JP2003294753A - 凝集反応増感剤、免疫測定用試薬及び免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決課題】 凝集反応の測定系での使用に適し、増感
作用が高く、しかも検体や反応混合液の粘度の上昇を起
こしにくく、再現性・精度が良好であり、取り扱いの容
易な凝集反応増感剤、特にラテックス凝集法において高
い測定感度及び定量性を実現することができる凝集反応
増感剤、及びそれを用いる免疫測定用試薬、及びそれら
を使用する免疫測定法を提供する。 【解決手段】 少なくとも１種のアルギン酸を含有する
凝集反応増感剤、この凝集反応促進剤を含有する免疫測
定用試薬及びこの免疫測定用試薬を含むキット、及びそ
れらを使用する免疫測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、凝集反応に基づく免疫
測定法のための増感剤及びそれを使用する免疫測定法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原・抗体による凝集反応を利用して特
定の抗原又は抗体を測定する免疫測定法（イムノアッセ
イ）は、臨床検査、生化学研究等の領域において広く使
用されている。このような測定法においては、一般に、
測定対象の抗原に対する抗体又は測定対象の抗体に対す
る抗原を、担体を利用し又は利用せずに、測定対象物を
含む可能性のある検体と接触させ、測定対象物が存在す
る場合に抗原抗体反応の結果として反応混合液中で起こ
る凝集反応を検出する。担体を利用する方法は、担体を
利用しない方法に比べて性能がよいため、担体を利用す
る方法（例えば担体としてポリスチレンビーズを使用す
るラテックス凝集法）は特に広く行われている。

【０００３】凝集の検出は、通常、凝集によって生じる
散乱光を測定する免疫比ろう法（ネフェロメトリー）又
は透過光を測定する免疫比濁法のいずれかによって行わ
れる。これらの検出法は、それぞれ一長一短を有し、い
ずれも一般的に使用されている。

【０００４】免疫測定法において、一般に、測定感度・
精度の向上、抗原抗体反応の促進・安定化等を目的とし
て、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、
カルボキシメチルセルロース等の種々のポリマー化合物
が使用されている。

【０００５】しかし、これらの化合物は、いずれも粘性
が高いため扱いにくく、非特異反応も同時に促進し、凝
集反応の測定系における使用には難点があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、凝集反応の測定系での使用に適し、増感作用が高
く、しかも検体や反応混合液の粘度の上昇を起こしにく
く、再現性・精度が良好であり、取り扱いの容易な凝集
反応増感剤、特にラテックス凝集法において高い測定感
度及び定量性を実現することができる凝集反応増感剤、
及びそれを用いる免疫測定用試薬、及びそれらを使用す
る免疫測定法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、少なくとも
１種のアルギン酸を含有する凝集反応増感剤を用いるこ
とにより、上記の目的を達成し得ることを見出した。即
ち、本発明の凝集反応増感剤は、アルギン酸、特にアル
ギン酸ナトリウム又はアルギン酸プロピレングリコール
を少なくとも１種含有することを特徴とする。

【０００８】また、本発明の免疫測定用試薬は、少なく
とも１種のアルギン酸を含有する凝集反応増感剤を含む
ことを特徴とする。本発明の免疫測定用試薬は、例え
ば、アルギン酸を含有する凝集反応増感剤を含む検体希
釈液であることもでき、また、アルギン酸を含有する凝
集反応増感剤と、測定対象物に対する抗原又は抗体とを
含む凝集試薬であることもできる。また、検体希釈液と
凝集試薬との両方の用途を兼ねる試薬であることもでき
る。

【０００９】本発明の免疫測定用試薬は、測定に用いる
他の試薬及び／又は容器類等と組み合わせて免疫測定用
キットとして提供することもできる。即ち、本発明の免
疫測定キットは、少なくとも１種のアルギン酸を含有す
る凝集反応増感剤を含む免疫測定用試薬と、他の試薬、
容器又は使用法説明書の少なくとも１つとを含むことを
特徴とする。

【００１０】本発明の免疫測定法は、測定対象物に対す
る抗原又は抗体を、少なくとも１種のアルギン酸の存在
下で、測定対象物を含む可能性のある検体と接触させる
工程及び前記工程の結果として生じる凝集反応を検出す
る工程を含むことを特徴とする。

【００１１】

【発明の実施の形態】１．凝集反応増感剤 本発明の凝集反応増感剤は、必須成分として少なくとも
１種のアルギン酸を含有することを特徴とする。本発明
に関して、「アルギン酸」という用語は、アルギン酸、
アルギン酸の塩、及びアルギン酸のアルコールエステル
（アルギン酸プロピレングリコール）の総称として用い
られる。アルギン酸は、カッソウ類の構造多糖類であっ
て、Ｄ−マンノウロン酸がβ−１，４結合によって重合
した直鎖分子である。アルギン酸塩としては、アルギン
酸のナトリウム塩等が挙げられる。アルギン酸ナトリウ
ムは保存安定性及び溶解性の点から好ましい。アルギン
酸ナトリウムは、水溶性の白色ないし淡黄色の粉末であ
り、乳化剤、安定剤、吸水剤等として用いられている。
アルギン酸プロピレングリコールも好ましい。これらの
アルギン酸は、本発明の増感剤、免疫測定用試薬及び方
法において、単独で又は組み合わせて使用することがで
きる。

【００１２】本発明の増感剤においてアルギン酸が凝集
反応の増感作用を有するメカニズムは、粒子が互いに接
近すると有限の広がりをもつ溶存高分子が粒子の間隙か
ら排除される、いわゆる枯渇効果であり、アルギン酸の
直鎖状分子内に検体由来の抗原又は抗体が入り込み、測
定試薬由来の抗体又は抗原との接触回数が増え、それに
よって凝集反応が促進されるものと考えられる。

【００１３】アルギン酸には、その粘性に応じて１００
〜１５０ｃｐ、３００〜４００ｃｐ、５００〜６００ｃ
ｐ等のグレードのものがあるが、本発明において使用さ
れるアルギン酸、特にアルギン酸ナトリウム及びアルギ
ン酸プロピレングリコールは、それらのいずれであって
もよい。本発明においては、水性溶液としたときの粘性
が低い方が、扱い易さ及び同時再現性の点から優れてい
るが、その意味においては３００ｃｐ以下が好ましく、
２００ｃｐ以下が更に好ましく、１００〜１５０ｃｐが
最も好ましい。

【００１４】本発明の増感剤は、ｐＨ緩衝剤、塩類、ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、界面活性剤等の付加的成
分を含んでいてもよい。

【００１５】本発明の増感剤は、粉末の形態であって、
使用時に水性媒体に溶解して使用するものであってもよ
い。溶解するための水性媒体としては、精製水、生化学
分野において通常使用され得る、リン酸緩衝液、グリシ
ン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩
衝液等の各種緩衝液等が挙げられる。特に、リン酸緩衝
液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液等が好ましい。ある
いは、本発明の増感剤は、アルギン酸を精製水又は上記
のような成分を含有する水性媒体に予め溶解させた水性
溶液の形態であってもよい。水性溶液形態の増感剤中の
アルギン酸の濃度は、溶解性の点から、０．００１〜１
（Ｗ／Ｖ）％が好ましく、使用上の便宜の点からは０．
０５〜１（Ｗ／Ｖ）％が好ましい。

【００１６】本発明の増感剤は、少量の添加で充分な効
果を得ることができる。凝集反応を起こさせる液体（各
種試薬及び検体等を含む反応混合液）中でのアルギン酸
の最終濃度は、濃度が高すぎると液体の粘度が上昇して
精度や扱い易さが損なわれ易くなり、一方、濃度が低す
ぎると充分な凝集促進効果が得られにくいため、０．０
０１〜１（Ｗ／Ｖ）％が好適であり、好ましくは０．０
１〜０．５（Ｗ／Ｖ）％である。少量の添加で充分な効
果を得ることができる本発明の利点を利用するうえで
は、０．０１〜０．３（Ｗ／Ｖ）％が好適であり、最も
好ましくは０．０３〜０．１（Ｗ／Ｖ）％である。

【００１７】２．免疫測定用試薬 本発明の凝集反応増感剤を、免疫測定法において使用さ
れる各種の試薬に含有させて、増感作用の高い免疫測定
用試薬を作製することができる。

【００１８】例えば、免疫測定法において、一般に血
清、血漿等の各種生物学的液体サンプルを適当な濃度に
希釈することが行われるが、このような検体希釈液に本
発明の凝集反応増感剤を含有させてもよい。検体希釈液
は、通常、ｐＨ緩衝剤、アルブミンやグロブリン等のタ
ンパク質、アミノ酸、及び／又は界面活性剤等の成分を
含有する水性溶液である。検体希釈液中のアルギン酸の
濃度は、溶解性の点から、０．００１〜１（Ｗ／Ｖ）％
が好ましい。

【００１９】また、凝集法において使用される凝集試薬
に本発明の増感剤を含有させることもできる。凝集試薬
は、一般に、測定対象物に対する抗原又は抗体を含む液
体、又は測定対象物に対する抗原又は抗体を担持する不
溶性担体を含む懸濁液であることが多い。

【００２０】凝集反応に基づく免疫測定法において測定
対象とされる物質は、抗原又は抗体である。測定対象物
としては、レセプター、酵素、血中タンパク（例えばガ
ン胎児性タンパク）、感染症関連抗原（例えばＢ型肝炎
ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、梅毒病原体、ヒト免疫不
全ウイルス、病原性大腸菌等の抗原）、及びそれらに対
する抗体が挙げられる。

【００２１】したがって、凝集試薬は、測定対象が抗原
であればそれに対する抗体を、測定対象が抗体であれば
それに対する抗原を、必須の構成要素とする。例えば測
定対象がヘリコバクター・ピロリ菌に対する抗体であれ
ば、凝集試薬はヘリコバクター・ピロリの抗原を含む。
なお、本明細書において「抗体」というときは、特定の
抗原に対する結合性を有する限りにおいて各種の抗体の
フラグメント等をも含む。

【００２２】本発明の増感剤は、凝集法であれば、凝集
試薬に抗原又は抗体の担体を使用するか否かにかかわら
ず、用いることができる。凝集試薬に担体を使用する場
合には、直径０．１〜０．５μｍ程度の不溶性微粒子が
一般に使用される。具体的には、赤血球、炭素粉末、ベ
ントナイト、カオリン、レシチンのミセル、ゼラチン粒
子等が挙げられるが、特にポリスチレン微粒子（ラテッ
クス粒子）が好適に使用される。このような担体に測定
対象に対する抗原又は抗体を担持させる方法は、当業者
には周知である。

【００２３】更に、本発明の免疫測定用試薬は、本発明
の凝集反応増感剤とともに、上述したような検体希釈液
の成分と凝集試薬の必須成分とを含み、検体希釈液と凝
集試薬との両方の用途を兼ねた試薬であってもよい。こ
のような試薬を使用すれば、検体を予め希釈することな
く、直接この試薬と混合するだけで適正な凝集反応を生
じさせることができる。

【００２４】３．免疫測定用キット 上記のような本発明の免疫測定用試薬を、測定に用いる
他の試薬及び／又は容器類等と組み合わせて、免疫測定
用キットとして提供することができる。即ち、本発明の
免疫測定用キットは、少なくとも１種のアルギン酸を含
有する凝集反応増感剤を含む免疫測定用試薬と、他の試
薬、容器又は使用法説明書の少なくとも１つとを含むこ
とを特徴とする。例えば、キットがアルギン酸を含有す
る凝集反応増感剤を含む検体希釈液を含む場合、キット
の他の構成要素としては、特定の測定対象物の陽性対照
試料、キャリブレーション用標準物質、陰性対照試料、
測定対象物に対する抗原又は抗体を担持させた微粒子担
体を含む凝集試薬、反応容器、及び／又は使用法説明書
等が挙げられる。使用法説明書には、通常、検体の必要
量、キットに含まれる試薬の使用量、反応条件、検出方
法、結果の判定方法等の説明が記載される。

【００２５】また、キットがアルギン酸を含有する凝集
試薬を含む場合、そのキットにはアルギン酸を含有しな
い検体希釈液を含ませてもよい。キットが、アルギン酸
を含有する凝集反応増感剤を含む免疫測定用試薬とし
て、検体希釈液としても作用する溶液中に、測定対象物
に対する抗原又は抗体を担持させた微粒子担体を含む凝
集試薬を含む場合、キットの他の構成要素は使用法説明
書のみであってもよい。

【００２６】４．免疫測定法 本発明の免疫測定法は、測定対象物に対する抗原又は抗
体を、少なくとも１種のアルギン酸の存在下で、測定対
象物を含む可能性のある検体と接触させる工程（反応工
程）及び前記工程の結果として生じる凝集反応を検出す
る工程（検出工程）を含むことを特徴とする。

【００２７】反応工程においては、凝集試薬、アルギン
酸、及び検体を液体中において共存させることが必須で
あるが、これらを一緒にする順序は問わない。したがっ
て、これらを同時に一緒にしてもよく、また、反応工程
の前に、凝集試薬とアルギン酸、凝集試薬と検体、又は
アルギン酸と検体、のいずれかを予め一緒にしておいて
もよい。例えば、検体を、アルギン酸を含有する検体緩
衝液で希釈しておき、これに凝集試薬を添加することが
できる。また、アルギン酸を含む溶液中に懸濁させた凝
集試薬を、検体と一緒にしてもよい。反応温度は、通常
は４℃〜５０℃の範囲であるが、温度が低すぎると抗原
抗体の衝突が低減し、温度が高すぎると免疫複合体の安
定性が低下するため、１５℃〜４０℃が好ましく、特に
３０℃〜４０℃が好ましい。反応時間は、通常は０分〜
６０分の範囲である。したがって、反応工程と検出工程
とは同時に行ってもよい。しかし、反応時間が短いと検
体中の測定対象物濃度が低い場合等には免疫複合体の形
成が不充分になることがあり、また、長すぎると免疫複
合体が不安定になることがある。好ましくは、１分〜３
０分の範囲である。反応は、生化学の分野において通常
好適に使用される緩衝液中で行うことが好ましい。反応
工程の反応混合液のｐＨは、通常５〜１０の範囲であ
る。免疫複合体の安定性の点からは、特にｐＨ６〜９が
好ましい。

【００２８】検出工程においては、肉眼で凝集の形成を
判定してもよいが、判定の再現性及び大量の検体の処理
の点からは、光学的機器を用いて凝集の程度を測定する
ことが好ましい。測定機器は、ネフェロメトリー及び比
濁法のいずれの原理に基づくものであってもよい。

【００２９】

【実施例】実施例１：凝集促進作用の試験 １．検体希釈液の調製 リン酸一ナトリウム及びリン酸二ナトリウムを精製水に
溶解して、リン酸の最終濃度が０．１Ｍ、ｐＨが７．４
のリン酸緩衝液を調製した。このリン酸緩衝液に、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）を１％（Ｗ／Ｖ）になるよう
に溶解し、１％ＢＳＡ／リン酸緩衝液（１％ＢＳＡ−Ｐ
Ｂ）を調製して、これを増感剤なしの検体希釈液（「検
体希釈液０」）とした。この検体希釈液に、０．０８０
（Ｗ／Ｖ）％のアルギン酸ナトリウム（グレード３００
〜４００ｃｐ；和光純薬（株）製）を添加して本発明の
増感剤を含む検体希釈液（「検体希釈液１」）とした。
更に、比較のため、同様にして表１に挙げる各種の物質
を表１に記載の濃度で添加し、検体希釈液２〜１１を調
製した。

【００３０】

【表１】

【００３１】２．試験方法 上記で調製した各検体希釈液の増感作用を梅毒抗体測定
系にて試験した。検体（梅毒陽性標準血清；積水化学工
業（株）製、濃度は０、３９、１２１、２３７又は４０
５ＴＵ） ２０μＬ、検体希釈液（上記の各種検体希釈
液０〜１１のいずれか） ３５０μＬ、及び梅毒抗原を
担持させたラテックス担体粒子を含む懸濁液形態の凝集
試薬（「メディエースＴＰＬＡラテックス懸濁液」；積
水化学工業（株）製））５０μＬを混合し、生化学自動
分析装置「日立７０８０形」を使用して、測定波長７０
０ｎｍで吸光度を測定し、キャリブレーションを行っ
た。

【００３２】結果を表２及び図１に示す。

【表２】

【００３３】表２及び図１に示すように、増感剤なしの
場合と比較して、試験した１〜１１のいずれの物質につ
いてもラテックス凝集促進効果は認められた。しかし、
ＦＩＣＯＬＬは他の物質と比較して特に効果が低く、ま
た、ポリビニル硫酸カリウム及びポリアクリル酸は、梅
毒抗体高濃度領域において反応性が低かった。

【００３４】これに対し、アルギン酸ナトリウム及びア
ルギン酸プロピレングリコールは、低濃度領域から高濃
度領域にわたって一貫して増感作用が高く、非常に少な
い添加量であったにもかかわらず、他の物質と同等以上
の効果が得られた。

【００３５】実施例２：アルギン酸ナトリウム添加濃度
の検討 実施例１と同様に調製した１％ＢＳＡ−ＰＢに表３に示
す物質を示した濃度で添加した検体希釈液を調製し、実
施例１と同様の方法でキャリブレーションを測定した。

【００３６】

【表３】

【００３７】結果を表４及び図２に示す。

【表４】

【００３８】アルギン酸ナトリウムの添加濃度は、高い
ほど反応性の上昇が認められた。しかし、０．１％の添
加濃度では抗体高濃度領域においてキャリブレーション
カーブが湾曲し、直線領域が狭くなることがわかった。

【００３９】実施例３：保存試験 実施例１と同様にして表５に示す物質を添加した検体希
釈液を調製した。

【００４０】

【表５】

【００４１】各検体希釈液を実施例１と同様の方法で試
験し、キャリブレーションを行った（「０日」）。ま
た、各々の検体希釈液を４０℃で１日及び７日保存した
後にも同様の測定を行って保存安定性を試験した（「１
日」及び「７日」）。

【００４２】結果を表６に示す。表中、「変化率
（％）」は、以下のようにして算出した： 変化率（％）＝〔（１日目又は７日目の測定値の平均
値）／（０日目測定値の平均値）×１００〕−１００。

【００４３】

【表６】

【００４４】アルギン酸ナトリウム及びポリアクリル酸
は４０℃条件下で７日保存しても安定であり、凝集促進
効果が低下しないことがわかった。これは、ポリビニル
ピロリドンと同等の安定性であった。他の物質について
は反応性の低下が認められた。

【００４５】実施例４：同時再現性の比較 実施例１と同様に表７に示す物質を添加した検体希釈液
を調製した。

【００４６】

【表７】

【００４７】実施例１と同様にキャリブレーションを行
った後、測定値約１８．６ＴＵの梅毒陽性血清を検体と
して連続１０回測定し、変動係数（ＣＶ値）を算出し、
比較検討した。

【００４８】結果を表８に示す。

【表８】

【００４９】アルギン酸ナトリウムは他の物質と比較し
てＣＶ値が小さく、良好な再現性を示すことがわかっ
た。

【００５０】実施例５：粘度の測定 実施例１と同様に表９に示す物質を添加した検体希釈液
を調製した。

【００５１】

【表９】

【００５２】上記で調製した検体希釈液の粘度を、オス
トワルド計（相対粘度計；ＴＯＰ−Ｋ−１１２１２−１
８、（株）相互理化学硝子製作所製）を用いて室温条件
下（約２４℃）で測定した。具体的には、オストワルド
計内部に、予め２４℃にした試料（検体希釈液）５．０
ｍｌをピペットを注入し、この試料をオストワルド計の
一端から吸い上げ、試料を自然落下させて、オストワル
ド計管内の一定部位間を落下するのに要した時間（秒）
を測定した。

【００５３】結果を表１０に示す。

【表１０】

【００５４】アルギン酸ナトリウム及びカルボキシメチ
ルセルロースナトリウムは、他の物質と比較して粘性が
低く、良好であった。

【００５５】実施例６：アルギン酸ナトリウムのグレー
ドの比較 実施例１と同様に表１１に示す物質を添加した検体希釈
液を調製した。

【００５６】

【表１１】

【００５７】実施例５と同様の方法で粘度を測定した。
また、実施例１と同様の方法でキャリブレーションを行
い、実施例４と同様の方法で同時再現性を試験した。結
果を、表１２〜１４に示す。

【００５８】

【表１２】

【００５９】

【表１３】

【００６０】

【表１４】

【００６１】試験したアルギン酸ナトリウムは、いずれ
のタイプのものについても充分な凝集促進効果が認めら
れた。特に、１００〜１５０ｃｐタイプのものが最も粘
性が低く、同時再現性についても良好であった。

【００６２】実施例７：ＨＢｓ抗原測定系における効果 実施例１と同様に表１５に示す物質を添加した検体希釈
液を調製した。

【００６３】

【表１５】

【００６４】上記で調製した各検体希釈液の増感作用を
ＨＢｓ抗原（Ｂ型肝炎表面抗原）測定系にて試験した。
検体（ＨＢｓ抗原標準物質；極東製薬工業（株）製、濃
度は０、９．６、４８．２、９６．４、２８９．３又は
４８２．２ＩＵ／ｍＬ） ２０μＬ、検体希釈液（上記
の各種検体希釈液０〜８のいずれか） １４０μＬ、及
びＨＢｓ抗体を担持させたラテックス担体粒子を含む懸
濁液形態の凝集試薬（「ランピアラテックスＨＢｓ抗原
ラテックス懸濁液」；極東製薬工業（株）製））１４
０μＬを混合し、生化学自動分析装置「日立７０８０
形」を使用して、測定波長８００ｎｍで吸光度を測定
し、キャリブレーションを行った。

【００６５】結果を表１６に示す。

【表１６】

【００６６】この系においても、アルギン酸ナトリウム
は優れた凝集促進作用を示し、その添加濃度の上昇につ
れて測定感度の向上が認められた。

【００６７】

【発明の効果】本発明によれば、凝集反応の測定系での
使用に適し、増感作用が高く、しかも検体や反応混合液
の粘度の上昇を起こしにくく、再現性・精度が良好であ
り、取り扱いの容易な凝集反応増感剤が提供される。本
発明の増感剤を使用すると、特にラテックス凝集法にお
いて高い測定感度及び定量性を実現することができる。
また、本発明の免疫測定法によれば、反応混合液の粘度
の上昇を起こしにくく、再現性・精度が良好な凝集反応
に基づく免疫測定結果を、簡便に得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 各種物質を添加した検体希釈液のラテックス
凝集促進効果を示す図である。

【図２】 各種濃度のアルギン酸ナトリウムを添加した
検体希釈液のラテックス凝集促進効果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山岸 昇芳 茨城県高萩市大字上手綱字朝山3333−26 極東製薬工業株式会社高萩工場 (72)発明者 皆川 健治 茨城県高萩市大字上手綱字朝山3333−26 極東製薬工業株式会社高萩工場

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１種のアルギン酸を含有する
   凝集反応増感剤。
2. 【請求項２】 少なくとも１種のアルギン酸を含有する
   凝集反応増感剤を含む免疫測定用試薬。
3. 【請求項３】 検体希釈液である、請求項２記載の免疫
   測定用試薬。
4. 【請求項４】 測定対象物である抗原に対する抗体又は
   測定対象物である抗体に対する抗原を更に含む凝集試薬
   である、請求項２記載の免疫測定用試薬。
5. 【請求項５】 請求項２〜４のいずれか１項記載の免疫
   測定用試薬と、他の試薬、容器又は使用法説明書の少な
   くとも１つとを含むことを特徴とする、免疫測定用キッ
   ト。
6. 【請求項６】 測定対象物に対する抗原又は抗体を、少
   なくとも１種のアルギン酸の存在下で、測定対象物を含
   む可能性のある検体と接触させる工程及び前記工程の結
   果として生じる凝集反応を検出する工程を含むことを特
   徴とする免疫測定法。