水と共存させた試薬に対して、８５％以上の反応性が得られるものを反応性低下抑制効果あり、と判断した。その結果、いずれの候補化合物にも反応性低下抑制効果が認められた。

《実施例３：反応性低下の原因検討》
反応性低下の原因検討として、保管後の抗体感作ラテックス溶液をウェスタンブロット法により解析した。
実施例２で得られたラテックス溶液（サンプル１：メチオニン０％・ＲＯ水と同梱、サンプル２：メチオニン０．１重量％・ＲＯ水と同梱、サンプル３：メチオニン０重量％・次亜塩素酸ナトリウム溶液と同梱、サンプル４：メチオニン０．１重量％・次亜塩素酸ナトリウム溶液と同梱）各２ｍＬを、１４０００ｒｐｍ、１０℃、３０分間遠心し、抗体感作ラテックス粒子と上清に分離した。その上清をアミコンウルトラ（Amicon Ultra）−０．５ｍＬ遠心式フィルター（Amicon Ultra-0.5mL Centrifugal Filters Ultracel-10k；Ｍｅｒｃｋ）で、１．８ｍＬから７０μＬまで濃縮したものを上清サンプルとした。
上記サンプル中の抗ＳＦ抗体をＷＢ法ウェスタンブロット法によって検出した。システムはＮｕＰＡＧＥ電気泳動システム，X-Cell IIブロットモジュール（いずれもインビトロジェン）を用いた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は非還元サンプルで行った。抗体の検出には、Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）、及びアルカリホスファターゼ標識抗ウサギ抗体（抗ウサギ抗体−ＡＬＰ；インビトロジェン）を用いた。

その結果、サンプル２、４の上清サンプルはサンプル１と同程度のＩｇＧ由来の断片が検出された。ところが、サンプル３ではサンプル１と比べて、上清サンプル中に多量のＩｇＧ由来の断片が検出され、次亜塩素酸ナトリウム溶液の影響により、抗体感作ラテックス粒子から抗体が上清中に剥がれていることを確認した。さらに保管期間を１週間延長したサンプルを検討し、次亜塩素酸ナトリウム溶液の影響により、上清中に剥がれた抗体が経時的に分解されていることを確認した。

《実施例４：酸素ラジカル吸収剤の有効濃度の検討》
（１）Ｌ−メチオニンの有効濃度
安価で入手容易なメチオニンについて、有効濃度の検討を実施した。イアトロＳＦ IIの第二試薬に、Ｌ−メチオニン（Ｗａｋｏ）をそれぞれ、０．０重量％、１．０×１０^−６重量％、１．０×１０^−５重量％、３．０×１０^−５重量％、６．０×１０^−６重量％、１．０×１０^−４重量％、３．０×１０^−４重量％、６．０×１０^−４重量％、１．０×１０^−３重量％、１．０×１０^−１重量％、３．０×１０^−１重量％、１．０重量％、２．０重量％添加し、ラテックス溶液を調製した。
次亜塩素酸ナトリウム溶液（Ｗａｋｏ）をポリエチレン製容器（５０ｍＬ用、アイボーイ）に５０ｍＬ入れ、各ラテックス容器をポリエチレン製容器（１１ｍＬ用、正栄樹脂）に４ｍＬ入れ、フタを空けた状態でチェック式ポリ袋（セイニチ）に共に入れ、チャックを閉めて２〜１０℃で１４日間保管した。次亜塩素酸ナトリウム溶液５０ｍＬに対し、５本のラテックス溶液を共に入れた。
次亜塩素酸ナトリウム溶液の対照として、ＲＯ水５０ｍＬを同じようにラテックス溶液と共に保管した。

１４日間経過した試薬を用いて、反応性の評価を日立７１７０Ｓ型自動分析装置にて行った。ＳＦ標準品３μＬとイアトロＳＦ IIの第一試薬１５０μＬを混合し、３７℃で約５分間保持した後、第二試薬として、上記のラテックス溶液を添加し、約５分間経過するまでの間の吸光度を波長８００ｎｍで測定した。Ｌ−メチオニン（Ｗａｋｏ）添加ラテックス試薬、０．０重量％、１．０×１０^−６重量％、１．０×１０^−５重量％、３．０×１０^−５重量％、６．０×１０^−６重量％、１．０×１０^−４重量％、３．０×１０^−４重量％、６．０×１０^−４重量％、１．０×１０^−３重量％、１．０×１０^−１重量％、３．０×１０^−１重量％、１．０重量％、２．０重量％、それぞれについて、次亜塩素酸ナトリウム溶液と共存させたもの、ＲＯ水と共存させたもので測定を実施し、ＲＯ水と共存させた試薬に対しての吸光度変化を求めた。

結果を図３に示す。ＲＯ水と共存させた試薬に対して、８５％以上の反応性が得られるものを効果あり、と判断した。その結果、Ｌ−メチオニン濃度１．０×１０^−６重量％〜２．０重量％で、次亜塩素酸ナトリウムによる反応性低下を抑制する効果が認められ、オンボード安定性が向上した。

《実施例５：その他の酸素ラジカル吸収剤の有効濃度の検討》
イアトロＳＦ IIの第二試薬に、Ｌ−（−）−シスチン（ナカライテスク）を、０．０重量％、１．０×１０^−４重量％、１．０×１０^−３重量％、１．０×１０^−１重量％、３．０×１０^−１重量％、グルタチオン（酸化型）（和光）を０．０重量％、１．０×１０^−４重量％、１．０×１０^−３重量％、１．０×１０^−１重量％、１．０重量％、亜硝酸ナトリウム（和光）を０．０重量％、１．０×１０^−４重量％、１．０×１０^−３重量％、１．０×１０^−１重量％、１．０重量％添加し、ラテックス溶液を調製した。
実施例４と同様に次亜塩素酸ナトリウム溶液及びＲＯ水とそれぞれ共存させた状態で２〜１０℃で１６日間保管し、日立７１７０Ｓ型自動分析装置で測定を実施し、ＲＯ水と共存させた試薬に対しての吸光度変化を求めた。

結果を図４〜図６に示す。シスチンでは１．０×１０^−４重量％〜３．０×１０^−１重量％で、グルタチオン（酸化型）では１０^−４重量％〜１．０重量％で、亜硝酸ナトリウムでは１．０×１０^−４重量％〜１．０×１０^−１重量％で、次亜塩素酸ナトリウムによる反応性低下の抑制効果が認められ、オンボード安定性が向上した。なお、亜硝酸ナトリウムを１．０重量％添加したラテックス溶液は、保管中に凝集してしまい、測定することができなかった。

《実施例６：別試薬において反応性低下の抑制効果を確認》
市販品の組織プラスミノゲンアクチベータ・プラスミノゲンアクチベータインヒビター１複合体（ｔ−ＰＡ・ＰＡＩ−１複合体）測定キットを用いて、次亜塩素酸ナトリウム溶液の影響を確認した。本試薬は２試薬系であり、第一試薬は緩衝液、第二試薬は抗体感作ラテックス粒子を含む。第二試薬であるラテックス溶液について、Ｌ−メチオニン（Ｗａｋｏ）をそれぞれ、０．０重量％、０．１重量％添加し、実施例２と同様に次亜塩素酸ナトリウム溶液及びＲＯ水とそれぞれ共存させた状態で２〜１０℃で２１日間保管し、日立７１７０Ｓ型自動分析装置で測定を実施し、ＲＯ水と共存させた試薬に対しての吸光度変化を求めた。

結果を図７に示す。その結果、ｔ−ＰＡ・ＰＡＩ−１複合体測定キットにおいても、次亜塩素酸ナトリウム溶液と共存させることにより、Ｌ−メチオニン０．０重量％（無添加品）では、反応性の低下が認められたが、Ｌ−メチオニン０．１重量％添加することにより、反応性の低下が抑制され、オンボード安定性が向上した。

本発明の測定試薬は、生体試料中の成分を分析する自動分析装置の測定試薬として好適に使用できる。また、本発明のオンボード安定性を向上させる方法は、前記自動分析装置の測定試薬の製造に利用できる。

Claims (7)

1. 酸素ラジカル吸収剤を含む、不溶性担体を用いる免疫学的測定試薬。
2. 免疫学的測定が、ラテックス凝集免疫測定、あるいは、磁性粒子を用いる免疫学的測定法である、請求項１に記載の測定試薬。
3. 前記酸素ラジカル吸収剤が、分析対象物質に対する抗原または抗体を固定化した不溶性担体と共に含まれる、請求項１又は２に記載の測定試薬。
4. 自動分析装置用の試薬である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定試薬。
5. 前記酸素ラジカル吸収剤が、メチオニン、シスチン、グルタチオン（酸化型）、ヒドロキシメチルＥＤＯＴ、亜硝酸ナトリウムからなる群から選んだ化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の測定試薬。
6. 前記酸素ラジカル吸収剤の濃度が１．０×１０^−６重量％〜２．０重量％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の測定試薬。
7. 分析対象物質に対する抗原または抗体を固定化した不溶性担体を含む免疫学的測定試薬に酸素ラジカル吸収剤を添加する、前記免疫学的測定試薬のオンボード安定性を向上させる方法。