WO2019208711A1 - 粒子、及びその製造方法 - Google Patents

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WO2019208711A1
WO2019208711A1 PCT/JP2019/017682 JP2019017682W WO2019208711A1 WO 2019208711 A1 WO2019208711 A1 WO 2019208711A1 JP 2019017682 W JP2019017682 W JP 2019017682W WO 2019208711 A1 WO2019208711 A1 WO 2019208711A1
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particle
particles
group
shell structure
dispersion
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PCT/JP2019/017682
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法重 掛川
小林　本和
哲士 山本
佳範 小谷
悟 杉田
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キヤノン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B33/00—Silicon; Compounds thereof
    • C01B33/113—Silicon oxides; Hydrates thereof
    • C01B33/12—Silica; Hydrates thereof, e.g. lepidoic silicic acid
    • C01B33/18—Preparation of finely divided silica neither in sol nor in gel form; After-treatment thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica

Definitions

  • the present invention relates to particles and a method for producing the same.
  • immunoassay In the fields of medicine and clinical examination, it is necessary to detect a minute amount of biological components with high sensitivity from blood or a part of a collected organ in order to investigate the cause of the disease.
  • immunoassay is widely used.
  • One of the immunoassays is the latex agglutination method using antigen-antibody reaction.
  • the latex agglutination method is to detect the antigen in a liquid such as a biological sample, and measure the degree of latex agglutination by mixing a latex carrying an antibody that specifically binds to the antigen and the liquid. This is a method for detecting and quantifying an antigen.
  • an antigen is captured by an antibody bound to latex, and a plurality of latexes are cross-linked through the captured antibody, resulting in aggregation. That is, the amount of antigen in a liquid such as a biological sample can be quantified by evaluating the degree of latex aggregation. The degree of aggregation can be quantified by evaluating a change in the amount of light transmitted or scattered through the liquid sample.
  • the latex agglutination method can perform quantitative evaluation of antigens simply and quickly, but has a problem that it cannot be detected if the amount of antigen in a liquid such as a biological sample is small.
  • latex captures only the target antigen and suppresses non-specific adsorption of other proteins and the like, and increases the adsorption amount of the target antigen.
  • Patent Document 1 proposes a core-shell structure in which a silica layer is provided on the surface of polystyrene particles.
  • the thickness of the silica layer is as large as 40 nm, the specific gravity of the particles is increased, the particles easily settle in the liquid, and measurement by the latex agglutination method is difficult.
  • the present invention has been made in view of such background art, and an object of the present invention is to provide particles in which a silica layer for suppressing non-specific adsorption is formed with a thickness in a predetermined range, and a method for producing the same.
  • the particle according to the present invention is a particle comprising a core structure containing a polymer and a shell structure containing silica, the shell structure having a structure represented by the following formula (1): Particles having a thickness of the shell structure of 3 nm or more and 15 nm or less.
  • R 1 to R 3 is a silica structure, any one is H, and the other one is H or a silica structure;
  • A is any one of SH, NH 2 , COOH, and a glycidyl group.
  • Another particle according to the present invention is a particle comprising a core structure containing a polymer and a shell structure containing silica, the shell structure having a silica structure formed from a trifunctional silane,
  • the silica structure has at least one selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a carboxyl group, and a glycidyl group, and a silanol group, and the thickness of the shell structure is 3 nm or more and 15 nm or less.
  • the particles of the present invention since the silica layer is thinly formed, the sedimentation rate is slow. Moreover, since the silanol group contained in the silica layer formed in the particle contributes to increasing the hydrophilicity of the particle surface, it is considered that the effect of suppressing nonspecific adsorption is high. Therefore, the sensitivity is high when the particles of the present invention are used in the latex agglomeration method.
  • the particles according to this embodiment include a core structure including a polymer and a shell structure including silica.
  • the shell structure has a partial structure represented by the following formula (1).
  • any one of R 1 to R 3 has a silica structure, any one is H, and the remaining one is H or a silica structure.
  • A is any one of * -SH (thiol group), * -NH 2 (amino group), COOH (carboxyl group), and glycidyl group. Note that a part of the silica structure may have * —CH ⁇ CH 2 (vinyl group).
  • * represents a bonding position with Si in the formula (1).
  • an antibody can be bound to A. When an antibody or an antibody having a functional group that reacts with A is bound, a part of the atoms of A is removed.
  • A when A is an amino group, it binds to the carboxyl group of the antibody, but one hydrogen of the amino group is removed to form an amide bond.
  • A when A is a thiol group, it binds to an antibody having a maleimide group, but one hydrogen of the thiol group is removed to form a bond.
  • the shell structure has a silanol group (the structure of Si—O—H in the formula (1)), the hydrophilicity of the particle surface is increased and nonspecific adsorption can be suppressed.
  • the thickness of the shell structure is 3 nm or more and 15 nm or less, the specific gravity of the particles is reduced, and the sedimentation speed can be reduced.
  • the thickness of the shell structure is more preferably 5 nm or more and 10 nm or less.
  • the particles according to this embodiment when used in the latex agglutination method, it is possible to increase the time for capturing the target substance, and after capturing the target substance, the particle aggregate is irradiated with light. Thus, it is possible to increase the time for detecting transmitted light and scattered light.
  • the sedimentation rate of the particles in water can be 3.9 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ m / sec or less. In addition, the sedimentation rate can be 1.1 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ m / second or more.
  • the antigen can be detected with high sensitivity in the latex agglutination method.
  • the target substance is an antigen, antibody, nucleic acid, or the like that can be captured by a ligand described later.
  • the present inventors have found that it is effective to use a trifunctional silane in order to form a shell structure of particles.
  • the structure represented by the above formula (1) can be formed in the shell structure, and the thickness of the shell structure can be in a predetermined range, that is, 3 nm or more and 15 nm.
  • the particle according to the present embodiment includes a core structure including a polymer and a shell structure including silica, and the shell structure has a silica structure formed from trifunctional silane.
  • the silica structure has at least one selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a carboxyl group, and a glycidyl group, and a silanol group, and the thickness of the shell structure is 3 nm or more and 15 nm or less.
  • the silica structure may have a vinyl group.
  • the trifunctional silane is preferably at least one selected from the group consisting of vinyltrimethoxysilane, (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane, and 3-aminopropyltrimethoxysilane.
  • the shell structure has a silica structure formed with trifunctional silane as a main component, but may further have a silica structure formed with tetrafunctional silane. Tetraethoxysilane is exemplified as the tetrafunctional silane.
  • a ligand is bound to any one of a thiol group, an amino group, a carboxyl group, and a glycidyl group.
  • the density of silanol groups in the shell structure is preferably 10 / nm 3 or more.
  • the silanol group is present at a high density of 10 / nm 3 or more, high hydrophilicity can be imparted to the particle surface, and the ability to suppress non-specific adsorption is high.
  • a shell structure has a thiol group and the density of the said thiol group in a shell structure is 0.01 piece / nm ⁇ 2 > or less.
  • the thiol group has a function as a reactive functional group for binding a ligand. However, if it exceeds 0.01 / nm 2 , the hydrophilicity imparted to the particle surface by the silanol group may be insufficient. .
  • the polymer contained in the core structure is not particularly limited, but is preferably at least one selected from the group of styrenes and (meth) acrylates, and more preferably polystyrene and poly (meth) acrylates.
  • the silica structure is a two-dimensional or three-dimensional network structure formed by alternately bonding Si and O.
  • the silica structure may have a partial structure in which H is bonded to O.
  • the dispersion according to this embodiment includes particles and a dispersion medium for dispersing the particles.
  • an antioxidant or the like may be included as appropriate.
  • the average diameter of the particles contained in the dispersion is preferably 100 nm or more and 300 nm or less, and more preferably 150 nm or more and 250 nm or less.
  • the variation coefficient of the particle size distribution of the particles contained in the dispersion is preferably 5% or less, and more preferably 3% or less.
  • the particle according to the present embodiment is a structure having a core particle at the center and a shell covered around the core particle.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an example of particles according to the present embodiment.
  • the core structure 1 in the figure is spherical (also called core particles).
  • the diameter of the core particle 1 is not less than 100 nm and not more than 300 nm, and the variation coefficient of the particle size distribution, that is, the value obtained by dividing the average diameter of the particle by the standard deviation is 5% or less.
  • particles having a diameter of 150 nm to 250 nm and a variation coefficient of 3% or less are used.
  • the material forming the core particle 1 is made of a resin whose main component is polystyrene.
  • the core particle 1 can be obtained by emulsion polymerization using a polystyrene monomer as a main component.
  • divinylbenzene or the like may be added and cross-linked during the synthesis of the core particle.
  • an additive or the like may be added to strictly control the diameter of the core particle 1. Examples of the additive include sodium dodecyl sulfate and sodium parastyrene sulfonate.
  • the shell 2 in FIG. 1 is a layered structure in which the outer periphery of the core particle 1 is uniformly coated.
  • the shell structure 4 includes a shell 2 and a surface layer 3.
  • the shell 2 is in close contact with the core particle 1.
  • the thickness of the shell structure 4 is 3 nm or more and 15 nm or less, and preferably 5 nm or more and 10 nm or less. If the thickness of the shell structure 4 is too thin, the physical properties as a silica layer may not function sufficiently. On the other hand, if the thickness of the shell structure 4 is too thick, the specific gravity of the particles becomes heavy, and it becomes difficult to obtain a stable dispersion state in water, and the sedimentation speed is increased. Since the particles according to the present embodiment have a shell structure 4 with a thickness of 3 nm or more and 15 nm or less, the sedimentation rate can be 4.0 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ m / second or less (in water, temperature 25 degrees).
  • the thickness of the shell structure is determined by observing particles with a STEM or TEM, confirming the contrast difference between the core structure and the shell structure in the observed image, and directly measuring the thickness of the shell structure portion. Is possible.
  • the chemical composition of the core structure and the shell structure can be observed using EDX.
  • the shell 2 can be a structure formed by hydrolyzing a trifunctional silane having a vinyl group.
  • a vinyl group By having a vinyl group, it is possible to obtain a shell 2 having a high affinity with the core particle 1 and a uniform coating thickness. Further, the presence of a silanol group in a part of silica formed by hydrolyzed silane can impart hydrophilicity to the surface of the particle material.
  • the surface layer 3 in FIG. 1 exists as an outer shell of the shell 2.
  • the total thickness of the shell 2 and the surface layer 3 is 3 nm or more and 15 nm or less.
  • the thickness is preferably 5 nm or more and 10 nm or less.
  • the surface layer 3 can be formed mainly by hydrolyzing trifunctional silane. Mainly, trifunctional silane can be used, and then tetrafunctional silane can be used.
  • the surface layer 3 is composed of a silica component containing a thiol group, an amino group, a carboxyl group, or a glycidyl group in addition to a silica component containing a vinyl group or a silanol group.
  • the silica component is made of, for example, trimethyoxyvinylsilane, triethoxyvinylsilane, tetramethylorthosilicate, tetraethylorthosilicate, mercaptopropyltrimethoxysilane, mercaptopropyltriethoxysilane, aminopropyltrimethoxysilane, aminopropyltriethoxysilane, etc. Can be obtained by hydrolysis. It is used as a scaffold for binding an antibody to a thiol group, amino group, carboxyl group, or glycidyl group particle material present in the surface layer 3.
  • the density per unit area of thiol groups and the like present on the surface of the particle material in the present embodiment is preferably 0.01 / nm 2 or less.
  • the number of silanol groups present in the particle material that is, the number of hydroxyl groups present in the shell 2 and the surface layer 3 is more preferably used because the surface of the particle material becomes more hydrophilic.
  • the number of silanol groups per unit volume of the shell 2 or the surface layer 3 of the particulate material is preferably 10 / nm 3 or more.
  • the colloidal liquid in which the particles according to this embodiment are dispersed in an aqueous solvent can be used as an antibody test reagent for latex agglutination.
  • a buffer solution can also be used as the aqueous solvent.
  • a surfactant, preservative, sensitizer, and the like may be added to the aqueous solvent.
  • the method for producing particles having a core-shell structure according to this embodiment includes the following steps.
  • a step of obtaining a solution containing core particles containing a polymer by mixing a monomer having a vinyl group and a radical polymerization initiator (hereinafter sometimes simply referred to as an initiator) (step 1).
  • the solution obtained in step 1 is hydrolyzed by adding a trifunctional silane having a vinyl group.
  • a step of forming a shell structure containing silica on the surface of the core particle to obtain a particle having a core-shell structure step 2.
  • the monomer having a vinyl group is preferably styrene.
  • the trifunctional silane having a vinyl group is preferably at least one selected from the group consisting of vinyltrimethoxysilane, (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane, and 3-aminopropyltrimethoxysilane. .
  • Tetraethoxysilane is exemplified as the tetrafunctional silane.
  • the method for producing particles according to this embodiment includes the following steps [1] to [3].
  • the core particle 1 in FIG. 1 can be obtained by emulsion polymerization of styrene (monomer) in an aqueous solvent.
  • Emulsion polymerization is a step of obtaining particles by adding a styrene monomer and an additive to an aqueous solvent, stirring sufficiently, and then adding a polymerization initiator in a nitrogen atmosphere and heating.
  • a polymerization initiator for emulsion polymerization potassium persulfate, 2,2'-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride, or the like can be used. Additives may be added to adjust the particle size and make the particle size distribution more uniform.
  • sodium parastyrene sulfonate sodium dodecyl sulfate, polyvinyl pyrrolidone, or the like can be used.
  • sodium parastyrene sulfonate that can control the particle size depending on the amount added and that can produce core particles 1 exhibiting high dispersibility in an aqueous solvent can be suitably used.
  • strength of the core particle 1 can be raised by adding divinylbenzene etc. as a crosslinking agent. It can refine
  • the step of forming the shell 2 in FIG. 1 is obtained by hydrolyzing a trifunctional silane containing a vinyl group.
  • a trifunctional silane vinyltrimethoxysilane, vinyltriethoxysilane, or the like can be suitably used.
  • Hydrolysis is performed by introducing trifunctional silane into a liquid in which the core particles 1 are dispersed in a high pH aqueous solvent.
  • the pH in the liquid is preferably 11 or more.
  • the reaction is performed under acidic conditions, the zeta potential of the formed shell 2 becomes low, which may cause aggregation.
  • a uniform shell 2 can be obtained by increasing the hydrolysis rate of the trifunctional silane in a high pH solution and precipitating it on the surface of the core particle 1.
  • the reaction temperature may be controlled between about 0 to 80 degrees depending on the conditions. If the hydrolysis rate is too fast, a solvent such as alcohol may be added. After the reaction, the obtained particulate material can be purified by centrifuging and redispersing the precipitate in a solvent.
  • the surface layer 3 in FIG. 1 can be formed by hydrolyzing trifunctional or tetrafunctional silane.
  • the surface layer 3 is composed of trimethyoxyvinylsilane, triethoxyvinylsilane, tetramethylorthosilicate, tetraethylorthosilicate, mercaptopropyltrimethoxysilane, mercaptopropyltriethoxysilane, aminopropyltrimethoxysilane, aminopropyltriethoxysilane.
  • Etc. can be obtained by performing hydrolysis on the raw material.
  • the formation of the surface layer 3 can be performed when the shell 2 is formed or after the shell 2 is formed.
  • a trifunctional silane containing a vinyl group is added to the dispersion of the core particles 1 at the same time or after several hours to form the surface layer 3.
  • a trifunctional silane containing a vinyl group having a high hydrolysis rate and a high affinity with the core particle 1 is adsorbed to the core particle 1 before forming the surface layer 3 to form the shell 2.
  • the surface layer 3 is formed using the surface of 2 as a scaffold.
  • the shell 2 and the surface layer 3 may be collectively referred to as a shell structure.
  • the particles 5 include the core structure 1 and the shell structure 4.
  • ligands such as various antibodies to the particles of this embodiment, they can be used as specimen test particles for latex agglutination. What is necessary is just to select the optimal method for couple
  • FIG. For example, maleimide can be reacted with a thiol group to bind an antibody.
  • an affinity particle having the particle according to the present embodiment and a ligand bonded to a reactive functional group can be provided.
  • the reactive functional group is A in the above formula (1), and specifically, is SH (thiol), NH 2 (amino group), COOH (carboxyl group), or glycidyl group.
  • the affinity particles may have CH ⁇ CH 2 (vinyl group).
  • the ligand is a compound that specifically binds to a receptor possessed by a specific target substance.
  • the site where the ligand binds to the target substance is determined and has a high affinity selectively or specifically.
  • examples include antigens and antibodies, enzyme proteins and their substrates, signal substances such as hormones and neurotransmitters and their receptors, and nucleic acids, but the ligands in this embodiment are not limited thereto.
  • the nucleic acid include deoxyribonucleic acid.
  • the affinity particles in the present embodiment have a high affinity (affinity) selectively or specifically for the target substance.
  • the ligand in the present embodiment is preferably any one of an antibody, an antigen, and a nucleic acid.
  • a conventionally known method can be applied to the chemical reaction method for chemically bonding the reactive functional group of the particle according to the present embodiment and the ligand to the extent that the object of the present invention can be achieved. it can.
  • a catalyst such as 1- [3- (dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide] can be appropriately used.
  • the affinity particle in this embodiment uses an antibody (antigen) as a ligand and an antigen (antibody) as a target substance, it can be preferably applied to an immunolatex agglutination measurement method widely used in areas such as clinical examination and biochemical research. .
  • the test reagent for in-vitro diagnosis in this embodiment that is, the test reagent for use in detecting a target substance in a specimen by in-vitro diagnosis has affinity particles according to this embodiment and a dispersion medium for dispersing the affinity particles.
  • the amount of the affinity particles according to this embodiment contained in the reagent in this embodiment is preferably 0.001% by mass to 20% by mass, and more preferably 0.01% by mass to 10% by mass.
  • the reagent according to the present embodiment may contain a third substance such as a solvent or a blocking agent in addition to the affinity particles according to the present embodiment as long as the object of the present invention can be achieved. Third substances such as solvents and blocking agents may be included in combination of two or more.
  • Examples of the solvent used in the present embodiment include various buffer solutions such as a phosphate buffer solution, a glycine buffer solution, a Good buffer solution, a Tris buffer solution, and an ammonia buffer solution, and are included in the reagent in the present embodiment.
  • the solvent is not limited to these.
  • an antibody or an antigen When used for detection of an antigen or an antibody in a specimen by a latex agglutination method, an antibody or an antigen can be used as a ligand.
  • a test kit for use in detecting a target substance in a specimen by in-vitro diagnosis includes the reagent and a housing that contains the reagent.
  • the kit according to this embodiment may contain a sensitizer for measuring latex aggregation.
  • the sensitizer for measuring latex agglutination include polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyalginic acid and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the kit according to the present embodiment may include a positive control, a negative control, a serum diluent, and the like.
  • a solvent other than serum and physiological saline containing no measurable target substance may be used as a medium for positive control and negative control.
  • the kit according to the present embodiment can be used in the method for detecting a target substance according to the present embodiment in the same manner as a kit for use in detecting a target substance in a specimen by normal in vitro diagnosis. Further, the concentration of the target substance can be measured by a conventionally known method, and it is particularly suitable for use in detecting the target substance in the specimen by the latex agglutination method.
  • the method for detecting a target substance in a specimen by in-vitro diagnosis according to the present embodiment includes a step of mixing the affinity particles according to the present embodiment and a specimen that may contain the target substance.
  • the mixing of the affinity particles and the specimen according to the present embodiment is preferably performed in the range of pH 3.0 to pH 11.0.
  • the mixing temperature is in the range of 20 ° C. to 50 ° C.
  • the mixing time is in the range of 1 minute to 20 minutes.
  • this detection method uses a solvent.
  • the concentration of the affinity particles according to this embodiment in the detection method according to this embodiment is preferably 0.001% by mass to 5% by mass, more preferably 0.01% by mass to 1% by mass in the reaction system.
  • the detection method according to this embodiment optically detects an agglutination reaction that occurs as a result of mixing the affinity particles according to this embodiment and the specimen, that is, can detect a target substance in the specimen by a latex agglutination method. preferable. Specifically, at least one of a step of mixing a sample with a test reagent to obtain a mixture, a step of irradiating the mixture with light, and a transmitted light or a scattered light of the light irradiated on the mixture A step of detecting. By optically detecting the agglutination reaction occurring in the mixed solution, the target substance in the specimen can be detected, and the concentration of the target substance can also be measured. As a method for optically detecting the agglutination reaction, the amount of change in these values may be measured using an optical instrument capable of detecting scattered light intensity, transmitted light intensity, absorbance, and the like.
  • core particle 1 particles constituting core structure 1 of particle 5
  • core particle 1 was prepared by an emulsion polymerization method. Specifically, pure water, styrene (monomer), and sodium parastyrene sulfonate were added to a round bottomed four-necked separable flask, and stirred for 30 minutes while bubbling nitrogen using a mechanical stirrer. Next, after heating the sample to 70 ° C. with the oil bath stirred, catalyst potassium persulfate was added, and styrene polymerization reaction was performed in a nitrogen atmosphere for 8 hours.
  • the precipitate was collected by centrifugation, and the product was washed with pure water.
  • the sample obtained by washing was dispersed in pure water to obtain a suspension of core particles 1.
  • the diameter was 210 nm, and the variation coefficient of the particle size distribution was 3%.
  • the roughness of the particle surface was observed by sensory evaluation from the obtained electron microscope image. It was visually determined whether the surface roughness was larger than the combined thickness of the shell 2 and the surface layer 3 (the thickness of the core structure). The judgment results are shown in Table 1 as A or B.
  • A is the case where the thickness of the core structure is equal to or smaller than the size of the roughness (projection structure on the particle surface)
  • B is the case where the size of the roughness (projection structure on the particle surface) is larger than the thickness of the core structure. Represents.
  • the physical properties of the surface layer 3 of the particle indicate that the influence of the silanol group is dominant. If the influence of the silanol group is dominant, it can be said that sufficient hydrophilicity is imparted to the particles and the ability to suppress nonspecific adsorption is high.
  • the particles that cause agglomeration are particles in which the influence of silanol groups present in the surface layer 3 is dominant, and can be determined to be coated with a silica layer.
  • the particles that do not aggregate can be determined to be particles that retain the influence of the sulfonic acid present on the polystyrene particle surface.
  • the standard sample and the sample to be evaluated for the density of the silanol group were sealed in quartz glass having an optical path length of 1 cm and measured by a transmission spectrum.
  • the measurement sample was obtained by drying a particle dispersion having a concentration of 0.1 wt% to 4 mL and then dispersing it in chloroform.
  • the density of silanol groups was calculated as the number of silanol groups per unit volume of the shell 2 and the surface layer 3.
  • the sedimentation rate of particles in the suspension was evaluated using a Lumisizer (Luftizer: Lumisizer 612). The concentration of the sample solution was adjusted to 0.1 wt%. 100 points were measured at a temperature of 25 ° C., a rotation speed of 4000 rpm, and a measurement interval of 40 seconds. The resulting sedimentation speed was divided by the relative centrifugal force to calculate the natural sedimentation speed ( ⁇ m / second).
  • Example 1 0.26 mL of the slurry (42.5 wt%) of the core particle 1 produced by the above methods (1) and (2) was added to 26.3 mL of pure water. Further, 1.32 mL of aqueous ammonia was added to the obtained solution to adjust pH to prepare a suspension. After stirring the prepared suspension for 30 minutes, 0.099 mL of vinyltrimethoxysilane and 0.001 mL of mercaptopropyltrimethoxysilane were added to the solution obtained by stirring, and the mixture was further stirred for 10 hours. After stirring, the suspension was centrifuged and redispersed in pure water to obtain a dispersion having a pH of about 7. The concentration of the obtained dispersion was adjusted to 0.1 wt% to obtain a product.
  • Example 2 0.78 mL of the slurry (42.5 wt%) of core particle 1 prepared in 78.9 mL of pure water was added, and 3.96 mL of aqueous ammonia was added to adjust pH to prepare a suspension. After stirring the prepared suspension for 30 minutes, 0.52 mL of vinyltrimethoxysilane and 0.0053 mL of mercaptopropyltrimethoxysilane were added and further stirred for 10 hours. After stirring, the suspension was centrifuged and redispersed in pure water to obtain a dispersion having a pH of about 7. The concentration of the obtained dispersion was adjusted to 0.1 wt% to obtain a product.
  • Example 3 0.26 mL of the slurry (42.5 wt%) of core particle 1 prepared in 26.3 mL of pure water was added, and 1.32 mL of aqueous ammonia was added to adjust pH to prepare a suspension. After stirring the prepared suspension for 30 minutes, 0.1 mL of vinyltrimethoxysilane and 0.1 mL of tetraethylorthosilicate were added and further stirred for 10 hours. After stirring, the suspension was centrifuged and redispersed in pure water to obtain a dispersion having a pH of about 7. The concentration of the obtained dispersion was adjusted to 0.1 wt% to obtain a product.
  • Example 1 Test for evaluating the ability to suppress nonspecific adsorption The sample of Example 1 was used to evaluate the ability to suppress nonspecific adsorption.
  • the prepared 0.1 wt% particle suspension 2.5 mL was centrifuged, and the resulting precipitate was redispersed in 1.0 mL of 25 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride.
  • Human normal serum was added to the resulting suspension, and the sample was evaluated with a specimen test system (Toshiba Medical: TBA-120FR). The wavelength of the detection light was evaluated at 570 nm. For comparison, polystyrene particles (particle size 200 nm) without a shell were also measured in the same manner. The normal human serum was examined using 16 samples.
  • Table 1 shows the structures and physical properties of the particle materials of Examples and Comparative Examples.
  • VMTS and MPTMS described in the raw material contained in the shell 2 and the raw material of the surface layer 3 represent vinyltrimethoxysilane and mercaptopropyltrimethoxysilane, respectively.
  • TEOS and APTMS represent tetraethylorthosilicate and aminopropyltrimethoxysilane.
  • the thickness of the silica layer indicates the total thickness of the shell 2 and the surface layer 3, that is, the thickness of the shell structure.
  • the components constituting the particles including the core structure are all silica, and there is no shell layer.
  • the raw material of the surface layer 3 is unknown, but a thiol group is present.
  • Comparative Example 4 When the produced material was observed with an electron microscope, a uniform particle surface was formed except for Comparative Example 4.
  • the surface of the particles of Comparative Example 4 was in a state where hemispherical particles of 20 to 30 nm adhered to the surface, and large irregularities (roughness) were confirmed.
  • the coefficient of variation was about 2% except for Comparative Examples 4 and 6, and it was confirmed that the particle size distribution was uniform.
  • the variation coefficient of the particles of Comparative Example 6 was 13.7%. Further, Comparative Example 4 aggregated and settled even when left still overnight. Therefore, it is considered that the particle material of Comparative Example 4 is not suitable for antibody test particles for latex aggregation.
  • the zeta potential of Comparative Examples 2 and 3 was measured and found to be about -40 mV, and it was confirmed that the influence of the sulfonic acid present on the surface of the core particle 1 was dominant.
  • the comparative example 1 which does not have the shell 2 and contains only the polystyrene core particles also showed the same tendency as the comparative examples 2 and 3.
  • Comparative Examples 1, 2, and 3 are materials whose surface properties are not affected by or have a small effect on silanol groups, it was shown that there is a correlation between the density of silanol groups and the physical properties of the surface.
  • Comparative Example 4 the particle size was unspecified, and the density of silanol groups could not be measured because of aggregation.
  • Comparative Example 6 since the entire particle is silica, it is difficult to obtain an accurate silanol group value, but it was confirmed that the silanol group is dominant in the surface properties.
  • Comparative Examples 2 and 3 having a thin silica layer and Example 1 were stable suspensions having a sedimentation rate almost in the same order as Comparative Example 1.
  • Examples 2 and 3 are also 3.2 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ m / sec and 2.9 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ m / sec, respectively, which is about 3 times that of Comparative Example 1, but allowed to stand at room temperature for 4 weeks or more. It was a stable suspension.
  • Comparative Example 5 the sedimentation rate was 4.3 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ m / second, and some precipitate was confirmed after standing at room temperature for 4 weeks. Further, in Comparative Example 6, the sedimentation rate was 2.1 ⁇ 10 ⁇ 2 ⁇ m / sec, and it was confirmed that it was 10 times faster than Comparative Example 1. In Comparative Example 6, it was confirmed that precipitation occurred after standing for about 2 days.
  • the change in intensity of the detection light due to the change in diameter of the particles prepared in Example 1 was smaller than that of polystyrene particles not coated on the surface.
  • the change in the intensity of the detection light occurring 10 minutes after the reaction with the antigen was 101 to 102%, confirming that no self-aggregation occurred.
  • the particulate material according to this example is a material having both surface characteristics having non-specific adsorption ability and physical properties that do not easily settle.
  • the sedimentation rate of the particles can be slowed when the thickness of the shell structure is 3 nm or more and 15 nm or less. Further, in the particles according to this example, the silanol group on the particle surface can impart sufficient hydrophilicity to the particles, and it is considered that the ability to suppress nonspecific adsorption is high.
  • the particles according to this example when used, it is possible to provide specimen test particles for latex agglutination method with high detection sensitivity. In particular, since it is excellent in the effect of reducing the noise of the detection signal, it is suitable for detecting a low concentration antigen. Further, since non-specific adsorption can be suppressed, it can be used as specimen test particles other than the latex agglutination method.

Abstract

粒子は、ポリマーを含むコア構造と、シリカを含むシェル構造と、を含み構成される粒子であって、シェル構造は、下記式（１）で示されるシラノール基を有する構造を有し、シェル構造の厚さが３ｎｍ以上１５ｎｍ以下であることを特徴とする。

Description

粒子、及びその製造方法
　本発明は、粒子、及びその製造方法に関する。
　医学、臨床検査の分野において、血液や採取された臓器の一部などから微量な生体成分を高感度で検出することは、病気の原因を追究するために必要である。生体成分の検出手法の中でも、免疫分析は広く利用されている。免疫分析の一つに、抗原抗体反応を利用したラテックス凝集法がある。ラテックス凝集法とは、生体試料等の液体中の抗原を検出する場合、抗原に特異的に結合する抗体などを担持させたラテックスと、液体とを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原の検出や定量を行う方法である。
　ラテックス凝集法では、抗原がラテックスに結合した抗体に捕捉され、捕捉された抗体を介して複数のラテックスが架橋し、その結果、凝集が起きる。つまり、生体試料等の液体中の抗原の量は、ラテックスの凝集の程度を評価することで定量できる。凝集の程度は、液体試料を透過、あるいは散乱する光の量の変化を評価することで定量できる。
　ラテックス凝集法は、簡便かつ迅速に、抗原の定量評価ができる一方、生体試料などの液体中における抗原の量が少ないと、検出できないという課題があった。
　検出感度を向上させるためには、ラテックスが目的の抗原のみを補捉し、他のタンパク質などの非特異吸着を抑制する事や、目的の抗原の吸着量を大きくする事が挙げられる。あるいは、ラテックスの凝集時において、直ぐに沈降しにくい安定な凝集体を作製する事などが挙げられる。
　ラテックスへのタンパク質の非特異吸着を抑制する方法として、ラテックス粒子の表面を親水化することが効果的であると考えられている。基本的にタンパク質は疎水的な性質が強いものが多いので、ラテックスの表面を強い電荷を帯びずに親水化することにより、非特異吸着は抑制できると考えられている。このような考え方に沿って、ラテックス、例えばポリスチレン粒子の表面にシリカ層をコートする試みがなされている（特許文献１）。
　特許文献１では、ポリスチレン粒子の表面にシリカ層を付与したコア－シェル構造体が提案されている。しかし、シリカ層の厚みが４０ｎｍという大きな厚みであるため、粒子の比重が大きくなり、液体中で容易に沈降し、ラテックス凝集法による測定が難しい。
特開平６－１４２４９１号公報
　本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、非特異吸着を抑制するためのシリカ層が所定範囲の厚さで形成された粒子、及びその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明に係る粒子は、ポリマーを含むコア構造と、シリカを含むシェル構造と、を含み構成される粒子であって、前記シェル構造は、下記式（１）で示される構造を有し、
　前記シェル構造の厚さが３ｎｍ以上１５ｎｍ以下である粒子。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　上記式（１）において、
　Ｒ１乃至Ｒ３のうち、いずれか１つはシリカ構造であり、いずれか１つはＨであり、残りの１つは、Ｈ、又はシリカ構造であり、
　Ａは、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、グリシジル基のいずれかである。
　別の本発明に係る粒子は、ポリマーを含むコア構造と、シリカを含むシェル構造と、を含み構成される粒子であって、前記シェル構造は、３官能シランから形成したシリカ構造を有し、前記シリカ構造は、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、及びグリシジル基で構成する群から選択される少なくとも１種と、シラノール基とを有し、前記シェル構造の厚さが３ｎｍ以上１５ｎｍ以下である。
　本発明の粒子によれば、シリカ層が薄く形成されているため、沈降速度が遅い。また、粒子に形成されたシリカ層に含まれるシラノール基が、粒子表面の親水性を高くすることに寄与するため、非特異吸着を抑制する効果が高いと考えられる。そのため、本発明の粒子をラテックス凝集法で用いる場合に感度が高い。
本発明の実施形態に係る粒子の構造を説明するための図である。
　以下、本発明の好適な実施形態について、詳細に説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
（粒子）
　本実施形態に係る粒子は、ポリマーを含むコア構造と、シリカを含むシェル構造と、を含み構成される。シェル構造は、下記式（１）で示される部分構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記式（１）において、Ｒ１乃至Ｒ３のうち、いずれか１つはシリカ構造であり、いずれか１つはＨであり、残りの１つは、Ｈ、又はシリカ構造である。Ａは、＊－ＳＨ（チオール基）、＊－ＮＨ２（アミノ基）、ＣＯＯＨ（カルボキシル基）、グリシジル基のいずれかである。なお、シリカ構造の一部は、＊－ＣＨ＝ＣＨ２（ビニル基）を有していても良い。ここで、＊は式（１）のＳｉとの結合位置を表す。上記式（１）において上記Ａに抗体を結合させることができる。抗体や、Ａと反応する官能基を有する抗体を結合させた場合、上記Ａの一部の原子が外れる。例えば、Ａがアミノ基の場合、抗体のもつカルボキシル基と結合するが、アミノ基のうちの水素が１つ外れ、アミド結合を形成する。また、Ａがチオール基の場合、マレイミド基を有する抗体と結合するが、チオール基の水素が１つはずれて、結合を形成する。
　このように、シェル構造がシラノール基（式（１）においてＳｉ－Ｏ－Ｈの構造）を有するため、粒子表面の親水性が高まり、非特異吸着を抑制できる。
　また、シェル構造の厚さが３ｎｍ以上１５ｎｍ以下であることで粒子の比重が小さくなり、沈降速度を遅くすることができる。なお、シェル構造の厚さが５ｎｍ以上１０ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
　その結果、本実施形態に係る粒子をラテックス凝集法で用いる場合、標的物質を捕捉するための時間を多くすることができ、また、標的物質を捕捉した後に、粒子の凝集体に光を照射してその光の透過光や散乱光を検出するための時間を多くすることができる。例えば、粒子の水中での沈降速度が３．９×１０－３μｍ／秒以下とすることができる。また、沈降速度を１．１×１０－３μｍ／秒以上とすることができる。結果的に、ラテックス凝集法において、抗原を感度良く検出することができる。なお、上記標的物質は後述するリガンドで捕捉することのできる、抗原、抗体、核酸などである。
　また、本発明者らは、粒子のシェル構造を形成するために３官能シランを用いることが有効だということを見出した。３官能シランを用いることにより、シェル構造に上記式（１）で示される構造を形成し、シェル構造の厚さが所定範囲の厚さ、すなわち３ｎｍ以上１５ｎｍとすることができる。
　すなわち、本実施形態に係る粒子は、ポリマーを含むコア構造と、シリカを含むシェル構造と、を含み構成され、シェル構造は、３官能シランから形成したシリカ構造を有する。そして、シリカ構造は、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、及びグリシジル基で構成する群から選択される少なくとも１種と、シラノール基とを有し、シェル構造の厚さが３ｎｍ以上１５ｎｍ以下である。シリカ構造はビニル基を有していていも良い。
　３官能のシランは、ビニルトリメトキシシラン、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、３－アミノプロピルトリメトキシシランで構成する群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。また、シェル構造は、主成分として３官能シランで形成したシリカ構造を有するが、さらに４官能のシランから形成したシリカ構造を有していても良い。４官能シランとして、テトラエトキシシランが例示される。本実施形態に係る粒子をラテックス凝集法に用いる場合は、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、及びグリシジル基のいずれかにリガンドを結合させる。
　本実施形態において、シェル構造におけるシラノール基の密度は、１０個／ｎｍ３以上であることが好ましい。シラノール基が１０個／ｎｍ３以上、という高密度で存在すると、粒子表面に高い親水性を付与でき、非特異吸着を抑制する能力が高い。
　また、シェル構造がチオール基を有し、シェル構造における上記チオール基の密度が０．０１個／ｎｍ２以下であることが好ましい。チオール基はリガンドを結合するための反応性官能基としての機能を有するが、０．０１個／ｎｍ２より多いと、シラノール基が粒子表面に付与する親水性が不十分になる可能性がある。
　コア構造に含まれるポリマーは特に限定されないが、スチレン類、（メタ）アクリレート類の群から選択される少なくとも一種であることが好ましく、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレートがより好ましい。
　本実施形態において、シリカ構造とは、ＳｉとＯが交互に結合することで２次元状、又は３次元状にネットワーク構造をなしたものである。シリカ構造は、ＯにＨが結合した部分構造を有していても良い。
（分散液）
　本実施形態に係る分散液は粒子と、粒子を分散させる分散媒とを有する。また適宜、酸化防止剤、等が含まれていても良い。本実施形態において、分散液に含まれる粒子の平均直径が、１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましく、１５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下であることがさらに好ましい。本実施形態において、分散液に含まれる粒子の粒度分布の変動係数が５％以下であることが好ましく、３％以下であることがさらに好ましい。
（粒子の詳細な説明）
　本実施形態に係る粒子の一例について図を用いて詳細に説明する。
　本実施形態に係る粒子は、中心にコア粒子があり、その周囲にシェルを被覆して形成している構造体である。図１は本実施形態に係る粒子の一例を示す概略図である。図中のコア構造１は球状（コア粒子と呼ぶこともできる）である。コア粒子１の直径は１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下であり、粒度分布の変動係数、つまり粒子の平均直径を標準偏差で割った数値が５％以下である。好適には、直径１５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下、変動係数が３％以下の粒子が用いられる。
（コア構造、コア粒子）
　コア粒子１を形成する材料はポリスチレンを主成分とする樹脂より構成されている。コア粒子１はポリスチレンモノマーを主成分として乳化重合することで得ることができる。コア粒子１の強度を向上させるために、コア粒子の合成時にジビニルベンゼンなどを加えて架橋しても良い。また、コア粒子１の直径を厳密に制御するために添加剤などを加えても良い。上記添加剤はドデシル硫酸ナトリウムやパラスチレンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。
（シェル構造）
　図１におけるシェル２はコア粒子１の外周を均一に被覆した層状の構造体である。シェル構造４は、シェル２と表面層３とを含み構成される。シェル２はコア粒子１に密着している。シェル構造４の厚さは３ｎｍ以上１５ｎｍ以下であり、５ｎｍ以上１０ｎｍ以下が好ましい。シェル構造４の厚さは薄すぎると、シリカ層としての物性が十分に機能しないことがある。一方、シェル構造４の厚さが厚すぎると、粒子の比重が重くなり、水中で安定な分散状態を得ることが難しくなり沈降速度が速くなる。本実施形態に係る粒子はシェル構造４の厚さが３ｎｍ以上１５ｎｍ以下であるため、沈降速度が、４．０×１０－３μｍ／秒以下とすることができる（水中、温度２５度）。
　なお、本実施形態において、シェル構造の厚さは、ＳＴＥＭ、あるいはＴＥＭで粒子を観察して、観察した像においてコア構造とシェル構造のコントラスト差を確認し、シェル構造部分の厚さを直接計測することが可能である。また、コア構造、及びシェル構造の化学組成はＥＤＸを用いて観察することが可能である。
（シェル２）
　シェル２はビニル基を有する３官能のシランを加水分解することで形成した構造体を用いることができる。ビニル基を有することでコア粒子１との親和性が高く、被覆する厚さが均一なシェル２を得ることができる。また加水分解したシランによって形成するシリカの一部にシラノール基が存在することで、粒子材料の表面に親水性を付与することができる。
（表面層３）
　図１における表面層３は、シェル２の外殻として存在する。シェル２と表面層３を合わせた層の厚さは３ｎｍ以上１５ｎｍ以下である。好適には５ｎｍ以上１０ｎｍ以下の厚さで用いられる。表面層３は、主に、３官能のシランを加水分解することで形成できる。主に、３官能のシランを用いた上で、４官能のシランを用いることが出来る。表面層３は、ビニル基やシラノール基を含むシリカ成分に加えて、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、又はグリシジル基を含むシリカ成分で構成されている。上記シリカ成分は例えば、トリメチトキシビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、テトラメチルオルソシリケート、テトラエチルオルソシリケート、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどを原料に加水分解を行うことで得ることができる。表面層３に存在するチオール基、アミノ基、カルボキシル基、又はグリシジル基粒子材料に抗体を結合するための足場として利用する。表面層３に存在するチオール基等の量は多すぎるとリガンドが多く結合しすぎて、粒子材料の親水性が損なわれるおそれがある。具体的には本実施形態における粒子材料の表面に存在するチオール基等の単位面積あたりの密度が０．０１個／ｎｍ２以下である事が好ましい。
（シラノール基）
　本実施形態における粒子材料に存在するシラノール基の数、すなわちシェル２及び表面層３に存在する水酸基の数は多い方がより粒子材料の表面が親水性になるため好適に用いることができる。具体的には粒子材料のシェル２あるいは表面層３の単位体積当たりにおけるシラノール基の数が１０個／ｎｍ３以上である事が好ましい。
　本実施形態に係る粒子を用いると、水溶媒への分散性が高く、かつ、沈降も少ないコロイド液を得ることができる。したがって、本実施形態に係る粒子を水溶媒に分散したコロイド液はラテックス凝集法用の抗体検査試薬として利用する事ができる。水溶媒には、緩衝液を用いる事も可能である。また、本実施形態にかかる粒子を分散した液の安定性を増すために、水溶媒中に、界面活性剤、防腐剤や増感剤なども添加してもよい。
（粒子の製造方法）
　本実施形態に係る、コア－シェル構造を有する粒子の製造方法は、以下の各工程を有する。
　ビニル基を有するモノマーと、ラジカル重合開始剤（以下、単に開始剤と呼ぶことがある）とを混合することで、ポリマーを含むコア粒子を含む溶液を得る工程（工程１）。
　工程１で得た溶液に、ビニル基を有する３官能のシランを添加して加水分解する。それにより、コア粒子の表面にシリカを含むシェル構造を形成し、コア－シェル構造を有する粒子を得る工程（工程２）。
　なお、ビニル基を有するモノマーがスチレンであることが好ましい。また、ビニル基を有する３官能のシランが、ビニルトリメトキシシラン、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、３－アミノプロピルトリメトキシシランで構成する群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
　なお、工程２において、さらに４官能のシランを添加する工程を有していてもよい。４官能のシランとして、テトラエトキシシランが例示される。
　次に、本実施形態に係る粒子の製造方法の一例について詳細に説明する。ただし、発明の範囲を限定するものではない。本実施形態に係る粒子の製造方法は以下の［１］～［３］の工程を有する。
［１］少なくともスチレン、スルホン酸基を有する化合物、開始剤を含む乳化分散液からポリスチレン粒子の分散液を製造する工程。
［２］表面にスルホン酸を有したポリスチレン粒子をｐＨ１１以上のアルカリ性の水に分散させる工程。
［３］ビニル基を有する３官能のシランを添加し、メルカプト基を有する３官能シランあるいは４官能のシランを同時、あるいは上記ビニル基を有する３官能シランの後から添加する工程。
　図１中におけるコア粒子１はスチレン（モノマー）を水溶媒中で乳化重合することで得ることができる。乳化重合は、スチレンモノマー及び添加剤を水溶媒に加え、充分に撹拌した後、窒素雰囲気化で重合開始剤を加えて加熱することで粒子を得る工程である。乳化重合の開始剤には過硫酸カリウムや２、２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）ニ塩酸塩などを用いる事ができる。粒子サイズの調整や、粒度分布をより揃えるために添加剤を加えても良い。具体的にはパラスチレンスルホン酸ナトリウムやドデシル硫酸ナトリム、ポリビニルピロリドンなどを用いる事ができる。界面活性剤を用いずに、添加量によって粒子サイズが制御でき、さらに水溶媒中で高い分散性を示すコア粒子１を作製できるパラスチレンスルホン酸ナトリウムを好適に用いる事ができる。また架橋剤としてジビニルベンゼンなどを加えることでコア粒子１の強度を上げることができる。乳化重合で得たコア粒子１を遠心分離し、沈殿物を溶媒に再分散することで精製することができる。
　図１中におけるシェル２を形成する工程は、ビニル基を含む３官能のシランを加水分解することで得られる。３官能のシランはビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシランなどを好適に用いる事ができる。コア粒子１を高ｐＨの水溶媒に分散した液に３官能のシランを導入し加水分解を行う。液中のｐＨは１１以上であることが好ましい。酸性条件下で行うと、形成したシェル２のゼータ電位が低くなり、凝集する可能性がある。高いｐＨの液中で３官能のシランの加水分解の速度を上げてコア粒子１の表面に析出するようにすると、均一なシェル２を得ることができる。この時、反応温度を条件に応じて０度～８０度程度の間で制御するとよい。また、加水分解の速度が速すぎる場合は、アルコールなどの溶媒を添加しても良い。反応後、得られた粒子材料を遠心分離し、沈殿物を溶媒に再分散することで精製することができる。
　図１における表面層３は、３官能あるいは４官能のシランを加水分解することで形成できる。具体的には、表面層３はトリメチトキシビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、テトラメチルオルソシリケート、テトラエチルオルソシリケート、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどを原料に加水分解を行うことで得ることができる。表面層３の形成のタイミングは、シェル２の形成時、乃至シェル２の形成後に行うことができる。具体的にはシェル２を形成するためにビニル基を含む３官能のシランをコア粒子１の分散液に投入すると同時、あるいは数時間後に添加し表面層３を形成する。加水分解が早く、コア粒子１との親和性が高いビニル基を含む３官能のシランは、表面層３を形成する物質よりも先にコア粒子１に吸着し、シェル２を形成した後、シェル２の表面を足場として表面層３が形成する。シェル２と表面層３とを合わせてシェル構造と呼ぶこともできる。このように、コア構造１とシェル構造４を含み構成されるのが粒子５である。
　本実施形態の粒子に各種の抗体等のリガンドを結合させることで、ラテックス凝集法用の検体検査粒子として利用することができる。表面層３に存在する官能基を利用して目的の抗体を結合させるための最適な手法を選択すればよい。たとえばチオール基にはマレイミドを反応させて抗体を結合させることができる。
（リガンド・アフィニティー粒子）
　本実施形態では、本実施形態に係る粒子と、反応性官能基に結合したリガンドとを有するアフィニティー粒子を提供できる。反応性官能基は、上記式（１）のＡであり、具体的には、ＳＨ（チオール記）、ＮＨ２（アミノ基）、ＣＯＯＨ（カルボキシル基）、グリシジル基のいずれかである。なお、アフィニティー粒子は、ＣＨ＝ＣＨ２（ビニル基）を有していてもよい。
　本実施形態において、リガンドとは、特定の標的物質が有する受容体に特異的に結合する化合物のことである。リガンドが標的物質と結合する部位は決まっており、選択的又は特異的に高い親和性を有する。例えば、抗原と抗体、酵素タンパク質とその基質、ホルモンや神経伝達物質などのシグナル物質とその受容体、核酸などが例示されるが、本実施形態におけるリガンドはこれらに限定されない。核酸としてはデオキシリボ核酸等が挙げられる。本実施形態におけるアフィニティー粒子とは、標的物質に対して選択的又は特異的に高い親和性（アフィニティー）を有する。本実施形態におけるリガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることが好ましい。
　本実施形態において、本実施形態に係る粒子が有する反応性官能基とリガンドとを化学結合する化学反応の方法は、本発明の目的を達成可能な範囲において、従来公知の方法を適用することができる。また、リガンドをアミド結合させる場合は、１－［３－（ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド］等の触媒を適宜用いることができる。
　本実施形態におけるアフィニティー粒子が、リガンドとして抗体（抗原）、標的物質として抗原（抗体）を用いる場合、臨床検査、生化学研究等の領域において広く活用されている免疫ラテックス凝集測定法に好ましく適用できる。
（体外診断用の検査試薬）
　本実施形態における体外診断用の検査試薬、すなわち体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための検査試薬は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と、アフィニティー粒子を分散させる分散媒を有する。本実施形態における試薬中に含有される本実施形態に係るアフィニティー粒子の量は、０．００１質量％から２０質量％が好ましく、０．０１質量％から１０質量％がより好ましい。本実施形態に係る試薬は、本発明の目的を達成可能な範囲において、本実施形態に係るアフィニティー粒子の他に、溶剤やブロッキング剤などの第三物質を含んでも良い。溶剤やブロッキング剤などの第三物質は２種類以上を組み合わせて含んでも良い。本実施形態において用いる溶剤の例としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩衝液などの各種緩衝液が例示されるが、本実施形態における試薬に含まれる溶剤はこれらに限定されない。
　ラテックス凝集法による検体中の抗原又は抗体の検出に用いる場合は、リガンドは、抗体又は抗原を用いることができる。
（検査キット）
　本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための検査キットは、上記試薬と、上記試薬を内包する筐体とを有する。本実施形態に係るキットとしては、ラテックス凝集測定用増感剤を含有させても良い。ラテックス凝集測定用増感剤として、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアルギン酸等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。また、本実施形態に係るキットは、陽性コントロール、陰性コントロール、血清希釈液等を備えていても良い。陽性コントロール、陰性コントロールの媒体として、測定しうる標的物質が含まれていない血清、生理食塩水の他、溶剤を用いても良い。本実施形態に係るキットは、通常の体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるためのキットと同様にして、本実施形態に係る標的物質の検出方法に使用できる。また、従来公知の方法によって標的物質の濃度も測定することができ、特に、ラテックス凝集法による検体中の標的物質の検出に用いることが好適である。
（検出方法）
　本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出方法は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と、標的物質を含む可能性のある検体とを混合する工程を有する。また、本実施形態に係るアフィニティー粒子と検体との混合は、ｐＨ３．０からｐＨ１１．０の範囲で行われることが好ましい。また、混合温度は２０℃から５０℃の範囲であり、混合時間は１分から２０分の範囲である。また、本検出方法は、溶剤を使用することが好ましい。また、本実施形態に係る検出方法における本実施形態に係るアフィニティー粒子の濃度は、反応系中、好ましくは０．００１質量％から５質量％、より好ましくは０．０１質量％から１質量％である。本実施形態に係る検出方法は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と検体との混合の結果として生じる凝集反応を光学的に検出すること、すなわちラテックス凝集法により検体中の標的物質を検出することが好ましい。具体的には、検査試薬に、検体を混合して混合液を得る工程と、混合液に、光を照射する工程と、混合液に照射された光の、透過光又は散乱光の少なくともいずれかを検出する工程を有する。混合液において生じる上記凝集反応を光学的に検出することで、検体中の標的物質が検出され、更に標的物質の濃度も測定することができる。上記凝集反応を光学的に検出する方法としては、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出可能な光学機器を用いて、これらの値の変化量を測定すれば良い。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
（１）コア粒子１（粒子５のコア構造１を構成する粒子）の作製
　本実施例では、乳化重合法によってコア粒子１を作製した。具体的には、丸底四ツ口のセパラブルフラスコに純水、スチレン（モノマー）、パラスチレンスルホン酸ナトリウムを加え、メカニカルスターラーを用いて窒素バブリングをしながら３０分間撹拌した。次に、オイルバスにて試料を撹拌した状態のまま７０度まで加熱した後、触媒の過硫酸カリウムを加え窒素雰囲気で８時間、スチレンの重合反応を行った。重合反応を行った試料を冷却した後、遠心分離にて沈殿物を回収し、純水を用いて生成物の洗浄を行った。洗浄して得られた試料は純水に分散しコア粒子１の懸濁液を得た。コア粒子１について、電子顕微鏡で粒子の直径と粒度分布を測定した結果、直径２１０ｎｍ、粒度分布の変動係数が３％であった。
（２）シェル２、及び表面層３の形成
　遠心分離によって回収したスラリー上のコア粒子１の分散液を純水で希釈した。希釈した液に２８ｗｔ％のアンモニア水を加えることで、ｐＨ１１．７のコア粒子１の分散液を調製した。調製した分散液を常温にて３０分間撹拌後、３官能ないし４官能のシランを投入した。１０時間撹拌した後、反応液を遠心分離し（１８０００ｒｐｍ、３０分間）、純水に再分散して生成物を得た。生成物は水分計（エーアンドディー社製：ＭＸ－５０）にて秤量した後、純水にて希釈して０．１ｗｔ％に調整した。
（３）シェル２、及び表面層３の評価
　（２）で得た粒子の分散液を揮発、及び乾固させて固形分を走査型電子顕微鏡（日立ハイテクノロジー社製：Ｓ－５５００）で観察した。具体的には、生成した粒子を、少なくとも１５０個以上観察して平均、標準偏差、粒度分布の変動係数を求めた。同様に求めていたコア粒子１の直径を、得た粒子全体の直径から差し引き、シェル２及び表面層３の厚さの合計値（コア構造の厚さ）を求めた。
　また、得られた電子顕微鏡像より、粒子表面のラフネスを官能評価で観察した。表面のラフネスがシェル２及び表面層３を合わせた厚さ（コア構造の厚さ）よりも大きいか否かを目視で判断した。判断結果は表１にＡ又はＢで示した。ここで、Ａは、コア構造の厚さが、ラフネス（粒子表面の突起構造）のサイズ以下の場合を、Ｂは、コア構造の厚さよりもラフネス（粒子表面の突起構造）のサイズが大きい場合を表す。
（４）表面層３の物性評価
　（２）で得た粒子の０．１ｗｔ％の懸濁液に、１規定の塩酸水溶液を滴下してｐＨを２に調整した。ｐＨを調整して得られた溶液中の粒子の分散状態の変化を観察した。すなわち、シリカのゼータ電位の変化に従い、中性から酸性に変化する際に、シラノール基の等電点付近で粒子が凝集するか否かを確認した。判断結果は表１にＡ又はＢで示した。表中のＡはシラノール基の等電点付近で粒子が凝集したことを、Ｂはシラノール基等電点付近で粒子が凝集しなかったことを意味する。シラノール基等電点付近で粒子が凝集する場合、粒子の表面層３の物性はシラノール基の影響が支配的である事を示す。シラノール基の影響が支配的であると、粒子に十分な親水性が付与され、非特異吸着を抑制する能力が高いと言える。
　凝集を起こす粒子は表面層３に存在するシラノール基の影響が支配的な粒子であり、シリカ層によってコートされているものと判断できる。一方凝集しない粒子は、ポリスチレン粒子表面に存在するスルホン酸の影響を残した粒子であると判断できる。
（５）粒子５の表面のシラノール基の密度の評価
　（２）で得た粒子におけるシラノール基の密度の評価は特開２００１－２０８６８３号公報に記載の方法で行った。クロロホルム溶媒にトリメチルシラノールを溶解した液を標準試料として赤外線吸収スペクトル（日本分光社製：ＦＴ／ＩＲ－６６００）で定量して検量線を作製した。赤外線吸収スペクトルにおいて、シラノール基の吸収波長は波数４２７８ｃｍ－１～４７００ｃｍ－１を選択して、吸収面積を計算して求めた。標準試料や、シラノール基の密度の評価対象とするサンプルは、光路長１ｃｍの石英ガラスに封入して、透過スペクトルにて測定した。測定サンプルは、濃度０．１ｗｔ％の粒子分散液を４ｍＬに乾固した後、クロロホルムに分散させて得た。シラノール基の密度はシェル２、及び表面層３の単位体積当たりのシラノール基の個数として算出した。
（６）粒子５の表面のチオール基の定量
　ＡｍｐｌｉｔｅＴＭ　Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ｔｏｔａｌ　Ｔｈｉｏｌ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．社製）を用いて、生成した粒子の表面におけるチオール基の密度の定量を行った。ＢｉｏＴｅｋ社製プレートリーダーと９６ｗｅｌｌ黒マイクロプレート（測定量１００ｍＬ）を用いて、蛍光（励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）を測定した。サンプルの分散液中の粒子の濃度は１ｍｇ／ｍＬで固定し測定を行った。得られたチオール基の濃度より、単位表面積あたりに存在するチオール基の個数を算出した。
（７）沈降速度の定量
　懸濁液中における粒子の沈降速度はルミサイザー（ルフト社製：ルミサイザー６１２）を用いて評価した。サンプル液の濃度は０．１ｗｔ％に調整した。温度２５℃、回転数４０００ｒｐｍ、測定インターバル４０秒で１００点測定した。得られた沈降速度を相対遠心力で割って、自然沈降速度（μｍ／秒）を算出した。
　以上（１）～（７）については、各実施例において共通して行ったことである。以下では、各実施例の詳細を説明する。
（実施例１）
　上記（１）及び（２）の手法で作製したコア粒子１のスラリー（４２．５ｗｔ％）０．２６ｍＬを純水２６．３ｍＬに添加した。得られた溶液にさらに、アンモニア水を１．３２ｍＬ加えてｐＨを調整して懸濁液を調製した。調製した懸濁液を３０分間撹拌した後、撹拌して得られた溶液にビニルトリメトキシシラン０．０９９ｍＬ、メルカプトプロピルトリメトキシシラン０．００１ｍＬを添加して更に１０時間撹拌した。撹拌後、懸濁液を遠心分離、純水に再分散してｐＨ７程度の分散液を得た。得た分散液の濃度を０．１ｗｔ％に調整して生成物を得た。
（実施例２）
　純水７８．９ｍＬに作製したコア粒子１のスラリー（４２．５ｗｔ％）を０．７８ｍＬ添加し、アンモニア水を３．９６ｍＬ加えてｐＨを調整して懸濁液を作製した。作製した懸濁液を３０分間撹拌した後、ビニルトリメトキシシラン０．５２ｍＬ、メルカプトプロピルトリメトキシシラン０．００５３ｍＬを添加して更に１０時間撹拌した。撹拌後、懸濁液を遠心分離、純水に再分散してｐＨ７程度の分散液を得た。得た分散液の濃度を０．１ｗｔ％に調整して生成物を得た。
（実施例３）
　純水２６．３ｍＬに作製したコア粒子１のスラリー（４２．５ｗｔ％）を０．２６ｍＬ添加し、アンモニア水を１．３２ｍＬ加えてｐＨを調整して懸濁液を作製した。作製した懸濁液を３０分間撹拌した後、ビニルトリメトキシシラン０．１ｍＬ、テトラエチルオルソシリケート０．１ｍＬを添加して更に１０時間撹拌した。撹拌後、懸濁液を遠心分離、純水に再分散してｐＨ７程度の分散液を得た。得た分散液の濃度を０．１ｗｔ％に調整して生成物を得た。
（比較例１）
　コア粒子１のスラリー（４２．５ｗｔ％）の濃度を調整して０．１ｗｔ％の懸濁液とした。
（比較例２）
　純水２６．３ｍＬに作製したコア粒子１のスラリー（４２．５ｗｔ％）を０．２６ｍＬ添加し、アンモニア水を１．３２ｍＬ加えてｐＨを調整して懸濁液を作製した。作製した懸濁液を３０分間撹拌した後、テトラエチルオルソシリケート０．３ｍＬを添加して更に１０時間撹拌した。撹拌後、懸濁液を遠心分離、純水に再分散してｐＨ７程度の分散液を得た。得た分散液の濃度を０．１ｗｔ％に調整して生成物を得た。
（比較例３）
　純水２６．３ｍＬに作製したコア粒子１のスラリー（４２．５ｗｔ％）を０．２６ｍＬ添加し、アンモニア水を１．３２ｍＬ加えてｐＨを調整して懸濁液を作製した。作製した懸濁液を３０分間撹拌した後、アミノプロピルトリメトキシシラン０．３ｍＬを添加して更に１０時間撹拌した。撹拌後、懸濁液を遠心分離、純水に再分散して分散液を得た。得た分散液の濃度を０．１ｗｔ％に調整して生成物を得た。
（比較例４）
　純水２６．３ｍＬに作製したコア粒子１のスラリー（４２．５ｗｔ％）を０．２６ｍＬ添加し、アンモニア水を１．３２ｍＬ加えてｐＨを調整して懸濁液を作製した。作製した懸濁液を３０分間撹拌した後、メルカプトプロピルトリメトキシシラン０．２ｍＬを添加して更に１０時間撹拌した。撹拌後、懸濁液を遠心分離、純水に再分散して分散液を得た。得た分散液の濃度を０．１ｗｔ％に調整して生成物を得た。
（比較例５）
　純水７８．９ｍＬに作製したコア粒子１のスラリー（４２．５ｗｔ％）を０．７８ｍＬ添加し、アンモニア水を３．９６ｍＬ加えてｐＨを調整して懸濁液を作製した。作製した懸濁液を３０分間撹拌した後、ビニルトリメトキシシラン０．５９４ｍＬ、メルカプトプロピルトリメトキシシラン０．００６ｍＬを添加して更に１０時間撹拌した。撹拌後、懸濁液を遠心分離、純水に再分散してｐＨ７程度の分散液を得た。得た分散液の濃度を０．１ｗｔ％に調整して生成物を得た。
（比較例６）
　チオール基で修飾された直径２０９ｎｍのシリカ粒子分散液０．１ｗｔ％（古河電工アドバンストエンジニアリング製）をそのまま用いた。
（８）非特異吸着の抑制能力を評価する試験
　実施例１の試料を用いて非特異吸着の抑制の能力の評価を行った。
　作製した０．１ｗｔ％の粒子懸濁液２．５ｍＬを遠心分離に掛け、得た沈殿物を２５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩１．０ｍＬに再分散した。得た懸濁液にヒト正常血清を加えて、検体検査システム（東芝メディカル社製：ＴＢＡ－１２０ＦＲ）で評価した。検出光の波長は５７０ｎｍで評価した。比較のため、シェルが存在しない、ポリスチレン粒子（粒径２００ｎｍ）も同様に測定を行った。ヒト正常血清は１６サンプルを用いて検討を行った。
（性能評価）
　実施例及び比較例の粒子材料の構造と物性を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１中におけるシェル２に含まれる原料及び表面層３の原料に記載のＶＭＴＳ、ＭＰＴＭＳはそれぞれ、ビニルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリメトキシシランを示す。また表１中におけるＴＥＯＳ、ＡＰＴＭＳは、テトラエチルオルソシリケート、アミノプロピルトリメトキシシランを示す。シリカ層の厚さは、シェル２と表面層３を合わせた厚さ、すなわち、シェル構造の厚さを示す。比較例６は、コア構造を含めて粒子を構成する成分がすべてシリカであり、シェル層がない。比較例６は、表面層３の原料は不明であるが、チオール基が存在する。
　作製した材料を電子顕微鏡で観察したところ、比較例４以外は均一な粒子表面を形成していた。比較例４の粒子の表面は２０～３０ｎｍの半球状の粒子が表面に付着したような状態であり、大きな凹凸（ラフネス）を確認した。
　また、変動係数は比較例４及び６以外では約２％であり、粒度分布が揃っている事を確認した。比較例６の粒子の変動係数は１３．７％であった。更に比較例４は一晩静置しただけでも凝集し沈降してきた。よって、比較例４の粒子材料はラテックス凝集法用の抗体検査粒子には適していないと考えられる。
　シリカ層の厚さとシェル２の材質を比較すると、ビニルトリメトキシシランを用いていない比較例２及び３では多量の表面層３の原料を添加したにもかかわらず、シリカ層の厚さが薄いことを確認した。さらに、表面シリカ層の物性を比較すると、比較例２及び３では表面物性がシラノール基による影響が支配的ではないことが判明した。一方、ビニルトリメトキシシランをシェル２の原料に用いた実施例１ではシリカ層の厚さが３．５ｎｍと薄いにも関わらず、表面物性はシラノール基の影響が支配的である事を確認した。これは、コア粒子１表面へのビニルトリメトキシシランの親和性が高く、シェル２を均一に形成できたことを示している。
　更に確認のため、比較例２及び３のゼータ電位を測定したところ、－４０ｍＶ程度であり、コア粒子１の表面に存在するスルホン酸の影響が支配的である事を確認した。なお、シェル２が存在しない、ポリスチレンコア粒子のみの比較例１も比較例２及び３と同様の傾向を示した。
　シラノール基の密度を比較すると、実施例１、２及び３では、それぞれ１７、２１、２３個／ｎｍ３である事を確認した。一方、比較例では、比較例１、２、３、５がそれぞれ、０、５、５、１５個／ｎｍ３である事を確認した。比較例１、２、及び３は表面物性がシラノール基の影響がない、あるいは小さい材料である事から、シラノール基の密度と表面の物性に相関がある事が示された。比較例４は粒子サイズが不特定かつ、凝集してしまうためシラノール基の密度の計測ができなかった。比較例６は粒子全体がシリカなので、正確なシラノール基の値を出すことが難しいが、表面物性はシラノール基が支配的である事を確認した。
　沈降速度を比較すると、比較例１の１．２×１０－３μｍ／秒が一番小さい値で、最も懸濁液の安定性が高かった。続いてシリカ層の薄い比較例２、３、及び実施例１は、沈降速度は比較例１とほぼ同じオーダーで安定な懸濁液であった。実施例２及び３もそれぞれ３．２×１０－３μｍ／秒及び２．９×１０－３μｍ／秒であり、比較例１の３倍程度ではあるが、４週間以上常温で静置しても安定な懸濁液であった。一方、比較例５では沈降速度が４．３×１０－３μｍ／秒となり、常温での４週間の静置後に若干の沈殿物を確認した。更に比較例６は沈降速度が２．１×１０－２μｍ／秒となり、比較例１と比べて１０倍以上速いことを確認した。比較例６は２日間程度の静置で沈殿が起きることを確認した。
　上記非特異吸着試験の結果、実施例１で調製した粒子の、径時変化による検出光の強度変化が、表面をコートしていないポリスチレン粒子に比べて、小さかった。また、抗原との反応後１０分間で起きる検出光の強度変化が１０１～１０２％となり、自己凝集を起こしていないことを確認した。
　以上のことから、本実施例に係る粒子材料は、非特異吸着能を有する表面特性かつ、沈降がすくない物性を兼ね揃えた材料であることが明らかとなった。
　上記本実施例、及び比較例の結果から、シェル構造の厚さが３ｎｍ以上１５ｎｍ以下であることによって、粒子の沈降速度を遅くできることがわかった。また、本実施例に係る粒子は、粒子表面のシラノール基が、粒子に十分な親水性を付与でき、非特異吸着の抑制能力が高いと考えられる。
　よって、本実施例に係る粒子を用いると、検出感度が高い、ラテックス凝集法用の検体検査粒子を提供することができる。特に、検出信号のノイズを小さくする効果に優れているため、低濃度の抗原の検出に適している。また、非特異吸着を抑制できるため、ラテックス凝集法以外の検体検査粒子としても利用することができる。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０１８年４月２７日提出の日本国特許出願特願２０１８－０８７５１６を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。
１　コア構造
２　シェル
３　表面層
４　シェル構造
５　粒子

 

Claims (30)

  1. 　ポリマーを含むコア構造と、
    　シリカを含むシェル構造と、を含み構成される粒子であって、
    　前記シェル構造は、下記式（１）で示される構造を有し、
    　前記シェル構造の厚さが３ｎｍ以上１５ｎｍ以下である粒子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　上記式（１）において、
    　Ｒ１乃至Ｒ３のうち、いずれか１つはシリカ構造であり、いずれか１つはＨであり、残りの１つは、Ｈ、又はシリカ構造であり、
    　Ａは、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、グリシジル基のいずれかである。
  2. 　ポリマーを含むコア構造と、
    　シリカを含むシェル構造と、を含み構成される粒子であって、
    　前記シェル構造は、３官能シランから形成したシリカ構造を有し、
    　前記シリカ構造は、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、及びグリシジル基で構成する群から選択される少なくとも１種と、シラノール基とを有し、
    　前記シェル構造の厚さが３ｎｍ以上１５ｎｍ以下である粒子。
  3. 　前記３官能のシランが、ビニルトリメトキシシラン、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、３－アミノプロピルトリメトキシシランで構成する群から選択される少なくとも１種である請求項２に記載の粒子。
  4. 　前記シェル構造は、さらに４官能のシランから形成したシリカ構造を有する請求項２又は３に記載の粒子。
  5. 　前記４官能のシランが、テトラエトキシシランである請求項４に記載の粒子。
  6. 　前記シェル構造における前記シラノール基の密度が、
    　１０個／ｎｍ３以上である請求項１乃至５のいずれか１項に記載の粒子。 
  7. 　前記シェル構造がチオール基を有し、前記シェル構造における前記チオール基の密度が０．０１個／ｎｍ２以下である請求項１乃至６のいずれか１項に記載の粒子。 
  8. 　前記ポリマーがポリスチレンである請求項１乃至７のいずれか１項に記載の粒子。
  9. 　前記シェル構造の厚さが５ｎｍ以上１０ｎｍ以下である請求項１乃至８のいずれか１項に記載の粒子。
  10. 　前記粒子の水中での沈降速度が３．９×１０－３μｍ／秒以下である請求項１乃至９のいずれか１項に記載の粒子。
  11. 　前記粒子の水中での沈降速度が１．１×１０－３μｍ／秒以上である請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の粒子。
  12. 　請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の粒子と、前記粒子を分散させる分散媒とを有する分散液。
  13. 　前記分散液に含まれる前記粒子の平均直径が、１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下である請求項１２に記載の分散液。
  14. 　前記分散液に含まれる前記粒子の平均直径が、１５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下である請求項１２又は１３に記載の分散液。
  15. 　前記分散液に含まれる前記粒子の粒度分布の変動係数が５％以下である請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の分散液。
  16. 　前記分散液に含まれる前記粒子の粒度分布の変動係数が３％以下である請求項１２乃至１５のいずれか１項に記載の分散液。
  17. 　請求項１及至１１のいずれか１項に記載の粒子と、前記粒子に結合したリガンドと、を有するアフィニティー粒子。
  18. 　前記リガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることを特徴とする請求項１７に記載のアフィニティー粒子。
  19. 　請求項１７又は１８に記載のアフィニティー粒子と、前記アフィニティー粒子を分散させる分散媒と、を有することを特徴とする体外診断用の検査試薬。
  20. 　前記リガンドが抗体又は抗原であり、ラテックス凝集法による検体中の抗原又は抗体の検出に用いられる請求項１９に記載の検査試薬。
  21. 　請求項１９又は２０に記載の検査試薬と、前記検査試薬を内包する筐体とを有することを特徴とする体外診断用の検査キット。
  22. 　検体中の標的物質の検出方法であって、
    　請求項１９又は２０に記載の検査試薬に、検体を混合する工程を有することを特徴とする検出方法。
  23. 　ラテックス凝集法による検体中の標的物質の検出方法であって、
    　請求項１９又は２０に記載の検査試薬に、検体を混合して混合液を得る工程と、
    　前記混合液に、光を照射する工程と、
    　前記混合液に照射された光の、透過光又は散乱光の少なくともいずれかを検出する工程と、
    を有することを特徴とする検出方法。
  24. 　ビニル基を有するモノマーと、ラジカル重合開始剤とを混合することで、ポリマーを含むコア粒子を含む溶液を得る工程（工程１）と、
    　前記溶液に、ビニル基を有する３官能のシランを添加して加水分解することで、前記コア粒子の表面にシリカを含むシェル構造を形成し、コア－シェル構造を有する粒子を得る工程（工程２）と、
    を有する粒子の製造方法。
  25. 　前記ビニル基を有するモノマーがスチレンである請求項２４に記載の粒子の製造方法。 
  26. 　ビニル基を有する３官能のシランが、ビニルトリメトキシシラン、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、３－アミノプロピルトリメトキシシランで構成する群から選択される少なくとも１種である請求項２４又は２５に記載の粒子の製造方法。
  27. 　前記工程２において、さらに４官能のシランを添加する工程を有する請求項２４乃至２６のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
  28. 　前記４官能のシランが、テトラエトキシシランである請求項２７に記載の粒子の製造方法。
  29. 　粒子にリガンドを結合する工程をさらに有する請求項２４乃至２８のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
  30. 　前記リガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることを特徴とする請求項２９に記載の粒子の製造方法。


     
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