JPWO2008029873A1 - 抗原およびその抗原に対する抗体を測定する方法、並びにそれに用いる測定用試薬 - Google Patents
抗原およびその抗原に対する抗体を測定する方法、並びにそれに用いる測定用試薬 Download PDFInfo
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Abstract
試料中の抗原またはその抗原に対する抗体を測定するため、測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原を用い、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されており、試料と、その測定用試薬とを混合し、抗原抗体反応による凝集の上昇または下降の度合いから、試料中の抗原または抗体を測定することにより、試料中の抗原またはその抗原に対する抗体のいずれをも、同一試薬を用いて正確に測定することができる。
Description
本発明は、抗原およびその抗原に対する抗体を測定する方法、並びにそれに用いる測定用試薬に関する。更に詳細には、本発明は、試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて、免疫凝集測定法により測定する方法であり、例えば、ＩｇＡなどの抗原、および抗ＩｇＡ抗体などのその抗原に対する抗体のいずれをも、同一の試薬を用いて測定することができる方法、並びにそれに用いる測定用試薬に関する。
血液中のＩｇＡは、慢性炎症、慢性肝炎、肝硬変、ＩｇＡ腎症、リウマチなどの膠原病、ＩｇＡ型骨髄腫などで高値を示すことから、臨床検査の分野でルーチン的に測定されている。ＩｇＡの測定方法としては、通常、免疫比濁法（ＴＩＡ法）によるものが用いられている（特許文献１）。ＴＩＡ法とは、検体中のＩｇＡなどの抗原を測定する方法で、検体中の抗原と、試薬としての抗体とにより、抗原抗体反応をさせ、生じる濁度の度合いにより、その抗原の量を測定する方法である。この方法は、ＩｇＡなどの高濃度に存在する抗原を測定する場合、試料を希釈せず測定できるという長所がある。しかし、抗体を多量に使用するので、測定試薬の値段が高価になるという問題があった。
ところで、一部の人は、ＩｇＡがほとんど含まれておらず、ＩｇＡが欠損している場合もあることが知られている。また、そのＩｇＡ欠損の人には、ＩｇＡに対する抗体、すなわち、抗ＩｇＡ抗体を有している人も存在するとされている。抗ＩｇＡ抗体を有している人が、万一、病気や事故により輸血が必要となった場合、抗ＩｇＡ抗体保有患者に、一般人、すなわち、ＩｇＡを有している人由来の血液を用いて輸血すると、患者血液内で、抗ＩｇＡ抗体とＩｇＡとにより抗原抗体反応が起こり、その結果、アナフィキラシー反応、すなわち、ショックを呈し危険な状態になることが報告されている（非特許文献２）。なお、抗ＩｇＡ抗体を有していないＩｇＡ欠損の人でも、一般人、すなわち、ＩｇＡを有している人由来の血液で輸血を受けると、体内で抗ＩｇＡ抗体が産生されて、その抗体を有するようになる。そのため、そのような人は、二度目に、一般人の血液で輸血を受けると、ショック反応が起こることになる。
このようなショック反応をなくすためには、抗ＩｇＡ抗体を含む患者には、輸血血液として、ＩｇＡを含まない人の血液が必要とされる。そのため、患者側、輸血側の両方の血液に対し、抗ＩｇＡ抗体が含まれているかどうかを検査する必要がある。しかし、現状では、抗ＩｇＡ抗体を測定する試薬は、臨床検査の分野では、提供されていないので、どの人が抗ＩｇＡ抗体を有しているか測定されておらず、早急に対応することが必要であるとされている。
久保信彦ら、日本臨床、第５７巻、１９９９年増刊号、１０−１２頁 右田孝子ら、日本輸血学会雑誌、第５０巻、第３号、４１９−４２４頁（２００４）
久保信彦ら、日本臨床、第５７巻、１９９９年増刊号、１０−１２頁 右田孝子ら、日本輸血学会雑誌、第５０巻、第３号、４１９−４２４頁（２００４）
本発明は、従来、試料中の抗原や抗体を測定することには、ほとんど用いられなかった競合的均一系免疫凝集測定法と、通常の免疫凝集測定法を適用して、抗原を測定できるとともに、試料中のその抗原に対する抗体をも測定できる方法および測定用試薬を提供することにある。
そのような状況下、本発明者は、試料中のＩｇＡを測定する方法を検討した。その結果、従来、臨床検査の分野では、あまり用いられることがなかった競合的均一系免疫凝集測定法を用いるとその目的を達成することが判明した。また、その試薬によりＩｇＡを測定しようとすると、検体によっては、ＩｇＡ値がマイナスになる場合があることを発見した。さらに、そのような検体は、ＩｇＡを含まず、かつ、抗ＩｇＡ抗体を含んでいることがわかった。その結果、驚くべきことに、この試薬が、試料中のＩｇＡを測定できるとともに、抗ＩｇＡ抗体をも測定できていることが判明した。さらに、この知見をもとに試料中の抗原および抗体を同一の試薬で同時に測定できる方法の開発を目指し鋭意検討した。本発明は、かかる経過により達成されたものである。
従って、本発明は、以下に記載した（１）から（１１）の発明に関する。
（１）試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
（ｉ）測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されており、
（ｉｉ）試料と、その測定用試薬とを混合し、
（ｉｉｉ）抗原抗体反応による凝集の上昇または下降の度合いから、試料中の抗原または抗体を測定する
ことを含む上記方法。
（２）試料として、抗原を含みその抗原に対する抗体を含まない試料、抗原を含まずその抗原に対する抗体を含む試料、または抗原とその抗原に対する抗体のいずれをも含まない試料を測定対象とする上記（１）の方法。
（３）試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
（ｉ）測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、試薬中の抗原が微細粒子に担持されており、
（ｉｉ）試料と、その測定用試薬とを混合し、
（ｉｉｉ）試料中に抗原が含まれる場合には、測定用試薬としての抗体と、試料中の抗原および測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原との間で、抗原抗体反応を競合させて、抗原抗体反応による凝集の下降の度合いから、試料中の抗原を測定し、
(ｉｖ)試料中に抗体が含まれる場合には、測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原と、試料中の抗体および測定試薬としての抗体とを抗原抗体反応させて抗原抗体反応による凝集の上昇の度合いから、試料中の抗体を測定する、
上記（１）または（２）記載の測定方法。
（４）試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
（ｉ）測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、試薬中の抗体が微細粒子に担持されており、
（ｉｉ）試料と、その測定用試薬とを混合し、
（ｉｉｉ）試料中に抗原が含まれる場合には、測定用試薬としての微細粒子が担持された抗体と、試料中の抗原および測定用試薬としての抗原とを、抗原抗体反応させて、抗原抗体反応による凝集の上昇の度合いから、試料中の抗原を測定し、
（ｉｖ）試料中に抗体が含まれる場合には、測定試薬の抗原と、試料中の抗体および測定用試薬として微細粒子に担持された抗体との間で、抗原抗体反応を競合させて、抗原抗体反応による凝集の下降の度合いから、試料中の抗体を測定する、
上記（１）または（２）記載の上記方法。
（５）抗原が、通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原である、上記（１）から（４）のいずれかの方法。
（６）試料中の抗原がＩｇＡで、試料中の抗体が抗ＩｇＡ抗体である請求項１から５のいずれかの方法。
（７）測定用試薬として抗体と微細粒子に担持された抗原とを用いて、プロゾーン現象を回避して、試料を希釈することなく実施する上記（１）から（３）および（５）から（６）のいずれかの方法。
（８）試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも測定するための測定用試薬であって、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原を含み、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されている、測定用試薬。
（９）試料として、抗原を含みその抗原に対する抗体を含まない試料、抗原を含まずその抗原に対する抗体を含む試料、または抗原とその抗原に対する抗体のいずれをも含まない試料を測定対象とする上記（８）の測定用試薬。
（１０）抗原が、通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原である、上記（８）または（９）の測定用試薬。
（１１）試料中の抗原がＩｇＡで、試料中の抗体が抗ＩｇＡ抗体である上記（８）から（１０）のいずれかの測定用試薬。
（１）試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
（ｉ）測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されており、
（ｉｉ）試料と、その測定用試薬とを混合し、
（ｉｉｉ）抗原抗体反応による凝集の上昇または下降の度合いから、試料中の抗原または抗体を測定する
ことを含む上記方法。
（２）試料として、抗原を含みその抗原に対する抗体を含まない試料、抗原を含まずその抗原に対する抗体を含む試料、または抗原とその抗原に対する抗体のいずれをも含まない試料を測定対象とする上記（１）の方法。
（３）試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
（ｉ）測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、試薬中の抗原が微細粒子に担持されており、
（ｉｉ）試料と、その測定用試薬とを混合し、
（ｉｉｉ）試料中に抗原が含まれる場合には、測定用試薬としての抗体と、試料中の抗原および測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原との間で、抗原抗体反応を競合させて、抗原抗体反応による凝集の下降の度合いから、試料中の抗原を測定し、
(ｉｖ)試料中に抗体が含まれる場合には、測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原と、試料中の抗体および測定試薬としての抗体とを抗原抗体反応させて抗原抗体反応による凝集の上昇の度合いから、試料中の抗体を測定する、
上記（１）または（２）記載の測定方法。
（４）試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
（ｉ）測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、試薬中の抗体が微細粒子に担持されており、
（ｉｉ）試料と、その測定用試薬とを混合し、
（ｉｉｉ）試料中に抗原が含まれる場合には、測定用試薬としての微細粒子が担持された抗体と、試料中の抗原および測定用試薬としての抗原とを、抗原抗体反応させて、抗原抗体反応による凝集の上昇の度合いから、試料中の抗原を測定し、
（ｉｖ）試料中に抗体が含まれる場合には、測定試薬の抗原と、試料中の抗体および測定用試薬として微細粒子に担持された抗体との間で、抗原抗体反応を競合させて、抗原抗体反応による凝集の下降の度合いから、試料中の抗体を測定する、
上記（１）または（２）記載の上記方法。
（５）抗原が、通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原である、上記（１）から（４）のいずれかの方法。
（６）試料中の抗原がＩｇＡで、試料中の抗体が抗ＩｇＡ抗体である請求項１から５のいずれかの方法。
（７）測定用試薬として抗体と微細粒子に担持された抗原とを用いて、プロゾーン現象を回避して、試料を希釈することなく実施する上記（１）から（３）および（５）から（６）のいずれかの方法。
（８）試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも測定するための測定用試薬であって、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原を含み、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されている、測定用試薬。
（９）試料として、抗原を含みその抗原に対する抗体を含まない試料、抗原を含まずその抗原に対する抗体を含む試料、または抗原とその抗原に対する抗体のいずれをも含まない試料を測定対象とする上記（８）の測定用試薬。
（１０）抗原が、通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原である、上記（８）または（９）の測定用試薬。
（１１）試料中の抗原がＩｇＡで、試料中の抗体が抗ＩｇＡ抗体である上記（８）から（１０）のいずれかの測定用試薬。
本発明の測定方法および測定用試薬により、競合的均一系免疫凝集測定法と、通常の免疫凝集測定法を適用して、試料中に抗原を含む場合は、その抗原を測定でき、試料中にその抗原に対する抗体が存在する場合には、その抗体を測定することもできる。加えて、測定用試薬として用いる高価な抗体の量を少なく用いて、同一の試薬で、一回の測定で、試料中に抗原が存在する場合には、抗原を測定でき、抗体が存在する場合には、抗体を測定でき、試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれをも測定できる。また、試料中に、抗原およびその抗原に対する抗体のいずれもが存在しない場合でも、本発明の測定方法および測定用試薬により、それらが存在しないことを確認することもできる。
また、ＩｇＡなどの通常の生体試料中では高濃度で存在する抗原を測定する場合には、測定用試薬として、その抗原に対する抗体と、微細粒子に担持させた抗原とを用いることにより、プロゾーン現象を回避して、試料を希釈することなく、試料中の抗原を測定することができる。
従って、本発明の測定方法および測定用試薬は、輸血の際のショック反応をなくすために、輸血をする側および受ける側の両方の血液に対し、抗ＩｇＡ抗体が含まれているかどうかを検査するために用いることができる。また、慢性炎症、慢性肝炎、肝硬変、ＩｇＡ腎症、リウマチなどの膠原病、ＩｇＡ型骨髄腫などをＩｇＡレベルに基き診断する臨床検査の分野でも用いることができる。
また、ＩｇＡなどの通常の生体試料中では高濃度で存在する抗原を測定する場合には、測定用試薬として、その抗原に対する抗体と、微細粒子に担持させた抗原とを用いることにより、プロゾーン現象を回避して、試料を希釈することなく、試料中の抗原を測定することができる。
従って、本発明の測定方法および測定用試薬は、輸血の際のショック反応をなくすために、輸血をする側および受ける側の両方の血液に対し、抗ＩｇＡ抗体が含まれているかどうかを検査するために用いることができる。また、慢性炎症、慢性肝炎、肝硬変、ＩｇＡ腎症、リウマチなどの膠原病、ＩｇＡ型骨髄腫などをＩｇＡレベルに基き診断する臨床検査の分野でも用いることができる。
本発明において、試料とは、例えば、生体由来の液体試料であり、具体的には、血漿、血清、尿等を例示できるが、血漿、血清等の血液由来の試料が好適である。本発明において、試料としては、抗原を含みその抗原に対する抗体を含まない試料、抗原を含まずその抗原に対する抗体を含む試料、抗原とその抗原に対する抗体のいずれも含まない試料の３種が想定され、いずれの試料も測定対象とすることができる。なお、試料に抗原とその抗原に対する抗体のいずれも含む場合には、そのような試料が得られる生体内で抗原抗体反応が起こり、ショック反応が起こるので、そのような試料はあり得ない。
本発明の測定方法および測定用試薬に好適な試料中の抗原としては、「通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原」である。そのような抗原として、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、ハプトグロブリン、α２−マクログロブリン、補体Ｃ９、補体Ｃ４等を例示できる。
本発明の測定方法および測定用試薬に好適な試料中の抗体は、上記した試料中の抗原に対する抗体であり、例えば、それぞれ、抗ＩｇＡ抗体、抗ハプトグロブリン抗体、抗α２−マクログロブリン抗体、抗補体Ｃ９抗体、抗補体Ｃ４抗体等を例示できる。
本発明の測定方法および測定用試薬に好適な試料中の抗原としては、「通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原」である。そのような抗原として、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、ハプトグロブリン、α２−マクログロブリン、補体Ｃ９、補体Ｃ４等を例示できる。
本発明の測定方法および測定用試薬に好適な試料中の抗体は、上記した試料中の抗原に対する抗体であり、例えば、それぞれ、抗ＩｇＡ抗体、抗ハプトグロブリン抗体、抗α２−マクログロブリン抗体、抗補体Ｃ９抗体、抗補体Ｃ４抗体等を例示できる。
本発明の測定方法および測定用試薬に用いる試薬中の抗体としては、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体であれば特に限定しない。測定すべき抗原がＩｇＡ、ハプトグロブリン、α２−マクログロブリン、補体Ｃ９、補体Ｃ４のときは、それぞれ、試薬の抗体として抗ＩｇＡ抗体、抗ハプトグロブリン抗体、抗α２−マクログロブリン抗体、抗補体Ｃ９抗体、抗補体Ｃ４抗体を例示できる。そのような抗体の由来としては、例えば、ヒトの試料中の抗原およびその抗原に対する抗体を測定する場合には、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体であればいずれの由来でもよく、例えば、ヤギ由来抗体、ウサギ由来抗体、ラット由来抗体等を例示できる。また、本発明に用いる試薬の抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等のいずれをも使用することができる。また、本発明に用いる試薬の抗体として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体であれば、これらの抗体の断片であってもよい。
本発明の測定方法および測定用試薬に用いる試薬中の抗原としては、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原であれば特に限定しない。試薬の抗体として抗ＩｇＡ抗体、抗ハプトグロブリン抗体、抗α２−マクログロブリン抗体、抗補体Ｃ９抗体、抗補体Ｃ４抗体を用いるときは、測定用試薬の抗原として、それぞれＩｇＡ、ハプトグロブリン、α２−マクログロブリン、補体Ｃ９、補体Ｃ４を例示できる。また、試薬中の抗原は、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原であれば、その由来、製造法などはいずれでもよく、例えば、ヒトの試料中のＩｇＡまたは抗ＩｇＡ抗体を測定する場合には、ヤギ由来ＩｇＡ、ウサギ由来ＩｇＡ、ラット由来ＩｇＡ等を例示でき、また、組換えＩｇＡなどが挙げられる。また、試薬中の抗原は、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原であれば、これらの抗原の断片であってもよい。
本発明の測定方法および測定用試薬に用いる微細粒子は、免疫凝集反応に通常使用される微細粒子をそのまま使用することができる。最も一般的な微細粒子は、ラテックス粒子である。微細粒子は、通常０．０１〜０．５ミクロンのものが使用される。本発明において、抗原または抗体を微細粒子に担持させるには、担持の方法は、疎水性相互作用による物理的吸着法や共有結合法等の通常の担持する方法を用いることができる。
本発明の測定方法および測定用試薬に用いる試薬中の抗原としては、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原であれば特に限定しない。試薬の抗体として抗ＩｇＡ抗体、抗ハプトグロブリン抗体、抗α２−マクログロブリン抗体、抗補体Ｃ９抗体、抗補体Ｃ４抗体を用いるときは、測定用試薬の抗原として、それぞれＩｇＡ、ハプトグロブリン、α２−マクログロブリン、補体Ｃ９、補体Ｃ４を例示できる。また、試薬中の抗原は、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原であれば、その由来、製造法などはいずれでもよく、例えば、ヒトの試料中のＩｇＡまたは抗ＩｇＡ抗体を測定する場合には、ヤギ由来ＩｇＡ、ウサギ由来ＩｇＡ、ラット由来ＩｇＡ等を例示でき、また、組換えＩｇＡなどが挙げられる。また、試薬中の抗原は、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原であれば、これらの抗原の断片であってもよい。
本発明の測定方法および測定用試薬に用いる微細粒子は、免疫凝集反応に通常使用される微細粒子をそのまま使用することができる。最も一般的な微細粒子は、ラテックス粒子である。微細粒子は、通常０．０１〜０．５ミクロンのものが使用される。本発明において、抗原または抗体を微細粒子に担持させるには、担持の方法は、疎水性相互作用による物理的吸着法や共有結合法等の通常の担持する方法を用いることができる。
本発明の測定方法は、免疫凝集反応で、反応物および生成物のうちの、１個のみが濁りを有し、他の成分が水に溶解するか濁りがほとんどないということに基づいており、その原理を、測定用試薬として、抗体および微細粒子に担持された抗原を用いた場合について、以下に説明する。
まず、反応物として混合する対象は、試料中に抗原が存在する場合には、（ｉ−１）試料由来の抗原、試料中に抗体が存在する場合には、（ｉ−２）試料由来の抗体、（ｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原、および（ｉｉｉ）測定用試薬としての抗体であり、これら（ｉ）から（ｉｉｉ）の反応物は、すべて水に可溶あるいは均一分散可能である。
まず、反応物として混合する対象は、試料中に抗原が存在する場合には、（ｉ−１）試料由来の抗原、試料中に抗体が存在する場合には、（ｉ−２）試料由来の抗体、（ｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原、および（ｉｉｉ）測定用試薬としての抗体であり、これら（ｉ）から（ｉｉｉ）の反応物は、すべて水に可溶あるいは均一分散可能である。
次いで、これらを混合して抗原抗体反応をさせると、試料中に抗原が存在する場合には、（ｉｉｉ）測定用試薬としての抗体と、（ｉ−１）試料由来の抗原、および（ｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原との２つの抗原抗体反応物が競合して生成する。（ｉｉｉ）測定用試薬としての抗体と（ｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原との抗原抗体反応物は水に不溶性で濁りが生じるのに対し、（ｉｉｉ）測定用試薬としての抗体と（ｉ−１）試料由来の抗原との抗原抗体反応物はほとんど濁らない。従って、（ｉｉｉ）測定用試薬としての抗体と（ｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原との抗原抗体反応物が多く形成されればされるほど、反応液の濁度が増加する。
この競争反応では、（ｉ−１）の試料由来の抗原は、（ｉｉ）測定用試薬として微細粒子に担持された抗原と、一定量の（ｉｉｉ）測定用試薬としての抗体に対して、競争反応し、それによって、生じる、（ｉｉｉ）測定用試薬としての抗体と（ｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原との不溶性の抗原抗体反応物の量を減少させると同時に、反応溶液中の濁度を低下させる。そのため、試料中の抗原が高濃度になればなるほど、反応液の濁りが小さくなる。従って、濁りの下降の度合いから試料中の抗原を測定することができる。
また、試料中に抗体が存在する場合には、（ｉ−２）試料由来の抗体、および（ｉｉｉ）測定用試薬としての抗体と、（ｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原とが反応して、抗原抗体反応物が生成する。従って、試料中の抗体が高濃度になればなるほど、（ｉ−２）試料由来の抗体と（ｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原との抗原抗体反応物の量は上昇し、反応溶液中の濁度が上昇する。そのため、試料中の抗体が高濃度になればなるほど、反応液の濁りが上昇する。従って、濁りの上昇の度合いから試料中の抗体を測定することができる。
次いで、測定用試薬として、抗原および微細粒子に担持された抗体を用いた場合について、以下に説明する。
まず、反応物として混合する対象は、試料中に抗原が存在する場合には、（ｉ−１）試料由来の抗原、試料中に抗体が存在する場合には、（ｉ−２）試料由来の抗体、（ｉｉ）測定用試薬としての抗原、および（ｉｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗体であり、これら（ｉ）から（ｉｉｉ）の反応物は、すべて水に可溶あるいは均一分散可能である。
まず、反応物として混合する対象は、試料中に抗原が存在する場合には、（ｉ−１）試料由来の抗原、試料中に抗体が存在する場合には、（ｉ−２）試料由来の抗体、（ｉｉ）測定用試薬としての抗原、および（ｉｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗体であり、これら（ｉ）から（ｉｉｉ）の反応物は、すべて水に可溶あるいは均一分散可能である。
次いで、これらを混合して抗原抗体反応をさせると、試料中に抗原が存在する場合には、（ｉｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗体と、（ｉ−１）試料由来の抗原、および（ｉｉ）測定用試薬としての抗原との２つの抗原抗体反応物が生成する。これら２つの抗原との抗原抗体反応物は水に不溶性で濁りが生じる。従って、試料中の抗原が高濃度になればなるほど、（ｉ−１）試料由来の抗原と（ｉｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗体との抗原抗体反応物の量は上昇し、反応溶液中の濁度が上昇する。そのため、試料中の抗原が高濃度になればなるほど、反応液の濁りが上昇する。従って、濁りの上昇の度合いから試料中の抗原を測定することができる。
試料中に抗体が存在する場合には、（ｉi）測定用試薬としての抗原と、（ｉ−２）試料由来の抗体、および（ｉｉi）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗体との２つの抗原抗体反応物が競合して生成する。この競争反応では、（ｉ−２）の試料由来の抗体は、一定量の（ｉiｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗体と、（ｉｉ）測定用試薬としての抗原に対して、競争反応し、それによって、生じる、（ｉｉｉ）測定用試薬としての微細粒子に担持された抗体と（ｉｉ）測定用試薬としての抗原との不溶性の抗原抗体反応物の量を減少させると同時に、反応溶液中の濁度を低下させる。そのため、試料中の抗体が高濃度になればなるほど、反応液の濁りが小さくなる。従って、濁りの下降の度合いから試料中の抗体を測定することができる。
本発明においては、抗原抗体反応に基く凝集による濁度の度合いを測定する方法としては、通常、生成する濁りを吸光度で測定するのが一般的であるが、凝集塊を肉眼で観察したり、凝集をしなかった微細粒子を計数することによっても実施することができる。
本発明の測定方法を実施するには、例えば、次の具体的な方法が挙げられる。
測定用試薬として、抗体および微細粒子に担持された抗原を用いた場合には、まず、測定用試薬として、抗体（例えば、抗ＩｇＡ抗体）を緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）に均一分散した液（第一試薬）および測定すべき抗原（例えば、ＩｇＡ）と同じ抗原（例えば、ＩｇＡ）を担持した微細粒子（例えば、ラテックス粒子）を緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）に均一分散した液（第二試薬）を調製する。次いで、自動分析装置（例えば、日立７１８０型自動分析装置）を用いて、測定すべき抗原または抗体を含む試料に、第一試薬、次いで第二試薬を加えて抗原抗体反応をさせ、生じる凝集割合を特定波長（例えば、３４０ｎｍから８００ｎｍ）にて２ポイントエンド法により吸光度変化量として測定し、得られた測定値から、あらかじめ抗原または抗体濃度が既知の標準試料を用いて作成した検量線に基づいて、目的とする試料中の抗原または抗体を定量することができる。
測定用試薬として、抗体および微細粒子に担持された抗原を用いた場合には、まず、測定用試薬として、抗体（例えば、抗ＩｇＡ抗体）を緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）に均一分散した液（第一試薬）および測定すべき抗原（例えば、ＩｇＡ）と同じ抗原（例えば、ＩｇＡ）を担持した微細粒子（例えば、ラテックス粒子）を緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）に均一分散した液（第二試薬）を調製する。次いで、自動分析装置（例えば、日立７１８０型自動分析装置）を用いて、測定すべき抗原または抗体を含む試料に、第一試薬、次いで第二試薬を加えて抗原抗体反応をさせ、生じる凝集割合を特定波長（例えば、３４０ｎｍから８００ｎｍ）にて２ポイントエンド法により吸光度変化量として測定し、得られた測定値から、あらかじめ抗原または抗体濃度が既知の標準試料を用いて作成した検量線に基づいて、目的とする試料中の抗原または抗体を定量することができる。
作成する検量線は、後述する実施例３において図３に示されるように、例えば、横軸がプラスのときは抗原（例えば、ＩｇＡ）濃度を表し、横軸がマイナスのときは抗体（例えば抗ＩｇＡ抗体）濃度を表し、縦軸は、吸光度変化量を表すように作成することが好適である。なお、例えば、図３の検量線に基づき測定する場合に、測定吸光度変化量（ＯＤ×１００００）が、約１４００を示す場合には、すなわち、検量線が横切る濃度ゼロの位置における吸光度値である場合には、試料中には、抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも含まれないと判断することができる。
また、測定方法を実施する際に用いる、測定用試薬としての抗体および抗原を担持した微細粒子の使用量は、通常、測定対象の抗原や抗体、使用する試料の量によって異なるが、基本的には、それらの試薬を用いた競合的均一系免疫凝集測定法で検量線を作成でき、その結果、抗原を測定できるように設定するだけでよい。抗原としてＩｇＡ、抗体として抗ＩｇＡ抗体を自動分析装置（例えば、日立７１８０）で測定する場合、例えば、以下のとおりである。
試料を１．５〜３５μｌ、好ましくは５〜２５μｌを用いたとき、第一試薬に含まれる抗ＩｇＡ抗体濃度は、最終濃度（試料と第一試薬と第二試薬とを混合したときの濃度）として０．５〜５０μｇ／ｍｌ（ベッカータイターとして）、好ましくは１．５〜１５μｇ／ｍｌに、第二試薬に含まれるＩｇＡ感作ラテックス濃度は、０．００５〜０．５％、好ましくは０．０１５〜０．１５％に、ラテックスに感作したＩｇＡ濃度（ＩｇＡ重量換算）は、０．００５〜０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１５〜０．１５ｍｇ／ｍｌになるように設定すると良い。なお、このとき、第一試薬と第二試薬の量は、おのおの３０〜２５０μｌ、好ましくは５０〜１５０μｌの範囲で、かつ、サンプルと第一試薬と第二試薬とを併せた量は１２０〜３００μｌ、好ましくは１５０〜２５０μｌになるように設定すると良い。
試料を１．５〜３５μｌ、好ましくは５〜２５μｌを用いたとき、第一試薬に含まれる抗ＩｇＡ抗体濃度は、最終濃度（試料と第一試薬と第二試薬とを混合したときの濃度）として０．５〜５０μｇ／ｍｌ（ベッカータイターとして）、好ましくは１．５〜１５μｇ／ｍｌに、第二試薬に含まれるＩｇＡ感作ラテックス濃度は、０．００５〜０．５％、好ましくは０．０１５〜０．１５％に、ラテックスに感作したＩｇＡ濃度（ＩｇＡ重量換算）は、０．００５〜０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１５〜０．１５ｍｇ／ｍｌになるように設定すると良い。なお、このとき、第一試薬と第二試薬の量は、おのおの３０〜２５０μｌ、好ましくは５０〜１５０μｌの範囲で、かつ、サンプルと第一試薬と第二試薬とを併せた量は１２０〜３００μｌ、好ましくは１５０〜２５０μｌになるように設定すると良い。
測定用試薬として、抗原および微細粒子に担持された抗体を用いた場合には、まず、測定用試薬として、抗原を緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液）に均一分散した液（第一試薬）および測定すべき抗原に対する抗体を担持した微細粒子（例えば、ラテックス粒子）を緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液）に均一分散した液（第二試薬）を調製する。次いで、自動分析装置（例えば、日立７１８０型自動分析装置）を用いて、測定すべき抗原または抗体を含む試料に、第一試薬、次いで第二試薬を加えて抗原抗体反応をさせ、生じる凝集割合を特定波長（例えば、３５０ｎｍから８００ｎｍ）にて２ポイントエンド法により吸光度変化量として測定し、得られた測定値から、あらかじめ抗原または抗体濃度が既知の標準試料を用いて作成した検量線に基づいて、目的とする試料中の抗原または抗体を定量することができる。
作成する検量線は、後述する実施例４において図４に示されるように、例えば、横軸がプラスのときは抗原濃度を表し、横軸がマイナスのときは抗体濃度を表し、縦軸は、吸光度変化量を表すように作成することが好適である。なお、例えば、図４の検量線に基づき測定する場合に、測定吸光度変化量（ＯＤ×１００００）が、約２０００を示す場合には、すなわち、検量線が横切る濃度ゼロの位置における吸光度値である場合には、試料中には、抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも含まれないと判断することができる。
また、測定方法を実施する際に用いる、測定用試薬としての抗原および抗体を担持した微細粒子の使用量は、通常、測定対象の抗原や抗体、使用する試料の量によって異なるが、基本的には、それらの試薬を用いた競合的均一系免疫凝集測定法で検量線を作成でき、その結果、抗原を測定できるように設定するだけでよい。自動分析装置（例えば、日立７１８０）で抗原および抗体を測定する場合、例えば、以下のとおりである。
試料を１．５〜３５μｌ、好ましくは５〜２５μｌを用いたとき、第一試薬に含まれる抗体濃度は、最終濃度（試料と第一試薬と第二試薬とを混合したときの濃度）として０．５〜５０μｇ／ｍｌ（ベッカータイターとして）、好ましくは１．５〜１５μｇ／ｍｌに、第二試薬に含まれる抗体感作ラテックス濃度は、０．００５〜０．５％、好ましくは０．０１５〜０．１５％に、ラテックスに感作した抗体濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍｌになるように設定すると良い。なお、このとき、第一試薬と第二試薬の量は、おのおの３０〜２５０μｌ、好ましくは５０〜１５０μｌの範囲で、かつ、サンプルと第一試薬と第二試薬とを併せた量は１２０〜３００μｌ、好ましくは１５０〜２５０μｌになるように設定すると良い。
試料を１．５〜３５μｌ、好ましくは５〜２５μｌを用いたとき、第一試薬に含まれる抗体濃度は、最終濃度（試料と第一試薬と第二試薬とを混合したときの濃度）として０．５〜５０μｇ／ｍｌ（ベッカータイターとして）、好ましくは１．５〜１５μｇ／ｍｌに、第二試薬に含まれる抗体感作ラテックス濃度は、０．００５〜０．５％、好ましくは０．０１５〜０．１５％に、ラテックスに感作した抗体濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍｌになるように設定すると良い。なお、このとき、第一試薬と第二試薬の量は、おのおの３０〜２５０μｌ、好ましくは５０〜１５０μｌの範囲で、かつ、サンプルと第一試薬と第二試薬とを併せた量は１２０〜３００μｌ、好ましくは１５０〜２５０μｌになるように設定すると良い。
以上の説明から明らかなとおり、本発明の測定方法を行うための測定用試薬は、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原を含み、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されている。更に、通常使用される、希釈緩衝液、コート緩衝液、ブロッキング試薬、保存剤、安定化剤などを必要に応じて含んでいてもよい。
以下に実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
ヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の測定
実施例１〜３は測定用試薬として、抗体と微細粒子に担持された抗原とを用い、抗原（ＩｇＡ）と抗体（抗ＩｇＡ抗体）のいずれをも測定する方法を示した例である。
１）ＩｇＡ感作ラテックス粒子（微細粒子に担持された抗原）の調製
ラテックス粒子へのＩｇＡの吸着は以下のように行った。
１％濃度とした粒径９８ｎｍ のポリスチレン製ラテックス粒子溶液４ ｍＬに、ヒト血清ＩｇＡをりん酸緩衝液に０．５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した溶液４ ｍＬを混合し、室温にて１ 時間攪拌した。そして、２０,０００ ｒｐｍで４５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にコート緩衝液４ ｍＬを加え、沈殿物を懸濁し超音波処理を行い、ラテックス粒子を完全に分散させた。このラテックス濃度１ ％のヒトＩｇＡ感作ラテックス粒子懸濁液は、冷蔵にて保存した。
実施例１
ヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の測定
実施例１〜３は測定用試薬として、抗体と微細粒子に担持された抗原とを用い、抗原（ＩｇＡ）と抗体（抗ＩｇＡ抗体）のいずれをも測定する方法を示した例である。
１）ＩｇＡ感作ラテックス粒子（微細粒子に担持された抗原）の調製
ラテックス粒子へのＩｇＡの吸着は以下のように行った。
１％濃度とした粒径９８ｎｍ のポリスチレン製ラテックス粒子溶液４ ｍＬに、ヒト血清ＩｇＡをりん酸緩衝液に０．５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した溶液４ ｍＬを混合し、室温にて１ 時間攪拌した。そして、２０,０００ ｒｐｍで４５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にコート緩衝液４ ｍＬを加え、沈殿物を懸濁し超音波処理を行い、ラテックス粒子を完全に分散させた。このラテックス濃度１ ％のヒトＩｇＡ感作ラテックス粒子懸濁液は、冷蔵にて保存した。
２）ＩｇＡ測定用試薬の調製
ＩｇＡを吸着させたラテックス粒子および抗ヒトＩｇＡ抗体を用いて、以下のように第一試薬および第二試薬を調製した。
第一試薬は、ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗血清（ベッカータイター8.8ｍｇ/ｍL）を０．２％含む希釈緩衝液を用いた。
第二試薬は、１）記載のラテックス濃度１ ％のヒトＩｇＡ感作ラテックス粒子懸濁液を希釈緩衝液により１０倍に希釈して用いた。
各試薬の組成は以下の通りである。
ＩｇＡを吸着させたラテックス粒子および抗ヒトＩｇＡ抗体を用いて、以下のように第一試薬および第二試薬を調製した。
第一試薬は、ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗血清（ベッカータイター8.8ｍｇ/ｍL）を０．２％含む希釈緩衝液を用いた。
第二試薬は、１）記載のラテックス濃度１ ％のヒトＩｇＡ感作ラテックス粒子懸濁液を希釈緩衝液により１０倍に希釈して用いた。
各試薬の組成は以下の通りである。
りん酸緩衝液組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
コート緩衝液組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １ ％
ブロッキング試薬 ５ ％
希釈緩衝液組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ＢＳＡ １ ％
ブロッキング試薬 ５ ％
第一試薬
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ＢＳＡ １ ％
ブロッキング試薬 ５ ％
ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗血清 ０．２ ％（ｖ／ｖ）
第二試薬組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ＢＳＡ １ ％
ブロッキング試薬 ５ ％
ヒトＩｇＡ感作ラテックス粒子 ０．１ ％（ｖ／ｖ）
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
コート緩衝液組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １ ％
ブロッキング試薬 ５ ％
希釈緩衝液組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ＢＳＡ １ ％
ブロッキング試薬 ５ ％
第一試薬
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ＢＳＡ １ ％
ブロッキング試薬 ５ ％
ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗血清 ０．２ ％（ｖ／ｖ）
第二試薬組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ＢＳＡ １ ％
ブロッキング試薬 ５ ％
ヒトＩｇＡ感作ラテックス粒子 ０．１ ％（ｖ／ｖ）
３）ＩｇＡの測定用検量線
標準試料は、ＩｇＡ濃度既知の血清を希釈緩衝液で希釈して使用した。ＩｇＡ濃度は、蛋白標準血清ＣＲＭ４７０から伝達されたものである。
測定は日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、試料として血清１５ μＬに対し第一試薬１００ μＬ、第二試薬１００ μＬを反応させ、主波長５０５ ｎｍ、副波長８００ ｎｍにて１９〜２６測光ポイント間（Ｒ２添加直後から２．５分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した。
４）測定結果
上記に示した試薬を用いて、標準試料を測定した際の吸光度変化量を表１に、またそれをグラフ化したもの（検量線）を図１に示した。
標準試料は、ＩｇＡ濃度既知の血清を希釈緩衝液で希釈して使用した。ＩｇＡ濃度は、蛋白標準血清ＣＲＭ４７０から伝達されたものである。
測定は日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、試料として血清１５ μＬに対し第一試薬１００ μＬ、第二試薬１００ μＬを反応させ、主波長５０５ ｎｍ、副波長８００ ｎｍにて１９〜２６測光ポイント間（Ｒ２添加直後から２．５分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した。
４）測定結果
上記に示した試薬を用いて、標準試料を測定した際の吸光度変化量を表１に、またそれをグラフ化したもの（検量線）を図１に示した。
表１および図１に示したように、試料中のＩｇＡ濃度が高くなるに従って吸光度が減少する。すなわち、本発明の測定方法では、試料中の抗原であるＩｇＡと第一試薬中のヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体との反応後、反応余剰分のヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体が第二試薬中のＩｇＡ感作ラテックス粒子と反応することを利用した方法である。つまり試料中のＩｇＡ濃度が低いときには第一試薬中の抗ＩｇＡ抗体が多く余剰し、第二試薬中のＩｇＡ感作ラテックス粒子との反応が大きくなる。しかし、試料中のＩｇＡ濃度が高くなるに従い第一試薬中に余剰する抗ＩｇＡ抗体が減少するため第二試薬中のＩｇＡ感作ラテックスとの反応が少なくなり吸光度が低くなる。
実施例２
本発明の測定方法とＴＩＡ法との相関
１）ＩｇＡ測定試薬の調製および測定条件
実施例１と同様の試薬および測定条件を用いた。
２）自動分析装置の検量
実施例１記載の標準試料を用い日立７１７０Ｓ型自動分析装置の多点検量線作成機能により行った。
３）血清試料の測定
試料は、血清を希釈緩衝液で適宜希釈したものを使用した。市販ＴＩＡ法の「Ｎ−アッセイ ＴＩＡ ＩｇＡ−SH」（日東紡績）を対照試薬として相関性の確認を行った。ＴＩＡ法は同様に日立７１７０Ｓ型自動分析装置を使用し、指定パラメーターにしたがって行った。
４）測定結果
本発明の測定方法とＴＩＡ法との相関性の結果を図２に示した。図２に示すように、ＴＩＡ法をＸ、本発明法をＹとして、相関性を確認したところ、Ｙ＝１．０２Ｘ＋０．７、相関係数 ０．９９８（Ｎ＝３０）と良好な結果が得られた。これにより、本発明法は血清ＩｇＡ濃度を正確に測定し得ることが示される。
本発明の測定方法とＴＩＡ法との相関
１）ＩｇＡ測定試薬の調製および測定条件
実施例１と同様の試薬および測定条件を用いた。
２）自動分析装置の検量
実施例１記載の標準試料を用い日立７１７０Ｓ型自動分析装置の多点検量線作成機能により行った。
３）血清試料の測定
試料は、血清を希釈緩衝液で適宜希釈したものを使用した。市販ＴＩＡ法の「Ｎ−アッセイ ＴＩＡ ＩｇＡ−SH」（日東紡績）を対照試薬として相関性の確認を行った。ＴＩＡ法は同様に日立７１７０Ｓ型自動分析装置を使用し、指定パラメーターにしたがって行った。
４）測定結果
本発明の測定方法とＴＩＡ法との相関性の結果を図２に示した。図２に示すように、ＴＩＡ法をＸ、本発明法をＹとして、相関性を確認したところ、Ｙ＝１．０２Ｘ＋０．７、相関係数 ０．９９８（Ｎ＝３０）と良好な結果が得られた。これにより、本発明法は血清ＩｇＡ濃度を正確に測定し得ることが示される。
実施例３
ＩｇＡおよび抗ＩｇＡ抗体の測定
１）測定試薬の調製および測定条件
実施例１と同様の試薬および測定条件を用いた。
２）測定試料
試料は、ＩｇＡまたは抗ＩｇＡ抗体を含む検体を希釈緩衝液で適宜連続希釈して使用した。
３）自動分析装置の検量
実施例１記載の標準試料のうち、０および1ｍｇ/ｄLを用い日立７１７０Ｓ型自動分析装置の２点検量線作成機能により行った。
３）測定結果
試料中のＩｇＡおよび抗ＩｇＡ抗体の測定結果を表２および図３に示した。
ＩｇＡおよび抗ＩｇＡ抗体の測定
１）測定試薬の調製および測定条件
実施例１と同様の試薬および測定条件を用いた。
２）測定試料
試料は、ＩｇＡまたは抗ＩｇＡ抗体を含む検体を希釈緩衝液で適宜連続希釈して使用した。
３）自動分析装置の検量
実施例１記載の標準試料のうち、０および1ｍｇ/ｄLを用い日立７１７０Ｓ型自動分析装置の２点検量線作成機能により行った。
３）測定結果
試料中のＩｇＡおよび抗ＩｇＡ抗体の測定結果を表２および図３に示した。
表２および図３に示されるように、連続希釈した試料中のＩｇＡおよび抗ＩｇＡ抗体の測定結果は、原点を挟んで良好な直線関係を示した。これは本発明の測定方法において、原点および既知濃度のＩｇＡ標準試料により作成した検量線を用いて、試料中のＩｇＡ濃度を測定するばかりではなく、試料中に抗ＩｇＡ抗体が存在する場合においては、その抗ＩｇＡ抗体濃度はマイナスのＩｇＡ濃度として定義され、正確に測定されることを示すものである。
実施例４
ヒトＣＲＰと抗ヒトＣＲＰ抗体の測定
測定用試薬として、抗原と微細粒子に担持された抗体とを用い、抗原と抗体のいずれをも測定できることを確認した。
具体的には、測定用試薬として、抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス（微細粒子に担持された抗体）とヒトＣＲＰ（抗原）を用い、検体中のヒトＣＲＰ（抗原）または抗ヒトＣＲＰ抗体（抗体）の濃度を測定した。なお、検体が抗ヒトＣＲＰ抗体を含む場合は、モデルサンプルとしてヤギ由来抗ヒトＣＲＰ抗体を含む検体を使用した。
１）抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子の調製
ラテックス粒子への抗ヒトＣＲＰ抗体の吸着は以下のように行った。
１％濃度とした粒径１２０ ｎｍのポリスチレン製ラテックス粒子溶液１００ｍＬに、抗ヒトＣＲＰ抗体をＴｒｉｓ緩衝液に３．０ｍｇ／mLとなるように溶解した溶液１００ｍＬを混合し、室温にて１時間撹拌した。そして、２０，０００ｒｐｍで４５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にコート緩衝液１００ｍＬを加え、沈殿物を懸濁し超音波処理を行い、ラテックス粒子を完全に分散させた後、室温にて１時間撹拌した。次いで遠心分離を行い得られた沈殿物にＴｒｉｓ緩衝液１００ｍＬ加えて懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させ１％濃度抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液を得た。
ヒトＣＲＰと抗ヒトＣＲＰ抗体の測定
測定用試薬として、抗原と微細粒子に担持された抗体とを用い、抗原と抗体のいずれをも測定できることを確認した。
具体的には、測定用試薬として、抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス（微細粒子に担持された抗体）とヒトＣＲＰ（抗原）を用い、検体中のヒトＣＲＰ（抗原）または抗ヒトＣＲＰ抗体（抗体）の濃度を測定した。なお、検体が抗ヒトＣＲＰ抗体を含む場合は、モデルサンプルとしてヤギ由来抗ヒトＣＲＰ抗体を含む検体を使用した。
１）抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子の調製
ラテックス粒子への抗ヒトＣＲＰ抗体の吸着は以下のように行った。
１％濃度とした粒径１２０ ｎｍのポリスチレン製ラテックス粒子溶液１００ｍＬに、抗ヒトＣＲＰ抗体をＴｒｉｓ緩衝液に３．０ｍｇ／mLとなるように溶解した溶液１００ｍＬを混合し、室温にて１時間撹拌した。そして、２０，０００ｒｐｍで４５分間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にコート緩衝液１００ｍＬを加え、沈殿物を懸濁し超音波処理を行い、ラテックス粒子を完全に分散させた後、室温にて１時間撹拌した。次いで遠心分離を行い得られた沈殿物にＴｒｉｓ緩衝液１００ｍＬ加えて懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させ１％濃度抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液を得た。
２）ヒトＣＲＰおよび抗ヒトＣＲＰ抗体測定試薬の調製
抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子及びヒトＣＲＰを用いて、以下のように第一試薬及び第二試薬を調製した。
第一試薬は、ヒトＣＲＰを０．１０ ｍｇ／ｄＬ含むＴｒｉｓ緩衝液を用いた。
第二試薬は、上記１)記載の１％濃度抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液をＴｒｉｓ緩衝液により５倍に希釈して用いた。
各試薬の組成は以下の通りである。
抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子及びヒトＣＲＰを用いて、以下のように第一試薬及び第二試薬を調製した。
第一試薬は、ヒトＣＲＰを０．１０ ｍｇ／ｄＬ含むＴｒｉｓ緩衝液を用いた。
第二試薬は、上記１)記載の１％濃度抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子懸濁液をＴｒｉｓ緩衝液により５倍に希釈して用いた。
各試薬の組成は以下の通りである。
Ｔｒｉｓ緩衝液組成
Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）
５０ｍＭ ｐＨ７．５
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
コート緩衝液組成
Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン） １．０％
第一試薬
Ｔｒｉｓ緩衝液
ヒトＣＲＰ ０．１０ ｍｇ／ｄＬ
第二試薬
Ｔｒｉｓ緩衝液
抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子 ０．２％（ｖ／ｖ）
Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）
５０ｍＭ ｐＨ７．５
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
コート緩衝液組成
Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
塩化ナトリウム １５０ｍＭ
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン） １．０％
第一試薬
Ｔｒｉｓ緩衝液
ヒトＣＲＰ ０．１０ ｍｇ／ｄＬ
第二試薬
Ｔｒｉｓ緩衝液
抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス粒子 ０．２％（ｖ／ｖ）
３）測定方法
測定は日立７１８０型自動分析装置を用い、試料２．４ μＬに対し第一試薬１２０ μＬ、第二試薬１２０ μＬを反応させ、主波長５７０ ｎｍ、副波長８００ ｎｍにて１８〜２８測光ポイント間（Ｒ２添加直後から２．９分後に相当）において、２ポイントエンド法により吸光度変化量を測定した。
試料は、ヒトＣＲＰ及び抗ヒトＣＲＰ抗体を含む検体を生理食塩水で適宜希釈して使用した。
４）測定結果
上記に示した試薬を用いて、試料中のヒトＣＲＰ及び抗ヒトＣＲＰ抗体の測定結果を表３及び図４に示した。
測定は日立７１８０型自動分析装置を用い、試料２．４ μＬに対し第一試薬１２０ μＬ、第二試薬１２０ μＬを反応させ、主波長５７０ ｎｍ、副波長８００ ｎｍにて１８〜２８測光ポイント間（Ｒ２添加直後から２．９分後に相当）において、２ポイントエンド法により吸光度変化量を測定した。
試料は、ヒトＣＲＰ及び抗ヒトＣＲＰ抗体を含む検体を生理食塩水で適宜希釈して使用した。
４）測定結果
上記に示した試薬を用いて、試料中のヒトＣＲＰ及び抗ヒトＣＲＰ抗体の測定結果を表３及び図４に示した。
表３および図４に示した、試料中のヒトＣＲＰ及び抗ヒトＣＲＰ抗体の測定結果から分かるように、試料中のヒトＣＲＰ濃度が高くなるに従って吸光度が増加し、抗ヒトＣＲＰ抗体濃度が高くなるに従って吸光度が減少した。これは本発明法において、ＣＲＰ０ｍｇ／ｄＬ及び既知濃度のヒトＣＲＰ標準試料により作成した検量線を用いることによって、試料中のヒトＣＲＰ濃度を測定できるばかりではなく、試料中に抗ヒトＣＲＰ抗体が存在する場合においてはその抗ヒトＣＲＰ抗体濃度はマイナスのヒトＣＲＰ濃度として測定することが可能であることを意味する。
本発明の測定方法および測定用試薬により、免疫凝集測定系を適用して、試料中の抗原を測定でき、試料中にその抗原に対する抗体が存在する場合には、同一の試薬を用いて、その抗体を測定することもできる。加えて、測定用試薬として用いる高価な抗体の量を少なく用いて、同一の試薬で、一回の測定で、試料中に抗原が存在する場合には、抗原を測定でき、抗体が存在する場合には、抗体を測定でき、試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれをも測定できる。また、試料中に、抗原およびその抗原に対する抗体のいずれもが存在しない場合でも、本発明の測定方法および測定用試薬により、それらが存在しないことを確認することもできる。
Claims (11)
- 試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
（ｉ）測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されており、
（ｉｉ）試料と、その測定用試薬とを混合し、
（ｉｉｉ）抗原抗体反応による凝集の上昇または下降の度合いから、試料中の抗原または抗体を測定する
ことを含む上記方法。 - 試料として、抗原を含みその抗原に対する抗体を含まない試料、抗原を含まずその抗原に対する抗体を含む試料、または抗原とその抗原に対する抗体のいずれをも含まない試料を測定対象とする請求項１の方法。
- 試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
（ｉ）測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、試薬中の抗原が微細粒子に担持されており、
（ｉｉ）試料と、その測定用試薬とを混合し、
（ｉｉｉ）試料中に抗原が含まれる場合には、測定用試薬としての抗体と、試料中の抗原および測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原との間で、抗原抗体反応を競合させて、抗原抗体反応による凝集の下降の度合いから、試料中の抗原を測定し、
(ｉｖ)試料中に抗体が含まれる場合には、測定用試薬としての微細粒子に担持された抗原と、試料中の抗体および測定試薬としての抗体とを抗原抗体反応させて抗原抗体反応による凝集の上昇の度合いから、試料中の抗体を測定する、
請求項１または２記載の測定方法。 - 試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも、同一の試薬を用いて測定する方法であって、
（ｉ）測定用試薬として、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原とを用い、かつ、試薬中の抗体が微細粒子に担持されており、
（ｉｉ）試料と、その測定用試薬とを混合し、
（ｉｉｉ）試料中に抗原が含まれる場合には、測定用試薬としての微細粒子が担持された抗体と、試料中の抗原および測定用試薬としての抗原とを、抗原抗体反応させて、抗原抗体反応による凝集の上昇の度合いから、試料中の抗原を測定し、
（ｉｖ）試料中に抗体が含まれる場合には、測定試薬の抗原と、試料中の抗体および測定用試薬として微細粒子に担持された抗体との間で、抗原抗体反応を競合させて、抗原抗体反応による凝集の下降の度合いから、試料中の抗体を測定する、
請求項１または２記載の上記方法。 - 抗原が、通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原である、請求項１から４のいずれかの方法。
- 試料中の抗原がＩｇＡで、試料中の抗体が抗ＩｇＡ抗体である請求項１から５のいずれかの方法。
- 測定用試薬として抗体と微細粒子に担持された抗原とを用いて、プロゾーン現象を回避して、試料を希釈することなく実施する請求項１から３および５から６のいずれかの方法。
- 試料中の抗原およびその抗原に対する抗体のいずれも測定するための測定用試薬であって、試料中の抗原と抗原抗体反応しうる抗体と、試料中および試薬中のいずれの抗体とも抗原抗体反応しうる抗原を含み、かつ、該抗原および該抗体のいずれか一方が微細粒子に担持されている、測定用試薬。
- 試料として、抗原を含みその抗原に対する抗体を含まない試料、抗原を含まずその抗原に対する抗体を含む試料、または抗原とその抗原に対する抗体のいずれをも含まない試料を測定対象とする請求項８の測定用試薬。
- 抗原が、通常一般のヒトまたは動物由来の生体試料中には存在するが、極限られた一部のヒトまたは動物由来の生体試料には存在せず逆にその抗原に対する抗体を有している特徴をもつ抗原である、請求項８または９の測定用試薬。
- 試料中抗原がＩｇＡで、試料中抗体が抗ＩｇＡ抗体である請求項８から１０のいずれかの測定用試薬。
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