CN101512339B - 检测抗原和针对该抗原的抗体的方法,以及在该方法中所使用的检测试剂 - Google Patents
检测抗原和针对该抗原的抗体的方法,以及在该方法中所使用的检测试剂 Download PDFInfo
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Abstract
为了检测样品中的抗原和针对该抗原的抗体，使用了一种检测试剂，该试剂包含能够和样品中所含的抗原发生抗原-抗体反应的抗体，以及能够和样品中所含的抗体和试剂中所含的抗体都发生抗原-抗体反应的抗原。试剂中的所述抗原或抗体都由微粒来负载。将样品和试剂混合。根据抗原-抗体反应所引起的凝集的增加和减少来检测样品中的抗原和抗体。有可能使用同一种试剂精确检测样品中的抗原和针对该抗原的抗体。
Description
技术领域
本发明涉及检测抗原和针对该抗原的抗体的方法，以及在该方法中所使用的检测试剂。本发明更具体涉及通过使用同一种试剂、利用免疫凝集检测法检测样品中抗原和针对该抗原的抗体的方法，例如通过使用同一种试剂能够检测例如IgA这样的抗原以及针对该抗原的抗体的方法，所述抗体例如抗IgA抗体；以及在这种方法中所使用的检测试剂。
背景技术
对血液中IgA的检测几乎是临床检查领域中的例行程序，因为在慢性炎症、慢性肝炎、肝硬化、IgA肾病、胶原性疾病(例如，风湿症)、IgA型骨髓瘤等等中，血液IgA水平都是高的。作为检测IgA的方法，通常采用一种使用免疫比浊法(TIA方法)的方法(专利文件1)。TIA法是一种用于检测样品中抗原例如IgA的方法，包括使样品中的IgA和作为试剂的抗体发生抗原-抗体反应，并根据由此产生的浑浊程度来检测抗原的量。该方法尤其适用于检测高浓度存在的抗原(例如，IgA)，该检测可以不稀释样品。但是，该方法的缺点是用于检测的试剂昂贵，因为使用大量的抗体。
此外，已知有些人几乎没有IgA，并且在某些情况下缺乏IgA。考虑到一些缺乏IgA的人具有针对IgA的抗体，即，抗-IgA抗体。已经报道，如果，偶然的，一个具有抗IgA抗体的人因为疾病或事故需要输血，将来自于正常人(即，具有IgA的人)的血输注到具有抗IgA抗体的患者体内会在患者血液中引起抗IgA抗体和IgA的抗原-抗体反应，因此引起过敏性反应(即，休克)，导致危险状态(非专利文件2)。即使将来自于正常人的血液(即，具有IgA的人)输注到体内不具有抗IgA抗体的IgA缺乏的人中也会在体内产生抗IgA抗体，使此人获得了该抗体。因此，此人接受来自于正常人的血液输血时会发生休克反应。
为了防止发生休克反应，需要 血液中没有IgA的人作为向具有抗IgA抗体的人的输血用血液。因此，有必要研究在患者和血液提供者的血液中是否存在抗-IgA抗体。但是，因为在目前的临床检查领域中还没有用于检测抗IgA抗体的试剂，所以无法检测谁具有抗IgA抗体。因此，有必要尽快考虑解决该问题。
非专利文件1：Nobuhiko Kubo等人，Nihon Rinshou，Vol.57，Extra Number(1999)，pp.10-12
非专利文件2：Takako Migita等人，Nihon YuketsuGakkai-zasshi，Vol.50，No.3，pp.419-424(2004)
发明内容
发明将解决的问题
本发明意图提供一种有可能通过采用几乎未被用于检测样品中的抗原或抗体的竞争性均匀免疫凝集检测法，以及常规免疫凝集检测法，来检测样品中的抗原以及针对该抗原的抗体的方法和检测试剂。
解决问题的方法
在这种情况下，为了解决这些问题，本发明人对检测样品中的IgA的方法进行了研究。结果发现，通过采用在临床检查中不经常使用的竞争性均匀免疫凝集检测法可以实现该目的。还发现，当尝试使用该方法中的试剂进行IgA检测时，在某些情况下IgA水平的数值变为负值，这取决于样品。此外，发现这种样品不含有IgA，但是含有抗IgA抗体。结果，意外地发现，该试剂不仅能够检测样品中的IgA，还能够检测样品中的抗IgA抗体。根据此发现，本发明人进行了认真的研究，开发出了通过使用同一种试剂同时检测样品中抗原和抗体的方法。如上述由此完成了本发明。
因此，本发明涉及下述(1)到(11)。
(1)通过使用同一种试剂来检测样品中抗原和针对该抗原的抗体的方法，所述试剂包含
(i)使用检测试剂，所述检测试剂包含能够和样品中所含的抗原发生抗原-抗体反应的抗体，和能够和样品中所含的抗体和试剂中所含的抗体都发生抗原-抗体反应的抗原，所述试剂中的所述抗原或抗体都由微粒来负载，
(ii)将样品和检测试剂混合，并且
(iii)根据抗原-抗体反应所引起的凝集的增加或减少程度来检测样品中的所述抗原或抗体。
(2)根据上述(1)的方法，其中将含有抗原而不含有针对该抗原的抗体的样品，或者不含有抗原但是含有针对该抗原的抗体的样品，或者既不含有抗原又不含有针对该抗原的抗体的样品作为样品进行检测。
(3)通过使用上述(1)或(2)中的同一种试剂检测样品中的抗原和针对该抗原的抗体的方法，包括
(i)使用检测试剂，所述检测试剂包含能够和样品中所含的抗原发生抗原-抗体反应的抗体，和能够和样品中所含的抗体和试剂中所含的抗体都发生抗原-抗体反应的抗原，所述试剂中的所述抗原由微粒来负载，
(ii)将样品和检测试剂混合，
(iii)当样品中含有抗原时的步骤，即，使样品中所含的抗原和微粒上负载的、并构成检测试剂的抗原互相竞争地和构成检测试剂的抗体发生抗原-抗体反应，并根据抗原-抗体反应所引起的凝集的减少程度来检测样品中的抗原，或者
(iv)当样品中含有抗体时的步骤，即，让微粒上负载的、并构成检测试剂的抗原和样品中所含的抗体与构成检测试剂的抗体发生抗原-抗体反应，并根据抗原-抗体反应所引起的凝集的增加程度来检测样品中的抗体。
(4)通过使用上述(1)或(2)中的同一种试剂检测样品中的抗原和针对该抗原的抗体的方法，包括
(i)使用检测试剂，所述检测试剂包含能够和样品中所含的抗原发生抗原-抗体反应的抗体，和能够和样品中所含的抗体和试剂中所含的抗体都发生抗原-抗体反应的抗原，所述试剂中的所述抗原由微粒来负载，
(ii)将样品和检测试剂混合，和
(iii)当样品中含有抗原时的步骤，即，使微粒上所负载的、并构成检测试剂的抗体，和样品中的抗原与构成检测试剂的抗原发生抗原-抗体反应，并根据抗原-抗体反应所引起的凝集的增加程度来检测样品中的所述抗原，或者
(iv)当样品中含有抗体时的步骤，即，让样品中所含的抗体和微粒上负载的、并构成检测试剂的抗体互相竞争地和构成检测试剂的抗原发生抗原-抗体反应，并根据抗原-抗体反应所引起的凝集的减少程度来检测样品中的所述抗体。
(5)上述(1)到(4)中任一项的方法，其中所述样品中的所述抗原的特征是，该抗原通常存在于来自于正常人类或动物的生物样品中，但是不存在于来自于数量极其有限的、具有针对该抗原的抗体的人类或动物的人类或动物的生物样品中。
(6)上述(1)到(5)中任一项的方法，其中所述样品中的所述抗原是IgA，并且所述样品中的所述抗体是抗IgA抗体。
(7)上述(1)到(3)以及(5)和(6)中任一项的方法，在无需稀释样品的情况下实施所述的方法，使用包含有由微粒负载的抗体和抗原的检测试剂，以避免前带现象。
(8)用于检测样品中的抗原和针对该抗原的抗体的试剂，所述检测试剂包含能够和样品中所含的抗原发生抗原-抗体反应的抗体，和能够和样品中所含的抗体和试剂中所含的抗体都发生抗原-抗体反应的抗原，所述试剂中的所述抗原或抗体都由微粒来负载。
(9)上述(8)的检测试剂，将含有抗原但是不含有针对该抗原的抗体的样品，或不含有抗原而含有针对该抗原的抗体的样品，或既不含有抗原又不含有针对该抗原的抗体的样品作为样品进行检测。
(10)上述(8)或(9)的检测试剂，其中所述样品中的所述抗原的特征是，该抗原通常存在于来自于正常人类或动物的生物样品中，但是不存在于来自于数量极其有限的、具有针对该抗原的抗体的人类或动物的人类或动物的生物样品中。
(11)上述(8)到(10)中任一项的检测试剂，其中所述样品中的所述抗原是IgA，并且所述样品中的所述抗体是抗IgA抗体。
发明优势
可以通过使用本发明的检测方法和检测试剂，采用竞争性均匀免疫凝集检测法，以及常规免疫凝集检测法，来进行下面的检测。当样品中含有抗原时，可以将其检测出来。当样品中含有针对该抗原的抗体时，也可以检测出该抗体。此外，可以使用同一种试剂以及在该检测试剂中的少量且昂贵的抗体，通过一轮检测实现下面情况。当样品中含有抗原时，可以将其检测出来。当样品中含有针对该抗原的抗体时，可以将其检测出来。因此，样品中的所述抗原和针对该抗原的抗体都可以被检测出来。当样品中既不含抗原又不含针对该抗原的抗体时，也可以通过采用本发明的检测方法和检测试剂来证实它们的不存在。
当抗原以高浓度存在于普通生物样品中时，例如检测IgA，可以通过使用包含有由微粒负载的针对该抗原的抗体和抗原的检测试剂，无需稀释样品即检测出样品中的抗原，以避免前带现象。
因此，本发明的检测方法和检测试剂可被用于研究在血液提供者和接受者的血液中是否存在抗IgA抗体，以避免输血时发生休克反应。它们还可被用于基于IgA水平的慢性炎症、慢性肝炎、肝硬化、IgA肾病、胶原性疾病(例如，风湿症)、IgA型骨髓瘤等的临床检查领域。
实现发明的最佳方式
在本发明中，样品是，例如，来自于活体的液体样品。样品的特定例子为血浆、血清、尿等。来自于血液的样品，例如血浆和血清是合适的。在本发明中，作为样品，设想了三种样品，即，含有抗原而不含有针对该抗原的抗体的样品，不含有抗原而含有针对该抗原的抗体的样品，和既不含有抗原又不含有针对该抗原的抗体的样品。这些样品都可以用于检测。对于既含有抗原又含有针对该抗原的抗体的样品，在收集该样品的活体中发生抗原-抗体反应因此发生休克反应。因此，这种样品不会存在。
作为所述样品中的所述抗原，适合于本发明的检测方法和检测试剂的抗原是“具有如下特征的抗原，该抗原通常存在于来自于正常人类或动物的生物样品中，但是不存在于来自于数量极其有限的、具有针对该抗原的抗体的人类或动物的人类或动物的生物样品中”。这种抗原包括，例如，免疫球蛋白A(IgA)、结合球蛋白、α2-巨球蛋白、补体C9和补体C4。
作为样品中的抗体，适合于本发明的检测方法和检测试剂的抗体是针对样品中的上述示例的抗原的抗体。这种抗体包括，例如，分别针对上述示例的抗原的抗IgA抗体、抗结合球蛋白抗体、抗α2-巨球蛋白抗体、抗补体C9抗体和抗补体C4抗体。
对在本发明的检测方法中使用的、并作为本发明的检测试剂的试剂中的抗体不进行特别限制，只要它能够和样品中所含的抗原发生抗原-抗体反应。当待测抗原是IgA、结合球蛋白、α2-巨球蛋白、补体C9或补体C4，可以分别将抗IgA抗体、抗结合球蛋白抗体、抗α2-巨球蛋白抗体、抗补体C9抗体和抗补体C4抗体作为试剂中的抗体。对于这种抗体的来源，例如，当检测人样品中的抗原和针对该抗原的抗体时，其来源可以是任意来源，只要所述试剂中的该抗体能够和所述样品中的所述抗原发生抗原-抗体反应。所述试剂中的所述抗体包括，例如，来自于山羊的抗体、来自于兔子的抗体、来自于大鼠的抗体。此外，作为本发明使用的试剂中的抗体，可以使用单克隆或多克隆抗体。此外，可以将任意能够和所述样品中的所述抗原发生抗原-抗体反应的抗体片段作为本发明使用的试剂中所含的抗体。
对在本发明的检测方法中使用的、并作为本发明的检测试剂的试剂中的抗原不进行特别限制，只要它能够和样品中的抗体和试剂中的抗体发生抗原-抗体反应。当抗IgA抗体、抗结合球蛋白抗体、抗α2-巨球蛋白抗体、抗补体C9抗体和抗补体C4抗体作为试剂中所的抗体时，可以分别将IgA、结合球蛋白、α2-巨球蛋白、补体C9或补体C4作为检测试剂中的抗原。试剂中的抗原的来源以及生产该抗原的过程可以是任意来源或任意过程，只要试剂中的该抗原能够和样品中的抗体和试剂中抗体都发生抗原-抗体反应。例如，当检测人样品中的IgA或抗IgA抗体时，试剂中的抗原包括例如，来自于山羊的IgA、来自于兔子的IgA、来自于大鼠的IgA、和重组获得的IgA。此外，可以将任何能够和样品中的抗体和试剂中抗体都发生抗原-抗体反应的抗原的片段作为试剂中的抗原。
作为在本发明的检测方法和本发明的检测试剂中使用的微粒，可以使用通常用于免疫凝集反应的微粒。最常规的微粒是胶乳颗粒。作为微粒，通常使用0.01到0.5微米的颗粒。在本发明中，在微粒上负载抗原或抗体的方法可以采用常规负载方法，例如利用疏水性相互作用的物理吸附法，和共价键合法。
本发明的检测方法基于如下事实，在免疫凝集反应中，产物和反应物中只有一种引起浑浊出现，而其它成分是水溶性的或者几乎不会引起浑浊出现。下面通过使用含有由微粒负载的抗体和抗原的检测试剂的示例来解释该事实的原理。
首先，待混合的反应物如下：(i-1)得自样品的抗原，此例中该抗原存在于样品中；(i-2)来自样品的抗体，此例中该抗体存在于样品中；(ii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗原；和(iii)构成检测试剂的抗体。所有这些反应物(i)到(iii)都是可溶的或者水中均匀分布的。
随后，混合反应物进行抗原-抗体反应。当样品中存在抗原时，竞争产生两种抗原-抗体反应产物，即，(iii)构成检测试剂的抗体和(i-1)来自于样品的抗原的抗原-抗体反应产物，以及(iii)构成检测试剂的抗体和(ii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗原的抗原-抗体反应产物。(iii)构成检测试剂的抗体和(ii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗原的抗原-抗体反应产物是水不溶性的，并且引起浑浊出现，而(iii)构成检测试剂的抗体和(i-1)来自于样品的抗原的抗原-抗体反应产物几乎不会引起浑浊出现。因此，反应溶液的浑浊度随着(iii)构成检测试剂的抗体和(ii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗原的抗原-抗体反应产物的量的增加而增大。
在上述竞争反应中，(i-1)来自于样品的抗原和定量的(iii)构成检测试剂的抗体反应，和(ii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗原竞争，以减少不可溶的抗原-抗体反应产物的产生量，即，(iii)构成检测试剂的抗体和(ii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗原的抗原-抗体反应产物，并降低反应溶液中产生的浑浊程度。因此，反应溶液的浑浊度随着样品中所含的抗原的浓度的增加而降低。相应的，可根据浑浊度的降低程度检测样品中的抗原。
当样品中含有抗体时，(i-2)来自样品的抗体和(iii)构成检测试剂的抗体中的每种抗体与(ii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗原发生反应产生抗原-抗体反应产物。因此，(i-2)得自样品的抗体和(ii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的所述抗原的抗原-抗体反应产物的量随着样品中的抗体的浓度的增加而增加，因此反应溶液中产生的浑浊度增大。从而反应溶液中相应的浑浊度随着样品中的抗体浓度的增加而增大。因此，可以根据浑浊度的增大程度来检测样品中的抗体。
接下来，下面通过使用含有微粒负载的抗原和抗体的检测试剂的例子对原理进行了解释。
首先，待混合的反应物如下：(i-1)来自于样品的抗原，此例中该抗原存在于样品中；(i-2)来自样品的抗体，此例中该抗体存在于样品中；(ii)构成检测试剂的抗原；和(iii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗体。所有这些反应物(i)到(iii)都是可溶的或者水中均匀分布的。
随后，混合反应物进行抗原-抗体反应。当样品中存在抗原时，产生两种抗原-抗体反应产物，即，(iii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗体和(i-1)来自于样品的抗原的抗原-抗体反应产物，以及(iii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗体和(ii)构成检测试剂的抗原的抗原-抗体反应产物。这两种抗原的抗原-抗体反应产物是水不溶性的，并且引起浑浊出现。因此，(i-1)来自于样品的抗原和(iii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗体的抗原-抗体反应产物的量随着样品中所含的抗原浓度的增加而增大。因此反应溶液中产生的浑浊度增大。因此，反应溶液的浑浊度随着样品中的抗原浓度的增加而增大。相应的，可以根据浑浊度的增大程度来检测样品中的抗原。
当样品中含有抗体时，竞争产生两种抗原-抗体反应产物，即，(ii)构成检测试剂的抗原和(i-2)来自于样品的抗体的抗原-抗体反应产物，以及(ii)构成检测试剂的抗原和(iii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗体的抗原-抗体反应产物。在上述竞争反应中，(i-2)来自于样品的抗体和(ii)构成检测试剂的抗原发生反应，和确定数量的(iii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗体竞争，以减少产生的不溶性抗原-抗体反应产物的量，即，(iii)负载于微粒上的、并构成检测试剂的抗体和(ii)构成检测试剂的抗原的抗原-抗体反应产物，并降低反应溶液所产生的浑浊度。因此，反应溶液的浑浊度随着样品中的抗体浓度的增加而降低。相应的，可以根据浑浊度的降低程度来检测样品中的抗体。
在本发明，对于因抗原-抗体反应引起的凝集所产生的浑浊度的检测方法，通常通过吸光度方法检测产生的浑浊度。还可以通过视觉观察凝集或通过对未凝集的微粒进行计数来检测浑浊度。
实现本发明的检测方法的特点示例如下。
当使用含有负载于微粒上的抗体和抗原的试剂作为检测试剂时，首先通过制备抗体(例如，抗IgA抗体)在缓冲液(例如，磷酸缓冲液)中的均匀分散相(第一试剂)和其上负载有和待测抗原(例如IgA)相同的抗原(例如IgA)的微粒(例如，胶乳颗粒)在缓冲液(例如，磷酸缓冲液)中的均匀分散相(第二试剂)来制备检测试剂。随后，使用自动分析仪(例如，Autoanalyzer Hitachi Model 7180)，向含有待测抗原或抗体的样品中加入第一试剂并随后加入第二试剂，进行抗原-抗体反应，在特定波长下(例如，340nm到800nm)利用两端点法(two-point end method)检测吸光度变化，检测引起的凝集率。根据检测获得的数值，可以通过使用之前获得的标准曲线来检测样品中目标抗原或抗体的量，所述标准曲线是通过使用含有已知浓度的抗原或抗体的标准样品获得的。
可如下获得适当的标准曲线：如下文中实施例3中的图3所示，横坐标轴正号区代表抗原(例如，IgA)浓度，负号区代表抗体(例如抗IgA抗体)浓度，纵坐标轴代表吸光度的变化。例如，在通过使用图3所示的标准曲线进行检测的示例中，当检测到的吸光度改变程度(ODx10000)大约为1400时，即，处于对应0浓度的位置的吸光度值，即，标准曲线与纵坐标轴交叉的位置，可以判断为样品中既不含抗原又不含针对该抗原的抗体。
构成实现该检测方法的检测试剂的抗体和上面负载有抗原的微粒的使用量通常随着待测抗原或抗体的量以及样品使用量的变化而变化。基本上，可以仅检测使用量，以便于能够通过采取竞争性均匀免疫凝集法，使用检测试剂，获得标准曲线，并且作为获得标准曲线的结果，可以检测抗原。当用自动分析仪(例如，Autoanalyzer HitachiModel 7180)检测作为抗原的IgA和作为抗体的抗IgA抗体时，使用量如下，例如：
当使用1.5到35μl，优选5到25μl的样品时，优选调节第一试剂中的抗IgA抗体的浓度，使其终浓度(在样品混合物中的浓度，第一试剂和第二试剂)可以是0.5到50μg/ml(按Becker滴度)，更优选的1.5到15μg/ml；在第二试剂中所含的IgA敏化的胶乳的浓度优选调节为0.005到0.5％，更优选0.015到0.15％；而将用于胶乳敏化的IgA的浓度(按IgA重量)优选调节为0.005到0.5mg/ml，更优选为0.015到0.15mg/ml。在该情况下，将第一试剂和第二试剂的体积都优选调节为30到250μl，更优选为50到150μl，而样品的总体积，第一试剂和第二试剂被优选调节到120到300μl，更优选为150到250μl。
当含有负载于微粒上的抗原和抗体的试剂被用作检测试剂时，在该试剂的制备中首先制备抗原在缓冲液(例如，Tris缓冲液)中的均匀分散相(第一试剂)，以及上面负载有针对待测抗原的抗体的微粒(例如胶乳颗粒)在缓冲液中(例如，Tris缓冲液)的均匀分散相(第二试剂)。随后，使用自动分析仪(例如，Autoanalyzer Hitachi Model7180)，通过向含有待测抗原或抗体的样品中加入第一试剂并随后加入第二试剂，进行抗原-抗体反应，在特定波长下(例如，350nm到800nm)利用两端点法(two-point end method)检测吸光度变化程度，检测引起的凝集率。根据检测获得的数值，可以通过使用之前获得的标准曲线来检测样品中目标抗原或抗体的量，所述标准曲线是通过使用含有已知浓度的抗原或抗体的标准样品获得的。
可如下获得适当的标准曲线：如下文中实施例4中的图4所示，横坐标轴正号区代表抗原浓度，负号区代表抗体浓度，纵坐标轴代表吸光度的变化。例如，在通过使用图4所示的标准曲线进行检测的示例中，当检测到的吸光度变化程度(ODx10000)大约为2000时，即，处于对应0浓度的位置的吸光度值，即，标准曲线与纵坐标轴交叉的位置，可以判断为样品中既不含抗原又不含针对该抗原的抗体。
构成实现该检测方法的检测试剂的抗体和上面负载有抗原的微粒的使用量通常随着待测抗原或抗体的量以及样品使用量的变化而变化。基本上，可以仅检测使用量，以便于能够通过采取竞争性均匀免疫凝集法，使用检测试剂，获得标准曲线，并且作为获得标准曲线的结果，可以检测抗原。当用自动分析仪(例如，Autoanalyzer HitachiModel 7180)检测抗原和抗体时，使用量如下，例如：
当使用1.5到35μl，优选5到25μl的样品时，优选调节第一试剂中的抗体的浓度，使其终浓度(在样品混合物中的浓度，第一试剂和第二试剂)可以是0.5到50μg/ml(按Becker滴度)，更优选的是1.5到15μg/ml；在第二试剂中所含的抗体敏化的胶乳的浓度优选调节为0.005到0.5％，更优选0.015到0.15％；而将用于胶乳敏化的抗体的浓度优选调节为0.05到10mg/ml，更优选为0.5到5mg/ml。在该情况下，将第一试剂和第二试剂的体积都优选调节为30到250μl，更优选为50到150μl，而样品的总体积，第一试剂和第二试剂被优选调节到120到300μl，更优选为150到250μl。
根据上面的解释已经清楚，实现本发明的检测方法的检测试剂包含能够和样品中所含的抗原发生抗原-抗体反应的抗体，以及能够和样品中所含的抗体和试剂中所含的抗体都发生抗原-抗体反应的抗原，并且试剂中的所述抗原或抗体都由微粒来负载。此外，如果必要，该检测试剂可以含有常规添加剂，例如稀释缓冲液、包被缓冲液、封闭试剂、防腐剂、稳定剂等。
附图简述
图1.显示实施例1中检测标准样品时的吸光度变化程度的图象。
图2.显示本发明的检测方法和TIA法之间的相关性的图象。
图3.显示实施例3中检测样品中IgA和抗-IgA抗体的结果的图象。
图4.显示实施例4中检测样品中CRP和抗-CRP抗体的结果的图象。
使用下面的实施例对本发明进行了具体解释，所述实施例不用于限制本发明的范围。
实施例1
人免疫球蛋白A(IgA)的检测
实施例1到3都显示了通过使用含有微粒负载的抗体和抗原的检测试剂，检测抗原(IgA)和抗体(抗IgA抗体)的方法。
1)制备人IgA-敏化的胶乳颗粒(负载于微粒上的抗原)
如下将IgA吸附到胶乳颗粒上。
将4mL的1％聚苯乙烯胶乳颗粒溶液(颗粒直径为98nm)与将人血清IgA溶于磷酸缓冲液得到的浓度为0.5mg/mL的溶液4mL混合，在室温下搅拌所得混合液1小时。以20,000rpm离心搅拌的混合液45分钟后，弃上清，回收沉淀。在沉淀中加入4mL包被缓冲液，使沉淀悬浮，超声处理所得悬浮液来完全分散胶乳颗粒。由此获得人IgA敏化的胶乳颗粒悬液，胶乳浓度为1％，将其冷藏保存。
2)制备用于检测IgA的试剂
使用上面吸附有IgA的胶乳颗粒和抗人IgA抗体按下面所述制备第一试剂和第二试剂。
作为第一试剂，使用了含有0.2％抗人IgA山羊血清(Beckertitier：8.8mg/mL)的稀释缓冲液。
作为第二试剂，使用了稀释液，该稀释液是用稀释缓冲液稀释如上述(1)所述的胶乳浓度为1％的人Ig敏化的胶乳颗粒悬浮液所获得的。
试剂成分如下。
磷酸缓冲液成分
二水合磷酸二氢钠 20mM pH 7.50
EDTA·2Na 1mM
包被缓冲液成分
二水合磷酸二氢钠 20mM pH 7.50
EDTA·2Na 1mM
牛血清蛋白(BSA) 1％
封闭试剂 5％
稀释缓冲液成分
二水合磷酸二氢钠 20mM pH 7.50
EDTA·2Na 1mM
BSA 1％
封闭试剂 5％
第一试剂
二水合磷酸二氢钠 20mM pH 7.50
EDTA·2Na 1mM
BSA 1％
封闭试剂 5％
抗人IgA山羊血清 0.2％(v/v)
第一试剂成分
二水合磷酸二氢钠 20mM pH 7.50
EDTA·2Na 1mM
BSA 1％
封闭试剂 5％
人IgA-敏化的胶乳颗粒 0.1％(v/v)
3)用于IgA检测的标准曲线
作为标准样品，使用了用稀释缓冲液稀释含有已知浓度IgA的血清所获得的稀释液。通过使用蛋白质标准血清CRM470检测IgA浓度。
使用Autoanalyzer Hitachi Model 7170S检测标准样品，其中将100μL第一试剂和100μL第二试剂和作为样品的15μL血清反应，随后在主波长505nm和互补波长800nm下在第19和第26光测点之间(对应于刚加入R2到加入后2.5分钟)利用两端点法检测吸光度变化程度。
4)检测结果
表1显示了，使用上述试剂对标准样品进行检测所引起的吸光度变化程度，图1显示了吸光度的变化程度(标准曲线)
表1对标准样品进行检测时吸光度的变化程度
如表1和图1所示，当样品中的IgA浓度升高时吸光度下降。即，作为本发明的检测方法，上述方法利用了如下事实，在样品中所含的、作为抗原的IgA和第一试剂中所含的抗人IgA山羊抗体发生反应后，反应后残留的抗人IgA山羊抗体和第二试剂中含有的IgA敏化的胶乳颗粒反应。换句话说，当样品中的IgA浓度低时，第一试剂中的抗IgA抗体大量残留，并大量地和第二试剂中含有的IgA敏化的胶乳颗粒反应。但是，因为随着样品中IgA浓度的升高，在第一试剂中残留的抗IgA抗体的量下降，抗IgA抗体和第二试剂中含有的IgA敏化的胶乳颗粒的反应程度降低，导致低吸光度值。
实施例2
本发明的检测方法和TIA法的相关性
1)IgA检测试剂的制备和检测条件
采用了和实施例1相同的试剂和检测条件。
2)使用自动分析仪进行定量
使用实施例1中所述的标准样品和给出的Autoanalyzer HitachiModel 7170S多点标准曲线函数进行了定量。
3)在血清样品中的检测
作为样品，使用了利用稀释缓冲液对血清进行了适当稀释所获得的稀释液。使用“N-assay TIA IgA-SH”(Nitto Boseki Co.，Ltd.)(市售的TIA法试剂)作为对照试剂验证了相关性。相似地，依据特定的参数使用Autoanalyzer Hitachi Model 7170S进行了TIA法检测。
4)检测结果
图2显示了本发明的检测方法和TIA法的相关性的研究结果。如图2所示，以TIA法为X，本发明的方法为Y，验证了相关性，获得了下面的良好结果：Y＝1.02X+0.7；相关系数0.998(N＝30)。该结果表明，本发明的方法可对血清中IgA浓度进行精确检测。
实施例3
IgA和抗IgA抗体的检测
1)检测试剂的制备和检测条件
采用和实施例1相同的试剂和检测条件。
2)用于检测的样品
作为样品，使用了利用稀释缓冲液对含有IgA或抗IgA抗体的样品进行适当的系列稀释所获得的稀释液。
3)使用自动分析仪定量
使用实施例1中所述的标准样品中的0mg/ml和1mg/ml标准样品，和给出的Autoanalyzer Hitachi Model 7170S的两点标准曲线函数，进行了定量。
4)检测结果
表2和图3显示了样品中IgA和抗IgA抗体的检测结果
表2对样品中IgA和抗IgA抗体的检测结果
如表2和图3所示，对利用系列稀释所获得的样品中的IgA和抗IgA抗体进行检测的结果在原点两侧区域都显示了令人满意的线性关系。该事实表明：在本发明的检测方法中，通过使用原点和利用含有已知浓度IgA的标准样品所获得的标准曲线，对样品中的IgA浓度进行了测量，并且，当样品中含有抗IgA抗体时，抗IgA抗体浓度被定义为负IgA浓度值，并被精确检测。
实施例4
人CRP和抗人CRP抗体的检测
已经证实，可以使用含有负载于微粒上的抗原和抗体的检测试剂对抗原和抗体都进行检测。
特别的，使用含有被抗人CRP抗体(负载于微粒上的抗体)和人CRP(抗原)敏化的胶乳的检测试剂对样本中人CRP(抗原)或抗人CRP抗体(抗体)的浓度进行了检测。当样本中含有抗人CRP抗体时，使用来自于山羊的含有抗人CRP抗体的样本作为模式样品。
1)被抗人CRP抗体敏化的胶乳颗粒的制备
如下将抗人CRP抗体吸附到胶乳颗粒上。
向100ml的粒径120nm的聚苯乙烯胶乳粒子的1％悬浮液混合100ml的通过将抗人CRP抗体溶解在Tris缓冲液中制成的3.0mg/mL浓度的溶液，将得到的混合物在室温下搅拌1小时，然后在20,000rpm离心45分钟，除去上清液，并回收沉淀物。将如此得到的沉淀物悬浮在100ml的包被缓冲液中，然后经过超声波处理以完全分散胶乳粒子，随后在下搅拌1小时。随后，离心搅拌的悬浮液，将沉淀悬浮于100mL的Tris缓冲液中。对悬浮液进行超声波处理以完全分散胶乳粒子，籍此获得1％的被抗人CRP抗体敏化的胶乳颗粒悬浮液。
2)用于检测人CRP和抗人CRP抗体的试剂的制备
使用被抗人CRP抗体和人CRP敏化的胶乳颗粒，如下制备第一试剂和第二试剂。
作为第一试剂，使用了含有0.10mg/dL的人CRP的Tris缓冲液。
作为第二试剂，使用了使用Tris缓冲液对如上述1)所述的1％的被抗人CRP抗体敏化的胶乳颗粒悬浮液进行5倍稀释所获得的稀释液。
试剂成分如下。
Tris缓冲液成分
Tris(三羟甲基氨基甲烷) 50mM pH 7.5
氯化钠 150mM
包被缓冲溶液成分
Tris 50mM pH 7.5
氯化钠 150mM
BSA(牛血清白蛋白) 1.0％
第一种试剂
Tris缓冲液
人CRP 0.10mg/dL
第二种试剂
Tris缓冲液
被抗人CRP抗体敏化的胶乳颗粒 0.2％(v/v)
3)检测方法
使用Autoanalyzer Hitachi Model 7180进行检测，其中将120μL第一试剂和120μL第二试剂和2.4μL的每种样品反应，随后在主波长570nm和互补波长800nm下在第18和第28光测点之间(对应于刚加入R2到加入后2.5分钟的时期)利用两端点法检测吸光度变化程度。
作为样品，使用了利用生理盐水对含有人CRP和抗人CRP抗体的样品进行适当的系列稀释所获得的稀释液。
4)检测结果
表3和图4显示了使用上述试剂对样品中人CRP和抗人CRP抗体进行检测的结果。
表3样品中的CRP和抗人CRP抗体的检测结果
根据表3和图4显示的对样品中人CRP和抗人CRP抗体进行检测的结果可以发现，吸光度随着样品中人CRP的浓度的增加而增加，并随着样品中抗人CRP抗体的浓度的增加而减少。该事实表明：根据本发明的方法，使用标准曲线(所述标准曲线是利用含有0mg/dL的人CRP的标准样品和含有已知浓度的人CRP的标准样品获得的)可以检测样品中的人CRP浓度，并且，当样品中含有抗人CRP抗体时，可以以负人CRP浓度值测量抗人CRP抗体的浓度。
工业适用性
通过采用本发明的检测方法和检测试剂，可以通过使用免疫凝集检测系统检测样品中的抗原，并且当样品中含有针对该抗原的抗体时，还可以通过使用和针对所述抗原相同的试剂检测该抗体。此外，通过一轮检测，使用同一种试剂，使用在检测试剂中的少量且昂贵的抗体，可以实现下述情况。当样品中含有抗原时，可以将其检测出来。当样品中含有针对该抗原的抗体时，可以将其检测出来。因此，样品中的抗原和针对该抗原的抗体都可以被检测出来。当样品中既不含抗原又不含针对该抗原的抗体时，也可以通过采用本发明的检测方法和检测试剂来证实它们的不存在。
Claims (7)
1.下述第一试剂和第二试剂在制备检测样品中抗原或针对该抗原的抗体的测定用试剂中的用途，
其中，第一试剂含有能够和样品中的抗原发生抗原-抗体反应的抗体；第二试剂含有能够与样品和第一试剂任一方中的抗体发生抗原-抗体反应的由微粒所负载的抗原，
所述的测定用试剂以下述样品为测定对象：
所述样品是含有抗原而不含有针对该抗原的抗体的样品，或不含有抗原但是含有针对该抗原的抗体的样品，或者既不含有抗原又不含有针对该抗原的抗体的样品，
(i)将样品和第一试剂与第二试剂混合，
(ii)当样品中含有抗原时，针对于第一试剂的抗体，使样品中的抗原以及第二试剂的微粒上负载的抗原之间发生竞争性抗原-抗体反应，并根据抗原-抗体反应所引起的凝集的减少程度来检测样品中的抗原，或者
(iii)当样品中含有抗体时，使第二试剂的微粒上负载的抗原、和样品中的抗体以及作为检测试剂的抗体发生抗原-抗体反应，并根据抗原-抗体反应所引起的凝集的增加程度来检测样品中的抗体。
2.下述第一试剂和第二试剂在制备检测样品中的抗原或针对该抗原的抗体的测定用试剂中的用途，
其中第一试剂含有能够和样品中的抗原发生抗原-抗体反应的抗体，
第二试剂含有能够与样品和第一试剂任一方中的抗体发生抗原-抗体反应的抗原，
其中所述测定用试剂以下述样品为测定对象：所述样品是含有抗原而不含有针对该抗原的抗体的样品，或不含有抗原但是含有针对该抗原的抗体的样品，或者既不含有抗原又不含有针对该抗原的抗体的样品，
(i)将样品和第一试剂与第二试剂混合，
(ii)当样品中含有抗原时，使第一试剂的在微粒上负载的抗体、和样品中的抗原以及第二试剂的抗原之间发生抗原-抗体反应，并根据抗原-抗体反应所引起的凝集的增加程度来检测样品中的抗原，或者
(iii)当样品中含有抗体时，针对于第二试剂的抗原，使样品中的抗体、以及第一试剂的微粒上负载的抗体发生竞争性抗原-抗体反应，并根据抗原-抗体反应所引起的凝集的减少程度来检测样品中的抗体。
3.权利要求1的用途，其中所述抗原通常存在于来自于正常人类或动物的生物样品中，但是不存在于来自于数量极其有限的、具有针对该抗原的抗体的人类或动物的生物样品中。
4.权利要求2的用途，其中所述抗原通常存在于来自于正常人类或动物的生物样品中，但是不存在于来自于数量极其有限的、具有针对该抗原的抗体的人类或动物的生物样品中。
5.权利要求1的用途，其中所述样品中的抗原是IgA，并且所述样品中的所述抗体是抗IgA抗体。
6.权利要求2的，其中所述样品中的抗原是IgA，并且所述样品中的抗体是抗IgA抗体。
7.权利要求1的用途，在无需稀释样品的情况下实施，使用抗体和由微粒负载的抗原作为检测试剂，以避免前带现象。
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