JP2002303630A - ラテックス免疫比濁測定法及びそれに用いるキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なラテックス免疫比濁測定法及びそれに
用いるキットを提供することを目的とする。 【解決手段】 測定しようとする抗原を含む検体とチオ
グリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを混
合し、次いで、検体中の抗原と該抗原に対する抗体を感
作させたラテックス粒子とを反応させることにより、検
体中のリウマチ因子などの影響を受けることなく、検体
中の抗原を特異的に測定することができる。また、チオ
グリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールと、
測定しようとする抗原に対する抗体を感作させたラテッ
クス粒子とからなる測定用キットは保存安定性に優れて
いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ラテックス免疫比濁測
定法及びそれに用いるキットに関する。更に詳細には、
検体中のＣ反応性蛋白質（以下ＣＲＰと記載することも
ある）などの抗原を、検体中のリウマチ因子（以下ＲＦ
と記載することもある）などの影響を受けることなく、
特異的に測定することのできるラテックス免疫比濁測定
法及びそれに用いる保存安定性に優れたキットに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】免疫学的測定法の一つであるラテックス
免疫比濁測定法は、測定対象である抗原を含有する検体
と、該抗原に対する抗体を感作したラテックス粒子とを
混合して抗原抗体反応を行い、生成した免疫凝集物の量
を、得られた反応液の濁度を測定することにより求め、
その測定値から検体中の抗原量を測定する方法である。
ラテックス免疫比濁測定法は簡便な方法により検体中の
抗原を高感度で高精度に測定できるため、従来より臨床
検査や実験室での免疫学的研究に広く用いられてきた。
しかしながら、ラテックス免疫比濁測定法の対象となる
血清などの検体中には、ヒトの個体特性、採取条件等に
より、生体成分であるＲＦ等が混在しており、ラテック
ス免疫比濁測定法により得られる測定値に誤差を生じる
という問題がある。これら検体中のＲＦなどによる非特
異的反応の影響を解消、軽減する種々の手法が検討され
ている。ＲＦは、自己抗体であり、変性ヒトＩｇＧのＦ
ｃ部分に対して反応することが知られている。ＲＦは、
ヒト検体中のＲＦの濃度等の条件により、ヒトとは異な
る種類の動物から得た、検体中の抗原を測定するための
試薬の構成成分の一つである抗体に対して反応する場合
があり、これが、ラテックス免疫比濁測定法による臨床
検査において非特異的反応の要因となる。こうしたＲＦ
による測定時の非特異的反応を回避するため、測定の前
に血清などの検体中の内因性のＲＦを不活性化するか又
は除去する等の前処理が通常必要で、この前処理をしな
ければ測定の結果は著しい誤差を生じる場合がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】特開昭５４−１１９２
９２号公報には、ＲＦによる非特異的反応を回避するた
めに、検体中の抗原を測定するための試薬の構成成分の
一つである異種抗体分子のＦｃ部分を酵素反応で取り除
いたＦ（ａｂ′）２分子を、抗体として用いる免疫測定
法が開示されている。しかしながら、このような免疫測
定法は、酵素反応、精製等の試薬調製のための煩雑な工
程を必要とするため、コストアップ、製造ロット間差に
つながるなどの欠点がある。また、特開平８−８６７８
３号公報には、免疫比濁測定法において、スレオ−１，
４−ジメルカプト−２，３−ブタンジオール（ＤＴＴ）
を使用して非特異的反応を低下させることが開示されて
いる。しかしながら、この免疫比濁測定法をそのままラ
テックス免疫比濁測定法に適用した場合には、測定試薬
の保存安定性に問題があり、改良が必要である。従っ
て、本発明の目的は、検体中のＣＲＰなどの抗原を、検
体中のＲＦなどの影響を受けることなく、特異的に測定
することのできるラテックス免疫比濁測定法及びそれに
用いる保存安定性に優れたキットを提供することにあ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ＲＦなどの
影響を受けることなく、検体中のＣＲＰなどの抗原を特
異的に測定することのできるラテックス免疫比濁測定法
及びそれに用いる保存安定性に優れたキットを得ること
を目的として鋭意研究した結果、測定対象である検体中
の抗原と該抗原に対する抗体とを反応させる前に、あら
かじめチオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセ
ロールを混合することにより、ラテックス免疫比濁測定
法による検体中の抗原の特異的な測定が可能となり、ま
た、測定試薬の構成成分の一つとしてチオグリコール酸
もしくはその塩又はチオグリセロールを用いることによ
り、保存安定性に優れたキットが得られることを見出
し、本発明を完成させた。

【０００５】従って、本発明は、検体中の抗原を測定す
るラテックス免疫比濁測定法において、検体とチオグリ
コール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを混合
し、次いで、検体中の抗原と該抗原に対する抗体を感作
させたラテックス粒子とを反応させることを特徴とする
ラテックス免疫比濁測定法である。更に本発明は、検体
中の抗原をラテックス免疫比濁測定法により測定するた
めのキットであって、 ｉ）チオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロ
ールを必須成分として含む試薬、及び ｉｉ）検体中の抗原に対する抗体を感作させたラテック
ス粒子を必須成分として含む試薬からなるキットであ
る。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明で対象とする検体として
は、ヒトの血液、血清、血漿などが挙げられ、特に血清
が検体として望ましい。本発明で測定する検体中の抗原
としては、特に限定されず、従来から免疫測定法で測定
され得る抗原のいずれも測定可能である。このような抗
原としては、例えば、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、ヒトア
ルブミン等の高分子量蛋白質や、薬物、ペプチド等の低
分子量の抗原性物質等が挙げられる。例えば、ＣＲＰ
は、急性炎症あるいは急性の組織崩壊で増加する急性期
蛋白の一種で代表的な炎症マーカーである。そのため、
ＣＲＰの定量は、炎症・組織障害を起こす種々の疾患の
活動性、重症度、経過をみる際に不可欠である。したが
って、病院、臨床検査センター等において、ＣＲＰはル
ーチンで測定されている。このような検体中の抗原と抗
原抗体反応させるための抗体は、通常これらの抗原で動
物を公知の方法により免疫して得られる動物由来の抗体
である。動物としては、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ニワト
リ、マウス、ウシ、ウマ、サルなどが挙げられ、抗体と
しては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、こ
れら抗体の抗原結合性断片などが挙げられる。このよう
な抗体で感作させるラテックス粒子としては特に限定さ
れず、例えば、有機高分子化合物の微粒子が挙げられ
る。かかる有機高分子化合物としては、例えば、ポリス
チレン、スチレンースチレンスルホン酸塩共重合体、メ
タクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリ
ルーブタジエンースチレン共重合体、塩化ビニルーアク
リル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルーアクリレー
ト共重合体等の重合体などが挙げられる。特にこれらの
重合体の微粒子を均一に懸濁したラテックス等が好適に
用いられる。ラテックス粒子の平均粒径は、検体中の抗
原の測定方法、測定濃度又は測定機器等によって適宜選
択されるが、通常０．０５−１．０μｍであり、なかで
も０．０５−０．５μｍが好ましい。上記抗体を上記ラ
テックス粒子に感作させるには、通常の化学結合又は物
理吸着が適用できる。

【０００７】本発明のラテックス免疫比濁測定法におい
ては、測定しようとする抗原を含む検体中とチオグリコ
ール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを混合し、
次いで、検体中の抗原と該抗原に対する抗体を感作させ
たラテックス粒子とを反応させる。ここで用いるチオグ
リコール酸の塩としては、チオグリコール酸ナトリウ
ム、チオグリコール酸カリウムなどが挙げられる。チオ
グリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールの添
加量は、好ましくは、検体１μｌ当たり０．５〜５０μ
ｍoｌ量、更に好ましくは、１〜２５μｍoｌ量である。
このとき検体１μｌに対し、チオグリコール酸もしくは
その塩又はチオグリセロールを含む溶液の添加量は、好
ましくは、１０〜５００μｌ、更に好ましくは、２０〜
２００μｌである。なお、検体１μｌ当たり０．５〜５
０μｍoｌ量あるいは１〜２５μｍoｌ量でＤＴＴ（スレ
オ−１，４−ジメルカプト−２，３−ブタンジオール）
を添加した場合には、検体中の蛋白質の非特異的凝集が
起こりやすいが、本発明で用いるチオグリコール酸もし
くはその塩又はチオグリセロールの場合には、このよう
な添加量でも非特異的凝集は起こりにくい。検体に、チ
オグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを
添加後、数分間撹拌あるいは放置し、その後、抗体を感
作させたラテックス粒子を加えて抗原抗体反応を行う。
反応は、通常トリス緩衝液、へぺス緩衝液などのグッド
緩衝液中でｐＨ４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜
９．０の範囲、０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃の
範囲で行う。反応後、反応液の濁度を、吸光度、散乱光
度、分子数などを測定する光学的測定法により測定す
る。測定波長は、通常２００〜１０００ｎｍの範囲が使
用される。実際の測定には２ポイントアッセイ法などを
適用することができる。得られる実際の光学的測定値か
ら、抗原濃度が既知の標準検体を用いて作成した検量線
に基づいて、検体中の抗原濃度を測定することができ
る。

【０００８】本発明のラテックス免疫比濁測定法により
測定するためのキットは、チオグリコール酸もしくはそ
の塩又はチオグリセロールを必須成分として含む試薬
（第１試薬）、及び検体中の抗原に対する抗体を感作さ
せたラテックス粒子を必須成分として含む試薬（第２試
薬）からなる。第１試薬や第２試薬には、どちらにもト
リス緩衝液、へぺス緩衝液等のグッド緩衝剤が含まれて
いて良い。更に通常測定試薬に添加される添加物、例え
ば、食塩等の塩、防腐剤、ＢＳＡ、デキストラン、香料
等を添加しても良い。

【０００９】

【実施例】以下、実施例に従って本発明を説明するが、
本発明はこれらの実施例によって何等限定されるもので
はない。 実施例１−６及び比較例１−３ Ａ）測定検体 １）ＲＦ添加血清 ＣＲＰ１ｍｇ／ｄｌ、ＲＦ濃度０の血清はＣＲＰ２ｍｇ
／ｄｌ血清と生理食塩水を１対１で混合したものを用い
た。ＣＲＰ濃度１ｍｇ／ｄｌ、ＲＦ濃度１５００ＩＵ／
ｍＬ及び３０００ＩＵ／ｍｌのＲＦ添加血清は、ＣＲＰ
２ｍｇ／ｄｌ血清とＲＦ高値血清を硫安分画し濃縮して
調製したＲＦ濃度が３０００ＩＵ／ｍｌ及び６０００Ｉ
Ｕ／ｍｌのＲＦ高濃度試料を１対１で混合し作成した。 ２）ＣＲＰ高値血清 ３０ｍｇ／ｄｌの濃度の標準液（ＣＲＰ多点検量線用標
準液２ｍｌ×６濃度、ニットーボーメディカル）をその
まま使用した。

【００１０】Ｂ）測定用試薬 １）第１試薬 本発明の実施例の測定には、ＣＲＰ測定用試薬の第１試
薬として表１に示す組成の溶液を調製した。 表１ 実施例 実施例 比較例１ 比較例 １、３、５ ２、４、６ ２、３ ヘペス緩衝液 ２５ｍＭ ２５ｍＭ ２５ｍＭ ２５ｍＭ (pH7.4) ＮａＣｌ ０．１５M ０．１５M ０．１５M ０．１５M チオグリコール ２００ｍＭ − − − 酸ナトリウム チオグリセロール − ２００ｍＭ − −ＤＴＴ − − − ３０ｍM

【００１１】２）第２試薬 抗ヒトＣＲＰヤギ抗体を感作したラテックス粒子を含む
Ｎ−アッセイ ＬＡＣＲＰ−Ｓニットーボー（ニットー
ボーメディカル）のラテックス試薬をそのまま使用し
た。 Ｃ）測定 測定は日立７１５０自動分析装置を使用した。日立７１
５０自動分析装置の３７℃の反応セル中に、検体を３μ
ｌ及び第１試薬１５０ｍｌを入れ、第１試薬の添加５分
後に第２試薬１５０μｌを添加し、５分間、抗原抗体反
応をさせた。そして、装置内の演算機構により２ポイン
トアッセイを行い、検体ブランクを除いた主波長５７０
ｎｍ、副波長８００ｎｍにおける反応前後の吸光度変化
量を測定した。ＣＲＰ既知濃度のキャリブレーターの測
定から得られた標準曲線から、検体中のＣＲＰの濃度を
求めた。

【００１２】測定例１ＲＦ添加試料のＣＲＰ濃度の測定 ＲＦの添加量を変えて、既知のＣＲＰ濃度が正確に測定
できるかどうか検討した。測定結果を表２に示した。 表２ チオール化合物 ＲＦ濃度（ＩＵ／ｍｌ） ０ １５００ ３０００ 実施例 １ チオグリコール酸ナ １．００ １．０２ １．０４ トリウム 実施例２ チオグリセロール １．０１ １．０１ ０．９９ 比較例１ 無添加 １．００ 1．２９ ２．１７ 表２に示した結果から分かるように、ＣＲＰ測定値がＲ
Ｆ濃度０の時のＣＲＰ測定値に近いほどＲＦの影響を受
けていないことから、比較例１に比べ、実施例１と２で
は、殆どＲＦの影響がない。

【００１３】測定例２試薬の安定性（ＲＦ回避能の変化） 日立７１５０自動分析装置の試薬保冷庫に、各組成の第
１試薬を開封したまま放置し、０、２８、５６日目にＣ
ＲＰ１ｍｇ／ｄｌ、ＲＦ３０００ＩＵ／ｍｌのＲＦ高値
血清を測定し、本発明の試薬のＲＦの影響回避能の変化
を検討した。結果を表３に示した。 表３ チオール化合物 保存日数 ０ ２８ ５６ 実施例 ３ チオグリコール酸ナ １．００ １．０５ １．０９ トリウム 実施例４ チオグリセロール １．０１ １．０３ １．０９ 比較例２ ＤＴＴ １．００ １．０５ １．１８

【００１４】表３の結果から分かるように、５６日目で
実施例３、４は、比較例２に比べＲＦの影響が少なく、
比較例２よりＲＦの影響回避能が長期間持続する組成で
あるといえる。 測定例３試薬の安定性（反応性の比較） 測定例２と同様に保存した試薬の０、２８、５６日目の
ＣＲＰ３０ｍｇ／ｄｌの検体を測定し、ＣＲＰに対する
反応性の安定性を比較した。この測定では０日目の標準
曲線を２８，５６日目でも使用し、測定値を算出した。
結果を表４に示した。 表４：ＣＲＰ測定値 チオール化合物 保存日数 ０ ２８ ５６ 実施例５ チオグリコール酸ナ ３０．１５ ３０．４５ ３０．５ トリウム 実施例６ チオグリセロール ３１．０８ ３０．１５ ２９．５２ 比較例２ ＤＴＴ ３１．１７ ３２．４０ ２８．６８

【００１５】表４に示した結果から分かるように、５６
日目で実施例５、６は、比較例３に比べ測定値の低下が
少なく、安定な組成であるといえる。

【００１６】

【発明の効果】以上に詳細に述べた通り、本発明のラテ
ックス免疫比濁測定法により、検体中のＣＲＰなどの抗
原を、検体中のＲＦなどの影響を受けることなく、特異
的に測定することができる。また、本発明のラテックス
免疫比濁測定法用キットは、保存安定性に優れたもので
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 片山 勝博 福島県郡山市富田町字大十内80−21

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体中の抗原を測定するラテックス免疫
   比濁測定法において、検体とチオグリコール酸もしくは
   その塩又はチオグリセロールを混合し、次いで、検体中
   の抗原と該抗原に対する抗体を感作させたラテックス粒
   子とを反応させることを特徴とするラテックス免疫比濁
   測定法。
2. 【請求項２】 検体中の抗原をラテックス免疫比濁測定
   法により測定するためのキットであって、 ｉ）チオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロ
   ールを必須成分として含む試薬、及び ｉｉ）検体中の抗原に対する抗体を感作させたラテック
   ス粒子を必須成分として含む試薬からなるキット。