CN114555650A - 颗粒以及制造颗粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种在不使用BSA的情况下能够抑制非特异性吸附的颗粒的制造方法。一种制造颗粒的方法，所述方法包括：第一步,其中通过将自由基聚合性的单体、具有与烷氧基键合的硅原子的自由基聚合性的有机硅烷化合物、自由基聚合引发剂、水溶性聚合物和水性介质混合以制备乳液；和第二步，其中在第一步之后添加特定的反应性化合物。

Description

颗粒以及制造颗粒的方法
技术领域
本发明涉及颗粒以及颗粒的制造方法。
背景技术
聚合物颗粒在基础生物学和医学领域中变得越来越重要。例如，越来越需要使用胶乳凝集法应用于体外实验室诊断剂。
原则上，如果期望的抗原或抗体可以吸附在颗粒表面上，则其可以用于胶乳凝集反应。然而，试样中存在许多污染物，例如血清，这些污染物也被吸附在颗粒表面上(非特异性吸附)，并且抑制期望的抗原或抗体在颗粒表面上的吸附。此外，当颗粒通过吸附在颗粒上的污染物相互凝集时，测量精度会降低。为此，存在一种抑制污染物在颗粒表面上的吸附(非特异性吸附)的方法，其通过在颗粒上吸附期望的抗体，然后用牛血清白蛋白(BSA)覆盖颗粒表面。(PTL 1)。
引文清单
专利文献
PTL 1：日本专利申请公开号2004-151000
发明内容
技术问题
例如，对于PTL 1中记载的用BSA覆盖颗粒表面的方法，污染物的吸附可以被或不能被充分抑制。因此，当在乳胶凝集方法中使用覆盖有BSA的颗粒时，问题是再现性降低。
因此，本发明的目的是提供一种能够在不使用BSA的情况下抑制非特异性吸附的颗粒以及制备其的方法。
问题的解决方案
根据本发明的一个方面，制造颗粒的方法包括：第一步,将自由基聚合性的单体、具有与烷氧基键合的硅原子且具有自由基聚合性的有机硅烷化合物、自由基聚合引发剂、水溶性聚合物和水性介质混合以制备乳液；和第二步，在第一步之后添加反应性化合物，其中所述反应性化合物由下式(1)表示：
[化学式1]
Figure BDA0003597534370000021
在式(1)中，R1和R2各自表示具有1个以上且30个以下的碳原子的直链或支化烷基，其被至少一个羧基或至少一个氨基取代，且任选地包括-NH-CO-、-NH-、-O-、-S-或-CO-。
此外，根据本发明另一方面的颗粒是通过以下步骤制造的颗粒：第一步,将自由基聚合性的单体、具有与烷氧基键合的硅原子且具有自由基聚合性的有机硅烷化合物、自由基聚合引发剂、水溶性聚合物和水性介质混合以制备乳液；和第二步，在第一步之后添加反应性化合物，其中所述反应性化合物由上述式(1)表示。
发明的有益效果
根据本发明，可以提供一种能够在不使用BSA的情况下抑制非特异性吸附的颗粒及其制造方法。
实施方案的描述
在下文中，将详细描述本发明的实施方案，但本发明不限于此。
颗粒以及制造颗粒的方法
根据本实施方案的制造颗粒的方法包括：第一步,将自由基聚合性的单体、具有与烷氧基键合的硅原子且具有自由基聚合性的有机硅烷化合物、自由基聚合引发剂、水溶性聚合物和水性介质混合以制备乳液；和第二步，在第一步之后添加反应性化合物，其中所述反应性化合物由下式(1)表示：
[化学式2]
Figure BDA0003597534370000031
在式(1)中，R1和R2各自表示具有1个以上且30个以下的碳原子的直链或支化烷基，其被至少一个羧基或至少一个氨基取代，且任选地包括-NH-CO-、-NH-、-O-、-S-或-CO-。
在下文中，通过根据本实施方案的制造方法制造的颗粒可被称为聚合物细颗粒。通过根据本实施方案的用于制造颗粒的方法制造的颗粒在颗粒表面上具有高的亲水性，这是由于存在衍生于有机硅烷化合物的氧化硅(硅烷醇基)，因此能够在不使用BSA的情况下抑制非特异性吸附。此外，BSA是天然产物，因此推测亲水性和疏水性的程度因批次而异，但通过根据本实施方案的用于制造颗粒的方法制造的颗粒不使用BSA，因此每个颗粒的抑制非特异性吸附的能力差异小。换言之，在制造颗粒时，所制造的颗粒抑制非特异性吸附的能力的再现性高。
在第一步之后添加反应性化合物作为第二步具有以下优点。首先，可预期改善在第一步中制备的颗粒的核的均匀性的效果。另外，可预期改善通过第一步获得的颗粒表面上的反应性化合物的反应性的效果。
在第二步中，可以添加一种或多种表面活性剂。通过添加表面活性剂可以改善聚合物细颗粒的分散性。
式(1)中的R1和R2中的至少任一个优选具有至少一个羧基。
此外，根据本实施方案的制造颗粒的方法优选还包括在第一步之后加热乳液。
在第一步中，可以进一步使用在一个分子中具有两个以上双键的单体(例如二乙烯基苯)作为交联剂。
式(1)中的R1和R2中的至少一个优选具有由下式(2)表示的结构或由式(3)表示的结构。
[化学式3]
Figure BDA0003597534370000041
[化学式4]
Figure BDA0003597534370000042
在式(2)中，Z表示具有1个以上且10个以下的碳原子的直链或支化、饱和或不饱和烷基。
此外，根据本实施方案的颗粒是通过以下步骤制造的颗粒：第一步,将自由基聚合性的单体、具有与烷氧基键合的硅原子且具有自由基聚合性的有机硅烷化合物、自由基聚合引发剂、水溶性聚合物和水性介质混合以制备乳液(混合物)；和第二步，在第一步之后添加反应性化合物，其中所述反应性化合物由上式(1)表示。
根据本实施方案的颗粒是通过上述的根据本实施方案制造颗粒的方法制造的颗粒。即，根据本实施方案的颗粒优选具有一个或多个下式(4)所示的结构单元。
[化学式5]
Figure BDA0003597534370000043
在式(4)中，X表示经由O与式(4)所示的相邻结构所具有的Si的键、与由乳液制备的颗粒的核的键、或羟基，并且由式(4)表示的结构单元中的至少一个具有与核的键。
R3和R4中的至少任一个表示具有1个以上且30个以下的碳原子的直链或支化烷基，其被至少一个羧基或至少一个氨基取代，且任选地包括-NH-CO-、-NH-、-O-、-S-或-CO-。
此外，式(4)中的R3和R4中的至少一个优选具有由上式(2)表示的结构或由上式(3)表示的结构，R3和R4中的至少一个更优选地具有由上式(3)表示的结构。
(自由基聚合性的单体)
作为自由基聚合性的单体，可以使用不包括硅原子的单体。
此外，作为自由基聚合性的单体，可以使用选自苯乙烯系单体、丙烯酸酯系单体和甲基丙烯酸酯系单体中的至少一种。具体而言，作为自由基聚合性的单体，可以使用选自例如苯乙烯、丁二烯、乙酸乙烯酯、氯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯腈、丙烯酸甲酯中的至少一种。即，这些可以单独使用或者将两种以上组合使用。
此外，作为根据本实施方案的自由基聚合性的单体，与苯乙烯系单体、丙烯酸酯系单体和甲基丙烯酸酯系单体中的每一种具有高相容性并且具有高亲水性的官能团的单体可单独使用或者将两种以上组合使用。例如，具有磺酸基的苯乙烯磺酸系单体(对苯乙烯磺酸钠等)可用作与苯乙烯具有高相容性以及高亲水性的官能团。
在根据本实施方案制造颗粒的方法的第一步中，通过进一步混合对苯乙烯磺酸盐来制备乳液，能够获得减小颗粒粒径以及提高粒径均匀性的效果。对此的一个因素是在自由基聚合性的单体与有机硅烷化合物的聚合反应期间，对苯乙烯磺酸也发生共聚，从而改善颗粒的亲水性和分散性。
(有机硅烷化合物)
作为有机硅烷化合物，可以使用选自下列中的至少一种：乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、对苯乙烯基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷和3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。即，这些可以单独使用或者将两种以上组合使用。
(自由基聚合引发剂)
作为自由基聚合引发剂，可以广泛使用偶氮化合物、有机过氧化物等。它们的具体实例包括：2,2'-偶氮二(异丁腈)、2,2'-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)、2,2'-偶氮二(2-甲基丁腈)、4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)、2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐、2,2'-偶氮二(2-甲基丙酸)二甲酯、叔丁基过氧化氢、过氧化苯甲酰、过硫酸铵(APS)、过硫酸钠(NPS)和过硫酸钾(KPS)。
(水溶性聚合物)
在聚合物细颗粒的合成期间，水溶性聚合物充当保护性胶体，并且有助于控制生成的聚合物细颗粒的粒径。作为优选的水溶性聚合物，可以使用选自聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯吡咯烷酮-聚丙烯酸共聚物中的至少一种。即，可以使用这些中的一种或多种类型的组合。聚乙烯吡咯烷酮-聚丙烯酸共聚物是含有吡咯烷酮环和能够结合配体的官能团的聚合物的例子，作为水溶性聚合物，可以使用含有吡咯烷酮环和能够结合配体的官能团的共聚物。
水溶性聚合物的分子量优选为10000以上且1000000以下，更优选为30000以上且70000以下。这是因为如果分子量为10000以上，则可以高度地获得作为保护性胶体的效果，并且如果分子量为1000000以下，则水性介质的粘度不会增加而且水溶性聚合物不会变得难以处理。此外，这些水溶性聚合物的一部分可以通过物理吸附、化学吸附等与合成后的颗粒表面紧密接触。
下文中，含有吡咯烷酮环和能够结合配体的官能团的共聚物被简称为PVP共聚物。在PVP共聚物中，具有吡咯烷酮环的位点与具有能够结合配体的官能团的位点的摩尔比优选约为2:8至9:1。如果能够结合配体(例如抗体)的官能团过少，则抗原-抗体反应的效率降低，如果过多，则非特异性吸附抑制性能降低。PVP共聚物中的能够结合配体的官能团没有特别限制，只要该官能团是能够结合抗体、抗原、酶等的官能团即可，使用羧基、氨基、硫醇基、环氧基、马来酰亚胺基、丁二酰亚胺基、硅醇盐基等。PVP共聚物可以是无规聚合物或嵌段共聚物。
通过在颗粒合成时添加PVP共聚物，能够向颗粒一次赋予非特异性吸附抑制能力和配体结合能力。此外，当使用包括有机硅烷的自由基聚合性单体(或低聚物)合成颗粒时，可以向颗粒表面赋予硅烷醇基。硅烷醇基和PVP之间的氢键使得PVP或PVP共聚物更强烈地吸附在颗粒表面上。
作为PVP聚合物的实例的聚乙烯吡咯烷酮-聚丙烯酸共聚物的例子包括N-乙烯基-2-吡咯烷酮和丙烯酸的无规共聚物(由Polymer Source,Inc.制造)。对于N-乙烯基-2-吡咯烷酮和丙烯酸的无规共聚物(Polymer Source,Inc.制造)，优选的共聚物可选自分子量为60000、70000、79000等的那些。此外，类似地，对于N-乙烯基-2-吡咯烷酮分子数与丙烯酸分子数的比率，优选的比率可以选自4:6、3.1:6.9、2:8等。
(水性介质)
水性介质的水含量优选为80质量％以上且100质量％以下。水性介质的实例包括水和通过将可溶于水的有机溶剂例如甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮混合到水中而获得的溶液。如果水以外的有机溶剂的含量超过20质量％，则可聚合单体可能在聚合物细颗粒的制造期间溶解。
此外，水性介质的pH优选为6以上且9以下。如果pH为6以上且9以下，则有机硅烷化合物中的烷氧基和硅烷醇基不会缩聚，并且在聚合物细颗粒形成之前不会与其他官能团反应，并且不可能发生所得颗粒的凝集。在本实施方案中，在聚合物细颗粒的形成之前，不有意地使醇盐缩聚。
优选使用pH缓冲剂调节水性介质的pH，可以使用酸或碱进行调节。
可以通过添加到水性介质中来使用表面活性剂、消泡剂、盐、增稠剂等，基于水性介质的比例为10质量％以下。
(表面活性剂)
作为在第二步中添加的表面活性剂，可以使用非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、聚合物表面活性剂、磷脂等。可以仅使用这些表面活性剂中的一种，或者可以组合使用这些表面活性剂中的两种以上。
非离子表面活性剂的实例包括聚氧乙烯山梨醇酐系脂肪酸酯(例如，由式(5)表示的化合物)、Brij(注册商标)35、Brij(注册商标)58、Brij(注册商标)76、Brij(注册商标)98、Triton(注册商标)X-100、Triton(注册商标)X-114、Triton(注册商标)X-305、Triton(注册商标)N-101、Nonidet(注册商标)P-40、IGEPAL(注册商标)CO530、IGEPAL(注册商标)CO630、IGEPAL(注册商标)CO720和IGEPAL(注册商标)CO730。
[化学式6]
Figure BDA0003597534370000081
在式(5)中，R21至R24各自独立地选自-H和-OCR'。R'是具有1以上且18以下碳原子的饱和或不饱和烷基。另外，在式(5)中，w1、x1、y1和z1是整数，其中w1、x1、y1和z1的总和为10以上且30以下。
由式(5)表示的聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯的实例包括Tween(注册商标)20、Tween(注册商标)40、Tween(注册商标)60、Tween(注册商标)80和Tween(注册商标)85。
阴离子表面活性剂的实例包括十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸盐、癸基苯磺酸盐、十一烷基苯磺酸盐、十三烷基苯磺酸盐、壬基苯磺酸盐及其钠盐、钾盐和铵盐。
阳离子表面活性剂的实例包括溴化十六烷基三甲基铵、氯化十六烷基吡啶鎓、氯化十二烷基三甲基铵和氯化十六烷基三甲基铵。
聚合物表面活性剂的实例包括聚乙烯醇、聚氧乙烯聚氧丙二醇和明胶。聚氧乙烯聚氧丙二醇的可商购产品的实例包括Pluronic F68(由BASF SE制造)和Pluronic F127(由BASF SE制造)。
(根据本实施方案的制造颗粒的方法的详述)
在根据本实施方案的制造颗粒的方法中，在第一步中，首先将水溶性聚合物溶解于水性介质中，将所述水性介质的pH调节至6以上且9以下。基于水性介质，水溶性聚合物浓度为0.01质量％以上且20质量％以下，优选为0.03质量％以上且15质量％以下。如果水溶性聚合物浓度为0.01质量％以上，则可以有效地获得控制粒径的效果。另外，如果水溶性聚合物浓度为20质量％以下，则水性介质的粘度不会增加，并且可以充分地进行搅拌。
随后，将包括硅原子的自由基聚合性的单体(A)和具有与硅原子键合的烷氧基并且进一步具有自由基聚合性的有机硅烷化合物(B)添加到水性介质中以制备乳液。(A)与(B)的质量比为4:6至9.7:0.3。
如果(A)与(B)的质量比为4:6以上，则颗粒整体的比重不会过度增加，颗粒的沉降不会变得显著。另外，如果(A)与(B)的质量比为9.7:0.3以下，则硅原子的含量不会变得过少，并且抑制非特异性吸附的能力不会降低。
水性介质的质量与(A)和(B)总质量的比率优选为5:5至9.5:0.5。如果水性介质的质量与(A)和(B)总质量的比率为5:5以上，则所产生的聚合物细颗粒的凝集不会变得显著。另外，如果水性介质的质量与(A)和(B)总质量的比率为9.5:0.5以下，则生成的量不会减少。
在第二步中添加的反应性化合物可用于固定抗体。
反应性化合物的用量可以为0.01质量％以上且60质量％以下，基于(A)和(B)的总质量。
通过溶解于水、缓冲液等来使用自由基聚合引发剂。自由基聚合引发剂的用量可以为0.1质量％以上且10质量％以下，基于(A)和(B)的总质量。
当在第一步之后进一步包括加热乳液时，可以使用任何加热装置来加热乳液，只要整个乳液被均匀加热即可。可在50℃和90℃之间任意设定加热温度，可在2小时和24小时之间任意设定加热时间。
在第二步中，将第一步之后获得的聚合物细颗粒与反应性化合物混合，并均匀搅拌整个液体。搅拌时的温度可以在4℃和90℃之间任意设定，搅拌时间可以任意设定，只要其为3小时以上即可。可在第二步中添加上述表面活性剂。
在第一步中，可以获得不包括硅原子的自由基聚合性的单体、具有与硅原子键合的烷氧基并且进一步具有自由基聚合性的有机硅烷化合物、以及水溶性聚合物的混合颗粒。该混合颗粒优于具有核-壳结构的颗粒。在此，例如，具有核-壳结构的颗粒的核颗粒是含有衍生自不包括硅原子的可自由基聚合单体的单体单元的聚合物。另外，具有核-壳结构的颗粒的壳是含有衍生于有机硅烷化合物的单体单元的聚合物，该有机硅烷化合物具有与硅原子键合的烷氧基并且进一步具有自由基聚合性。混合颗粒相对于核-壳结构的优点包括以下。作为一个优点，在混合颗粒的制造中，可以将原材料一次加入。即，在核-壳结构的情况下，需要在形成核之后再形成壳，这使得制造步骤复杂化。作为另一个优点，可以改变不包括硅原子的可自由基聚合单体与具有键合到硅原子的烷氧基并且进一步具有自由基聚合性的有机硅烷化合物之间的反应比率(原料投入比率)。即，能够容易地控制所获得的聚合物细颗粒的组成比率。可以控制由此获得的聚合物细颗粒的性质(比重等)。
根据本实施方案的用于制造颗粒的方法可包括在第二步之后添加配体。
聚合物细颗粒的平均粒径优选为50nm以上且400nm以下，并且进一步优选为100nm以上且400nm以下。此外，聚合物细颗粒的粒径的变动系数(CV值)优选为5以下。
用于测量平均粒径的主要方法有动态光散射法(DLS)、激光衍射法(LD法)、用电子显微镜观察等，在本实施方案中，可优选使用动态光散射法。例如，可以通过动态光散射法测量所述聚合物细颗粒的分散液，将得到的光强度转化为数分布，并将平均值用作粒径。如果平均粒径为50nm以上，则在合成时的清洗处理不会耗费时间。另外，如果平均粒径为400nm以下，则在存储期间的沉降引起的凝集不会变得显著。
对于变动系数(CV值)，使用电子显微镜拍摄聚合物细颗粒的图像，获得例如100个以上颗粒的直径，并且可以通过统计处理获得变动系数(CV值)。如果变动系数(CV值)为5以下(粒径的分布宽度不太宽)，则试样测试用颗粒与抗原之间的反应不会变得不稳定。
可以通过合成时单体与水性介质的比例、水溶性聚合物的添加量、反应温度和反应时间来控制聚合物细颗粒的粒径。
通过以下方式对如此制造的聚合物细颗粒的分散液进行纯化：通过过滤分级、通过离心倾析、超滤等，以及除去未反应的物质、凝集物等。
根据本发明，用于制造检验试剂的方法包括将聚合物细颗粒分散在分散介质中。
(根据本实施方案的颗粒的细节)
根据本发明实施方案的颗粒是具有共聚物的颗粒，该共聚物包括由下式(I)表示的重复单元和由下式(II)表示的重复单元，以及由下式(III)表示的结构。
[化学式7]
Figure BDA0003597534370000111
[化学式8]
Figure BDA0003597534370000112
[化学式9]
Figure BDA0003597534370000113
在式(II)中，A1至A3各自独立地为-H、-CH3、-CH2CH3和通过-O-与式(II)中的Si键合的键中的任一种。
在式(III)中，X1至X4各自独立地表示：经由O与式(III)所示的相邻结构所具有的Si的键、和与式(II)中的与Si键合的O的键、或羟基，由式(III)表示的结构单元中的至少一个具有与所述共聚物的键，并且R3和R4中的至少任一个表示具有1个以上且30个以下碳原子的直链或支化烷基，其被至少一个羧基或至少一个氨基取代，且任选地包括-NH-CO-、-NH-、-O-、-S-或-CO-。
此外，R3和R4中的至少一个优选具有下式(2)表示的结构或下式(3)表示的结构，R3和R4中的至少一个更优选具有下式(3)表示的结构。
[化学式10]
Figure BDA0003597534370000121
[化学式11]
Figure BDA0003597534370000122
包括由上式(I)表示的重复单元和由上式(I I)表示的重复单元的共聚物可以进一步包括由下式(IV)表示的重复单元。
[化学式12]
Figure BDA0003597534370000123
式(IV)中的Y为H、Na、K中的任一种。
<用于试样测试的颗粒>
聚合物细颗粒是用于试样测试的前体颗粒。抗体可被固定在前体颗粒上并用作试样测试用颗粒。
作为固定方法，使用聚合物细颗粒的官能团，并通过化学键合、物理吸附等进行固定。本发明不限于该方法。
在将抗体固定在聚合物细颗粒上的试样测试用颗粒中，当试样中存在抗原时，试样测试用颗粒通过抗原彼此凝集，并且可以通过观察这种凝集来检测抗原。如果试样不包括目标抗原，则不太可能发生凝集。
(亲和颗粒)
在本实施方案中，可以提供具有根据本实施方案的颗粒和结合到反应性化合物的配体的亲和颗粒。在本实施方案中，配体是指与特定靶物质所具有的受体特异性结合的化合物。配体与靶物质结合的位点是固定的，并且选择性或特异性地具有高亲和力。其实例包括抗原和抗体、酶蛋白及其底物、信号物质(例如激素和神经递质及其受体)，以及核酸，并且本实施方案中的配体不限于此。核酸的例子包括脱氧核糖核酸。本实施方案中的亲和颗粒对靶物质选择性或特异性地具有高亲和力。本实施方案中的配体优选为抗体、抗原和核酸中的任一种。
在本实施方案中，作为使本实施方案的颗粒的反应性官能团与配体化学键合的化学反应的方法，就能够实现本发明目的的程度来说，可以应用常规已知的方法。另外，在配体被酰胺键合的情况下，可以适当使用催化剂，例如1-[3-(二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺]。
当本实施方案中的亲和颗粒使用抗体(抗原)作为配体以及使用抗原(抗原)作为靶物质时，亲和颗粒可优选地应用于在临床实验室试验、生化研究等领域中广泛使用的免疫乳胶凝集测量方法。
(用于体外诊断的检验试剂)
在本实施方案中用于体外诊断的检验试剂，即用于通过体外诊断检测试样中的靶物质的检验试剂，包括根据本实施方案的亲和颗粒和用于分散亲和颗粒的分散介质。本实施方案中的试剂中所含的根据本实施方案的亲和颗粒的量优选为0.001质量％以上且20质量％以下，更优选为0.01质量％以上且10质量％以下。
根据本实施方案的试剂除了本实施方案的亲和颗粒以外还可包括第三物质，例如溶剂或阻滞剂，只要能够实现本发明的目的即可。诸如溶剂或阻滞剂的第三物质可以按两种以上的组合包括。
用于本实施方案中的溶剂的实例包括各种缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、Good缓冲溶液、Tr is缓冲溶液和氨缓冲溶液，并且本实施方案中的试剂中所包括的溶剂不限于这些。
当试剂用于通过乳胶凝集法检测试样中的抗原或抗体时，抗体或抗原可用作配体。
(用于体外诊断的检验试剂盒)
在本实施方案中，用于通过体外诊断检测试样中的靶物质的检验试剂盒包括上述检验试剂和容纳上述检验试剂的外壳。
根据本实施方案的试剂盒可包含用于测量乳胶凝集的敏化剂。用于测量乳胶凝集的敏化剂的实例包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚藻酸，且本发明不限于此。
此外，根据本实施方案的试剂盒可包括阳性对照物、阴性对照物、血清稀释剂等。作为阳性对照物和阴性对照物的培养基，除了血清和不含可测量靶物质的生理盐水之外，还可以使用溶剂。
根据本实施方案的试剂盒可用于根据本实施方案的检测靶物质的方法中，正如通过体外诊断检测试样中的靶物质的普通试剂盒。此外，也可以通过常规已知方法测量靶物质的浓度，并且该浓度优选用于通过凝集方法尤其是乳胶凝集方法来检测试样中的靶物质。
(检测方法)
本实施方案中的通过体外诊断检测试样中的靶物质的方法包括将可能包括靶物质的试样混合到根据本实施方案的检验试剂中。
根据本实施方案的检验试剂与试样的混合优选在pH 3.0至pH 11.0的范围内进行。另外，混合温度为20℃至50℃，混合时间为1分钟至20分钟。另外，在本检测方法中优选使用溶剂。另外，在根据本实施方案的检测方法中，根据本实施方案的亲和颗粒在反应体系中的浓度优选为0.001质量％以上且5质量％以下，更优选为0.01质量％以上且1质量％以下。
在根据本实施方案的检测方法中，优选光学检测由根据本实施方案的亲和颗粒与试样混合产生的凝集反应，即，通过乳胶凝集方法来检测试样中的靶物质。具体而言，根据本实施方案的检测方法优选包括：将试样混合到根据本实施方案的检验试剂中以得到混合物；用光照射混合物；和检测用以照射混合物的光的透射光和散射光中的至少任意一种。
通过对混合物中发生的凝集反应进行光学检测，可以检测出试样中的靶物质，并且进一步还可以测量靶物质的浓度。作为光学检测凝集反应的方法，可以使用能够检测散射光强度、透射光强度、吸光度等的光学仪器来测量其值的变化量。
实施例
下文中将参考实施例、比较例和参考例更具体地描述本发明。然而，本发明不限于以下实施例。
(PSS-1的制备)
将90g磷酸盐缓冲溶液(由Kishida Chemical Co.，Ltd.制造，pH7.4)放入200mL烧瓶中，并将0.9g聚乙烯吡咯烷酮K-30(由Kishida Chemical Co.，Ltd.制造，分子量为40000)溶解于其中。接下来，添加3.0g的3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(商品名：LS-3380，由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)和9.0g苯乙烯(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)，并在室温下搅拌所得混合物10分钟同时向其中吹入氮气。然后，在油浴中将烧瓶中的乳液加热至70℃。将0.3g过二硫酸钾(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)溶解在15mL磷酸盐缓冲溶液(由Kishida Chemical Industries，Ltd.制造，pH7.4)中制备的溶液添加到加热至70℃的乳液中。在70℃下搅拌7小时后，将温度恢复至室温，从而获得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒的分散液。将所得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒标示为PSS-1。
通过用电子显微镜观察来评价PSS-1的平均粒径，并且发现其为253nm。此外，PSS-1粒径的变动系数为1.5。
将所得PSS-1分散在环氧树脂中并固化，然后使用切片机将所得固化产物切成薄片，并使用透射电子显微镜(TEM)观察该薄片，并对其进行扫描透射电子显微镜能量色散X射线分析(STEM-EDS元素分析)。作为在颗粒的横截面上切成薄片的颗粒外部和中心部分进行元素分析的结果，检测出碳、氧和硅。基于所检测的碳量，检测到的硅量没有大的差异，因此认为硅在颗粒中的分布没有大的偏差。
此外，对PSS-1的分散液进行离心分离以收集PSS-1，并丢弃上清液。将收集的PSS-1再分散在离子交换水中，然后再次进行离心分离。使用离心机收集PSS-1并使用离子交换水重复4次再分散。
调节由此获得的PSS-1的分散液，使颗粒的质量浓度为0.5％，且颗粒的分散液体积为200mL。
(PSS-2的制备)
将157g的50mM2-吗啉代乙磺酸(MES，由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造)缓冲溶液(pH值7.0)和1.3g聚乙烯吡咯烷酮K-30(分子量为40000，由Kishida ChemicalCo.制造)混合。接下来，添加4g的3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(由Shin-EtsuChemical Co.,Ltd.制造，LS-3380)和13g苯乙烯(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)，并在室温下将所得混合物搅拌10分钟同时向其中吹入氮气。然后，在油浴中将烧瓶中的乳液加热至70℃。将0.5g过二硫酸钾(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)溶解在离子交换水中，并将所得溶液添加到加热至70℃的乳液中。在70℃下搅拌7小时之后，停止加热，然后搅拌过夜，从而得到聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒的分散液。将所得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒标示为PSS-2。
此外，对PSS-2的分散液进行离心分离以收集PSS-2，并丢弃上清液。通过将以下操作重复多次对收集的PSS-2进行清洗：在离子交换水中再分散，然后进行离心分离。
使用粒径分析仪(商品名：Zetasizer，由Malvern Panalytical Ltd制造)通过动态光散射法评估如此获得的PSS-2的平均粒径，并且发现其为203nm。
(PSS-3的制备)
将以下材料进行混合。
·50mM磷酸盐缓冲溶液(Kishida Chemical Co.，Ltd.，pH7.4)：157g
·聚乙烯吡咯烷酮K-30(由Kishida Chemical Co.，Ltd.制造，分子量为40000)：0.43g
·N-乙烯基-2-吡咯烷酮和丙烯酸的无规共聚物(由Polymer Source，Inc.制造，分子量为60000，N-乙烯基-2-吡咯烷酮的分子数与丙烯酸的分子数之比＝4:6，下文简称为PVP-PAA)：0.87g
接下来，添加4g的3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(商品名：LS-3380，由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)和13g苯乙烯(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)，并在室温下将所得混合物搅拌10分钟同时向其中吹入氮气。然后，在油浴中将烧瓶中的乳液加热至70℃。将0.5g过二硫酸钾(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)溶解在离子交换水中，并将所得溶液添加到加热至70℃的乳液中。在70℃下搅拌7小时之后，停止加热，然后搅拌过夜，从而获得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒的分散液。将所得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒标示为PSS-3。
此外，对PSS-3的分散液进行离心分离以收集PSS-3，并丢弃上清液。通过将以下操作重复多次对收集的PSS-3进行清洗：在离子交换水中再分散，然后进行离心分离。
使用粒径分析仪(商品名：Zetasizer，由Malvern Panalytical Ltd.制造)通过动态光散射法评估如此获得的PSS-3的平均粒粒径，并且发现其为301nm。
(PSS-4的制备)
将以下材料混合。
·25mM2-吗啉代乙磺酸(MES，由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造)缓冲溶液(pH7.0)：157g
·聚乙烯吡咯烷酮K-30(由Kishida Chemical Co.，Ltd.制造，分子量为40000)：1.3g
·对苯乙烯磺酸钠(NaPSS)：0.05g
接下来，添加4g的3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(商品名：LS-3380，由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)和13g苯乙烯(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)，并在室温下将所得混合物搅拌10分钟同时向其中吹入氮气。然后，在油浴中将烧瓶中的乳液加热至70℃。将0.5g过二硫酸钾(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)溶解在离子交换水中，并将所得溶液添加到加热至70℃的乳液中。在70℃下搅拌7小时之后，停止加热，然后搅拌过夜，从而获得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒的分散液。将所得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒标示为PSS-4。
此外，对PSS-4的分散液进行离心分离以收集PSS-4，并丢弃上清液。通过将以下操作重复多次对收集的PSS-4进行清洗：在离子交换水中再分散，然后进行离心分离。
使用粒径分析仪(商品名：Zetasizer，由Malvern Panalytical Ltd制造)通过动态光散射法评估如此获得的PSS-4的平均粒径，并且发现其为153nm。
(PSS-5的制备)
将PSS-4的制备中使用的NaPSS量改为0.3g。除上述之外，以与PSS-4的制备相同的方式制备PSS-5。
使用粒径分析仪(商品名：Zetasizer，由Malvern Panalytical Ltd.制造)通过动态光散射法评估如此获得的PSS-5的平均粒径，并且发现其为93nm。
[实施例1]
将2g的Tween20(由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造)作为表面活性剂添加到PSS-1分散液中，进一步添加0.1mL的X-12-1135(由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)，其为具有羧基的硅烷偶联剂，并在室温下搅拌所得混合物14小时。将由此获得的颗粒标示为PSSX-1。
通过用电子显微镜观察来评估PSSX-1的平均粒径并且发现其为250nm。此外，PSSX-1的粒径变动系数为1.4。
此外，对PSSX-1的分散液进行离心分离以收集PSSX-1，并丢弃上清液。将PSSX-1分散在离子交换水中并进行调节，使得颗粒固体浓度为1.0质量％。
[实施例2]
将实施例1中使用的X-12-1135(由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)的量改变为0.01mL。除了上述以外，进行与实施例1相同的过程，将得到的颗粒标示为PSSX-2。将PSSX-2分散在离子交换水中，从而得到颗粒固体浓度为1.0质量％的分散液。
通过用电子显微镜观察来评估PSSX-2的平均粒径并且发现其为254nm。另外，PSSX-2的粒径变动系数为1.5。
[实施例3]
将实施例1中的X-12-1135(由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)改变为KBP-90(由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)，其为具有氨基的硅烷偶联剂，并且用量为0.01mL。除上述之外，进行与实施例1相同的过程。将所得聚合物细颗粒分散在离子交换水中从而得到颗粒固体浓度为1.0质量％的分散液。
接下来，将溶解在二甲亚砜中的琥珀酸酐以基于分散液为0.1质量％的比例加入所得聚合物细颗粒分散液中，并在室温下搅拌所得混合物14小时，以便对聚合物细颗粒的表面进行改性。将所得颗粒标示为PSSX-3。
通过用电子显微镜观察来评估PSSX-3的平均粒径并且发现其为255nm。另外，PSSX-3的粒径变动系数为1.4。
[实施例4]
将实施例1中的X-12-1135(由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)改变为KBP-64(由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)，其为具有乙二胺的硅烷偶联剂，并且用量为0.01mL。除上述以外进行与实施例1相同的过程，并将所得聚合物细颗粒分散在离子交换水中从而得到颗粒固体浓度为1.0质量％的分散液。
接下来，进行与实施例3中的用羧基改性聚合物细颗粒相同的处理，以便用羧基对PSSX-4表面进行改性。将得到的颗粒标示为PSSX-4。
通过用电子显微镜观察来评估PSSX-4的平均粒径并且发现其为255nm。另外，PSSX-4的粒径变动系数为1.4。
[实施例5至16]
将PSS-2至PSS-5各自用作初始颗粒并与以下混合：0.5M的2-吗啉代乙磺酸(MES，由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造)缓冲溶液(pH7.0)、Tween(注册商标)20(作为表面活性剂，由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造)和离子交换水。将该混合物在室温下搅拌15分钟，然后添加X-12-1135(由Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.制造)，其为具有羧基的硅烷偶联剂，将所得混合物在室温下搅拌过夜。每种材料的用量如表1所示，或达到表1所示的最终浓度。
随后，对所得分散液进行离心分离，并丢弃上清液。通过将以下操作重复多次对收集的颗粒进行清洗：在离子交换水中再分散，然后进行离心分离。将根据实施例5至16的所得颗粒分别标示为PSSX-5至PSSX-16。
[表1]
表1
Figure BDA0003597534370000201
使用粒径分析仪(商品名：Zetasizer，由Malvern Panalytical Ltd制造)通过动态光散射法评估平均粒径。作为结果，PSSX-11的平均粒径为165nm，PSSX-12的平均粒径为171nm，并且PSSX-13的平均粒径为176nm。
(比较例1)
使用免疫诊断用IMMUTEX聚合物颗粒P0113(由JSR Corporation制造，粒径为0.187μm的具有键合到聚苯乙烯颗粒的羧基的聚合物颗粒，下文简称为P0113)作为根据比较例1的颗粒。使用离子交换水将P0113的浓度调节至1.0质量％。
通过用电子显微镜观察来评估P0113的平均粒径并且发现其为190nm。P0113的粒径的变动系数为2.1。
(比较例2)
使用免疫诊断用IMMUTEX聚合物颗粒P0307(由JSR Corporation制造，粒径为0.351μm的具有键合到聚苯乙烯颗粒的羧基的聚合物颗粒，下文简称为P0307)作为根据比较例2的颗粒。使用离子交换水将P0307的浓度调节为1.0质量％。
通过用电子显微镜观察来评估P0307的平均粒径并且发现其为355nm。P0307的粒径的变动系数为2.8。
(参考例1)
在200mL烧瓶中加入90g磷酸盐缓冲溶液(由Kishida Chemical Co.,Ltd制造，pH6.4)，并将0.9g聚乙烯吡咯烷酮K-30(由Kishida Chemical Co.,Ltd制造，分子为40000重量)溶解在其中。接下来，添加0.4g的3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(由Shin-EtsuChemical Co.,Ltd制造，LS-3380)和11.6g苯乙烯(由Kishida Chemical Co.,Ltd制造)，并在室温下将所得混合物搅拌10分钟同时向其中吹入氮气。然后，在油浴中将烧瓶中的乳液加热至70℃。将通过在15mL水中溶解0.3g过二硫酸钾(由Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造)制备的溶液添加到加热至70℃的乳液中。在70℃下搅拌6小时后，使温度恢复至室温，从而得到聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒的分散液。将所得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒标示为PSS-7。
此外，对PSS-7的分散液进行离心分离以收集PSS-7，并丢弃上清液。将收集的PSS-7再分散在离子交换水中，然后再次进行离心分离。将使用离心机收集PSS-7和使用离子交换水再分散重复4次。
对如此得到的PSS-7分散液进行调节使得浓度为1.0质量％。
通过用电子显微镜观察来评估PSS-7的平均粒径并且发现其为140nm。另外，PSS-7的粒径的变动系数为2.0。
(参考例2)
向200mL烧瓶中加入90g磷酸缓冲溶液(由Kishida Chemical Co.,Ltd制造，pH9.0)，并将0.4g聚乙烯吡咯烷酮K-30(由Kishida Chemical Co.,Ltd制造，分子量为40000)溶解在其中。接下来，添加7.2g的3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(由Shin-EtsuChemical Co.,Ltd.制造，LS-3380)和4.8g苯乙烯(由Kishida Chemical Co.,Ltd制造)，并在室温下将所得混合物搅拌10分钟同时向其中吹入氮气。然后，在油浴中将烧瓶中的乳液加热至80℃。将通过在15mL水中溶解0.3g过二硫酸钾(由Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造)制备的溶液添加到加热至80℃的乳液中。在80℃下搅拌4小时后，将温度恢复至室温，从而得到聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒的分散液。将所得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒标示为PSS-8。
此外，对PSS-8的分散液进行离心分离以收集PSS-8，并丢弃上清液。将收集的PSS-8再分散在离子交换水中，然后再次进行离心分离。将使用离心机收集PSS-8和使用离子交换水再分散重复4次。
对如此得到的PSS-8分散液进行调节使得浓度为1.0质量％
通过用电子显微镜观察来评估PSS-8的平均粒径并且发现其为295nm。另外，PSS-8的粒径的变动系数为3.0。
(参考例3)
将PSS-1分散液稀释到0.1质量％，以基于分散液为0.05质量％的比例添加氨基丙基三甲氧基硅烷，在室温下搅拌所得混合物14小时以便用氨基对PSS-1的表面进行改性。将如此获得的颗粒标示为PSSZ-1。
通过用电子显微镜观察来评估PSSZ-1的平均粒径并且发现其为255nm。另外，PSSZ-1的粒径的变动系数为1.5。
(参考例4)
将PSS-1分散液稀释至0.1质量％，以2质量％的量添加28质量％的氨水，并以基于分散液为0.05质量％的比例添加巯基丙基三甲氧基硅烷。然后，在室温下将所得混合物搅拌14小时以便用硫醇基对PSS-1的表面进行改性。将如此获得的颗粒标示为PSSZ-2。
通过用电子显微镜观察来评估PSSZ-2的平均粒径并且发现其为262nm。另外，PSSZ-2的粒径的变动系数为1.7。
(参考例5)
将PSS-1分散液稀释至0.1质量％，以基于分散液为0.05质量％的比例添加氨基丙基三甲氧基硅烷，并将所得混合物在室温下搅拌14小时，以便用氨基对PSS-1的表面进行改性。此外，进行与实施例3中用羧基改性聚合物细颗粒相同的处理，以便对颗粒的表面进行羧基改性。将如此获得的颗粒标示为PSSZ-3。
通过用电子显微镜观察来评估PSSZ-3的平均粒径并且发现其为255nm。此外，PSSZ-3的粒径的变动系数为1.5。
(参考例6)
将PSS-1分散液稀释至0.1质量％，并添加Si标记的融合蛋白A(由SiliconbioInc.制造，一种抗体结合蛋白(蛋白A)与结合到硅醇基团的肽的融合蛋白)。然后，将Si标记的融合蛋白A固定在PSS-1表面上。将如此获得的颗粒标示为PSSZ-4。
通过用电子显微镜观察来评估PSSZ-4的平均粒径并且发现其为253nm。另外，PSSZ-4的粒径的变动系数为1.5。
(参考例7)
向PSS-1分散液中分别以0.5质量％、0.5质量％和2质量％的比例(基于分散液计)添加3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷、甘氨酸和28质量％的氨水，并在室温下搅拌所得混合物14小时。然后，对聚合物细颗粒的表面进行缩水甘油基改性。将如此获得的颗粒标示为PSSZ-5。
通过用电子显微镜观察来评估PSSZ-5的平均粒径并且发现其为260nm。另外，PSSZ-5的粒径的变动系数为2.1。
(参考例8)
向PSS-1分散液中以基于分散液为0.4质量％的比例添加三甲氧基丙基丁二酸酐的二甲亚砜溶液，并在室温下搅拌所得混合物14小时，以对PSS-1的表面进行二羧基改性。将如此获得的颗粒标示为PSSZ-6。
通过用电子显微镜观察来评估PSSZ-3的平均粒径并且发现其为265nm。另外，PSSZ-3的粒径的变动系数为1.8。
(参考例9)
将实施例1中的X-12-1135(由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)改变为X-12-967C(由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)，其为具有丁二酸酐的硅烷偶联剂，且用量为0.01mL。除上述之外，进行与实施例1中相同的过程，并将所得颗粒标示为PSSX-17。将PSSX-17分散在离子交换水中以获得颗粒固体浓度为1.0质量％的分散液。
通过用电子显微镜观察来评估PSSX-17的平均粒径并且发现其为252nm。另外，PSSX-17的粒径的变动系数为1.5。
(参考例10)
如表1所示改变PSS-2制备中使用的MES缓冲溶液的浓度和每种材料的量。除上述之外，以与PSS-2的制备中相同的方式获得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒。将所得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒分别标示为PSS-9至17。
此外，使用粒径分析仪(商品名：Zetasizer，由Malvern Panalytical Ltd制造)通过动态光散射获得的PSS-9至17的平均粒径的评估结果如表2所示。
[表2]
表2
Figure BDA0003597534370000241
(参考例11)
将PSS-3的制备中使用的每种材料的量改变为如下。
·50mM磷酸盐缓冲溶液(Kishida Chemical Co.,Ltd.，pH 7.4)：39g
·聚乙烯吡咯烷酮K-30(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造，分子量为40000)：0g(未使用)
·N-乙烯基-2-吡咯烷酮和丙烯酸的无规共聚物(由Polymer Source,Inc.制造，分子量为60000，N-乙烯基-2-吡咯烷酮分子数与丙烯酸分子数之比＝4:6，下文简称为PVP-PAA)：0.33g
·3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(商品名：LS-3380，由Shin-EtsuChemical Co.,Ltd.制造)：1g
·苯乙烯(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)：3g
·过二硫酸钾(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)：0.125g
除上述之外，以与PSS-3的制备中相同的方式获得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒。将得到的聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒标示为PSS-18。
使用粒径分析仪(商品名：Zetasizer，由Malvern Panalytical Ltd制造)通过动态光散射法评估如此获得的PSS-18的平均粒径并且发现其为203nm。
(参考例12)
将PSS-4的制备中使用的MES缓冲溶液的浓度改变为50mM。除上述之外，以与PSS-4的制备中相同的方式制备PSS-19。
使用粒径分析仪(商品名：Zetasizer，由Malvern Panalytical Ltd制造)通过动态光散射法评估如此获得的PSS-19的平均粒径并且发现其为138nm。
(参考例13)
将PSS-4的制备中使用的NaPSS量改变为0.1g。除上述之外，以与PSS-4的制备中相同的方式制备PSS-20。
使用粒径分析仪(商品名：Zetasizer，由Malvern Panalytical Ltd制造)通过动态光散射法评估如此获得的PSS-20的平均粒径并且发现其为126nm。
PSSX-11(平均粒径165nm)、PSSX-12(平均粒径171nm)和PSSX-13(平均粒径176nm)的粒径均大于PSS-4颗粒的粒径(粒径153nm)。另外还表现出以下趋势：随着硅烷偶联剂添加量的增加，粒径增大。即，可通过调节硅烷偶联剂的量来调节覆盖颗粒的层的厚度。
通过在测量颗粒溶液的电导率时进行酸碱滴定，可从所得滴定曲线计算出颗粒中的羧基量。根据该方法，对PSSX-5颗粒、PSSX-6颗粒、PSSX-7颗粒、PSSX-11颗粒、PSSX-12颗粒和PSSX-13颗粒进行了评估。结果如表3所示。
[表3]
表3
颗粒 羧基含量(nmol/mg)
PSSX-5 24
PSSX-6 68
PSSX-7 110
PSSX-11 29
PSSX-12 61
PSSX-13 132
从表3中的结果可以看出，可以通过调节硅烷偶联剂的量来调节颗粒中的羧基量。
<抗体结合实施例1>
使抗C反应蛋白(下文简称为CRP)抗体结合到PSSX-1、PSSX-2、PSSZ-3、PSSZ-5、PSSZ-6、PSSX-17和PSS-2，如下所示。
首先，将各颗粒分散液以15000rpm(20400g)离心15分钟以使颗粒沉淀。除去上清液，然后将颗粒的球团再分散在MES缓冲溶液中，并向其中加入水溶性碳二亚胺(WSC)。此外，加入N-羟基丁二酰亚胺。将颗粒分散液在室温下搅拌30分钟，然后通过离心分离收集颗粒。将收集的颗粒用MES缓冲溶液洗涤，然后再次分配在MES缓冲溶液中，并添加抗CRP抗体，使得最终浓度为100μg/mL。在室温下搅拌180分钟后，通过离心收集颗粒。用三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲溶液对收集的颗粒进行充分清洗，从而获得与抗CRP抗体结合的颗粒。将获得的与CRP抗体结合的颗粒分别标示为PSSX-1-Ab、PSSX-2-Ab、PSSZ-3-Ab、PSSZ-5-Ab、PSSZ-6-Ab、PSSX-17-Ab和PSS-2-Ab。
通过BCA分析测量确认了添加抗体的缓冲溶液中的抗体浓度降低，从而确认了抗体与每个所得颗粒的结合。发现每个颗粒结合了约100至500个抗体。所得颗粒均稳定地分散在缓冲溶液中，并且无需用BSA后涂覆。
<抗体结合实施例2>
将PSSX-6、PSSX-7、PSSX-11、PSSX-12和PSSX-13的分散液(具有1.0质量％浓度的溶液，10mg/mL)各自以0.1mL(颗粒：1mg)的量转移到各自的微管(体积为1.5mL)中。向其中添加0.12mL活化缓冲溶液(25mM MES缓冲溶液，pH 6.0)，并将每种所得混合物在4℃和15000rpm(20400g)下离心20分钟。离心后，使用移液器丢弃上清液。随后，添加0.12mL活化缓冲溶液，使用超声波清洗机(商品名：MODEL VS-100III AS ONE三频超声波清洗机，ASONE Corporation制造，28kHz)通过超声波进行分散。接下来，将所得分散液在4℃和15000rpm(20400g)下离心20分钟。使用移液器丢弃上清液，添加0.12mL活化缓冲溶液，并通过超声波进行分散。随后，将所得分散液在4℃和15000rpm(20400g)下离心20分钟，并使用移液器丢弃上清液。随后，添加WSC溶液(50mg WSC溶解在1mL活化缓冲溶液中)和N-羟基硫代丁二酰亚胺(Sulfo NHS)溶液(50mg Sulfo NHS溶解在1mL活化缓冲溶液中)，各自添加量为60μL。添加后，通过超声波进行分散。此外，将所得分散液在室温下搅拌30分钟以便将颗粒的羧基转化为活性酯。
随后，在4℃和15000rpm(20400g)下将分散液离心20分钟，并使用移液器丢弃上清液。添加0.2mL固定缓冲溶液(25mMMES缓冲溶液，pH 5.0)，并通过超声波进行分散。将所得分散液在4℃和15000rpm(20400g)下离心20分钟，并使用移液器丢弃上清液。以每mg颗粒50μL的量添加固定缓冲溶液，并通过超声波分散其中羧基被激活的颗粒。
使用固定缓冲溶液稀释抗人CRP抗体(多克隆抗体)，使得浓度为25μg/50μL、50μg/50μL、100μg/50μL或200μg/50μL(称为抗体溶液)。将50μL每种浓度的抗体溶液添加到50μL的其中羧基被激活的颗粒溶液(包括1mg颗粒)中，并通过超声波分散颗粒。如表4所示，用于结合的抗体量分别为25、50、100和200μg/mg颗粒。在室温下搅拌试管60分钟以便将抗体固定到颗粒的羧基。随后，将分散液在4℃和15000rpm(20400g)下离心20分钟，并使用移液器丢弃上清液。
添加0.24mL的包括三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)的活性酯失活缓冲溶液(1M Tris缓冲溶液，pH 8.0，包括0.1％的Tween(注册商标)20)并通过超声波进行分散。将所得分散液在室温下搅拌1小时以便将Tris结合到剩余的活化酯，然后在4℃下静置过夜。
随后，将分散液在4℃和15000rpm(20400g)下离心20分钟，并使用移液器丢弃上清液。添加0.2mL洗涤/储备缓冲溶液(10mM2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸(HEPES)缓冲溶液，pH 7.9)，并通过超声波进行分散。将使用0.2mL洗涤/储存缓冲溶液的洗涤操作重复两次，然后添加1.0mL洗涤/储存缓冲溶液，并通过超声波进行分散。在上述步骤中几乎没有观察到颗粒损失，因此抗体敏化颗粒浓度最终为0.1质量％(1mg/mL)。将颗粒储存在冰箱中并在使用时通过超声波再分散。
使用粒径分析仪(商品名：Zetasizer，由Malvern Panalytical Ltd.制造)通过动态光散射法评估所得抗体敏化颗粒的平均粒径。所得抗体敏化颗粒的类型和平均粒径如表4所示。
(抗体敏化效率的测量)
通过蛋白质定量化确认抗体敏化(固定到)抗体结合实施例2中制备的抗体敏化颗粒。
具体地，抗体敏化颗粒与BCA试剂反应。首先，将每种抗体敏化颗粒的25μL(25μg颗粒量)分散液(0.1质量％溶液)进行等分。将7mL蛋白质分析BCA试剂盒(由Wako PureChemical Industries，Ltd.制造)的液体A和140μL其液体B混合，以获得液体AB。将200μL液体AB添加到25μL分散液中，并使所得混合物在60℃下静置30分钟。随后，将静置后的溶液在4℃和15000rpm(20400g)下离心5分钟，并使用移液器收集上清液。使用多模式酶标仪(商品名：SynergyMX，由BioTek Instruments，Inc.制造)测量收集溶液对波长为562nm的光的吸光度。分别地，提供多个标准样品，通过将抗体溶解在10mM HEPES中使得浓度在0至200μg/mL范围内来制备所述标准样品。也类似地测量通过使提供的标准样品与BCA试剂反应获得的溶液对波长为562nm的光的吸光度以便制作标准曲线。使用所获得的标准曲线，确定与每个抗体敏化颗粒结合的抗体的量。
通过将上述测定的抗体量除以测量用抗体敏化颗粒的质量来测定抗体敏化颗粒的抗体敏化量(每单位质量的抗体敏化颗粒固定的抗体量(μg/mg))。此外，由用于结合的抗体的量和抗体敏化量确定抗体敏化效率。
结果如表4所示。
从抗体敏化效率的测量结果可以发现，随着硅烷偶联剂的用量增加，抗体敏化效率增加。关于此的一个原因是，随着硅烷偶联剂的用量增加，颗粒表面上的羧基量增加，并且用于固定抗体的点数增加。
[表4]
表4
Figure BDA0003597534370000291
<抗体结合实施例3>
将抗体结合到实施例8至10中制备的PSSX-8、PSSX-9和PSSX-10，以及参考例11中制备的PSS-3和PSS-18。
将抗体结合实施例2中的抗人CRP抗体(多克隆抗体)改变为两种抗人前列腺特异性抗原(下文简称为PSA)抗体(单克隆抗体)。除上述之外，进行与抗体结合实施例2中相同的过程，以获得分别具有上述抗体的两种抗体敏化颗粒。
对于所获得的两种抗体敏化颗粒中的每一种，根据上述方法测量抗体敏化效率。另外，将具有各自抗体的两种抗体敏化颗粒以等量混合。得到的抗体敏化颗粒和抗体敏化效率测量结果如表5所示。
所有颗粒均能以高抗体敏化效率使抗体敏化。
[表5]
表5
Figure BDA0003597534370000301
<抗体结合实施例4>
将抗CRP抗体结合到根据比较例1的颗粒和根据比较例2的颗粒。将比较例1和2中制备的每种分散液以15000rpm(20400g)离心20分钟以使颗粒沉淀。除去上清液，然后将颗粒的球团再分散在MES缓冲溶液中，并向其中加入WSC溶液。此外，添加抗CRP抗体，使得最终浓度为100μg/mL。将所得混合物在室温下搅拌180分钟，然后向其中添加BSA溶液。然后，通过离心分离收集涂有BSA的颗粒。使用磷酸盐缓冲溶液洗涤收集的颗粒以获得与涂有BSA的抗CRP抗体结合的颗粒。
通过用BCA分析测量加入抗体的缓冲溶液的抗体浓度的降低量来确认抗体与所得颗粒的结合。结果发现每个颗粒结合约500个抗体。
在抗体结合到颗粒后，立即目视确认颗粒凝集和沉淀。与抗体结合的颗粒凝集和沉淀，因此不能用于评估胶乳凝集反应。
<抗体结合实施例5>
将抗CRP抗体结合到参考例4中制备的PSSZ-2。为了获得硫醇反应性抗体，将EMCS(6-马来酰亚胺基己酸N-琥珀酰亚胺酯)添加到抗CRP抗体溶液中，从而将马来酰亚胺基引入抗体中。将PSSZ-2分散液以15000rpm(20400g)离心15分钟使PSSZ-2沉淀。去除上清液，然后使用磷酸盐缓冲溶液再分配PSSZ-2的球团，并向其中添加预马来酰亚胺化的抗CRP抗体。在室温下搅拌180分钟后，通过离心分离收集颗粒。用磷酸盐缓冲溶液充分洗涤收集的颗粒，以获得与抗CRP抗体结合的细颗粒。将与CRP抗体结合的所得颗粒标示为PSSZ-2-Ab。
通过BCA分析测量确认添加抗体的缓冲溶液中的抗体浓度降低来确认抗体与PSSZ-2-Ab的结合。发现每个颗粒结合约100至500个抗体。PSSZ-2-Ab稳定地分散在缓冲溶液中，无需后涂BSA。
<抗体结合实施例6>
将抗CRP抗体结合到参考例6中制备的PSSZ-4。将PSSZ-4分散液以15000rpm(20400g)离心20分钟以使PSSZ-4沉淀。去除上清液，然后在Tris缓冲溶液中再分配PSSZ-4的球团，并向其中添加抗CRP抗体，使终浓度为200μg/mL。在4℃下搅拌16小时后，通过离心收集颗粒。用Tris缓冲溶液充分洗涤收集的颗粒，以获得与抗CRP抗体结合的颗粒。将与CRP抗体结合的所得颗粒标示为PSSZ-4-Ab。
通过BCA分析测量确认添加抗体的缓冲溶液中的抗体浓度降低来确认抗体与PSSZ-4-Ab的结合。结果发现，每个颗粒结合了约500个抗体。PSSZ-4-Ab稳定地分散在缓冲溶液中，无需后涂BSA。
<非特异性凝集抑制的评估>
将60μL缓冲溶液和4μL人血清溶液添加到30μL的PSS-1颗粒分散液(经调节以具有1.0质量％浓度)以及30μL的实施例1至4、比较例1和2以及参考例1至9中制备的每种颗粒分散液，并将所得分散液在37℃下保温5分钟。在保温前后测量波长为572nm的光的吸光度，测量保温前后吸光度的变化量三次，并计算平均值。当吸光度的变化量小于0.1时，认为非特异性凝集受到抑制，而当吸光度的变化量为0.1以上时，认为发生非特异性凝集。结果如表6所示。
另外，如表6所示，发现在实施例1-4和参考例1-9中制备的颗粒没有凝集，并且可以稳定地分散在人血清中。另一方面，在根据比较例1和2的颗粒中，在与人血清的反应中发生凝集反应(非特异性凝集)。认为这是由于蛋白质在细颗粒表面的非特异性吸附，从而通过吸附的蛋白质在颗粒之间发生交联。当根据比较例1和2的颗粒预先用BSA后涂时，这些颗粒可以稳定地分散在人血清中而不发生凝集。认为这是因为白蛋白吸附在聚苯乙烯颗粒的表面上，因此不能吸附来源于人血清的蛋白质。
此外，还对PSS-2、PSS-3和PSS-9至PSS-18的分散液进行相同的非特异性凝集抑制评估。结果，在任一种所述聚合物细颗粒分散液中，吸光度的变化量均小于0.1，并且没有发生非特异性凝集。
[表6]
表6
Figure BDA0003597534370000321
<乳胶凝集反应的评估1抗体敏化颗粒对于CRP的抗原识别能力的评估>
制备在抗体结合实施例1、5和6中制备的抗体敏化颗粒PSSX-1-Ab、PSSX-2-Ab、PSSZ-2-Ab至PSSZ-6-Ab和PSSX-17-Ab的0.1质量％分散液，并进行乳胶凝集反应。
将人血清源性CRP(由Sigma Aldrich制造)和每种抗体敏化颗粒分散液混合，并测量混合前后对波长为572nm的光的吸光度。使用紫外-可见分光光度计(商品名：GeneQuant1300，由GE Healthcare制造)测量吸光度，将样品注入塑料样品池中，并以10mm的光程长度测量。如果抗体敏化颗粒上的抗CRP抗体能够捕获CRP(其为抗原)，则通过CRP发生细颗粒之间的凝集反应。此时，由于发生透射率降低，观察到吸光度增加。
首先，将1μL的32mg/LCRP和50μL磷酸盐基缓冲溶液混合以制备CRP溶液。随后，将其中51μL的CRP溶液被添加到50μL抗体敏化颗粒分散液中的反应溶液以及其中51μL缓冲溶液代替CRP溶液被添加到50μL抗体敏化颗粒分散液中的反应溶液在37℃的温度下处理5分钟。测量处理前后各反应溶液的吸光度变化率(％)三次，并计算平均值。结果如表7所示。
从表7所示的结果可以清楚地看出，添加CRP时发生因抗原-抗体反应引起的凝集反应，并且确认与添加缓冲液代替CRP溶液时(没有CRP)的变化率相比存在差异。
从表7可以看出，通过对乳胶凝集反应的评估可以确认，本评估中使用的抗体敏化颗粒识别CRP，并且颗粒彼此凝集。也就是说，发现在实施例1和2以及参考例4-9中制备的颗粒可以在不使用BSA的情况下结合抗体，并且结合的抗体具有抗原识别能力。
由表6和表7所示的结果可知，可以在不使用BSA情况下获得具有能够结合配体(如抗体)的支架但却具有受抑制的血清蛋白质的非特异性吸附的颗粒。
[表7]
表7
Figure BDA0003597534370000341
<乳胶凝集反应的评估2抗体敏化颗粒对CRP的敏感性评估>
通过乳胶免疫凝集法评估在抗体结合实施例2中制备的抗体敏化颗粒的敏感性。具体地，使抗体敏化颗粒与抗原反应以形成免疫复合物的凝集物，用光照射凝集物，并使用吸收计测量因散射引起的照射光的衰减(吸光度)。凝集物的比例随试样中包括的抗原量而增加，并且吸光度也增加。在敏感性评估中，当使用包括具有预定浓度的CRP的溶液时，吸光度的增加量(记作ΔOD×10000)合意地为大。使用紫外-可见分光光度计(商品名：GeneQuant 1300，由GE Healthcare制造)测量吸光度，将样品注入塑料样品池中，并以10mm的光程长度测量。测量方法具体如下所示。
将1μL的CRP标准溶液(CRP浓度为5-160μg/mL)和50μL的R1缓冲溶液(磷酸盐系缓冲溶液)在塑料样品池中混合，并在37℃加热5分钟。将50μL的抗体敏化颗粒(颗粒浓度为0.1质量％，10mM HEPES，pH 7.9，0.01质量％Tween(注册商标)20)的分散溶液加入51μL的包括CRP标准溶液的R1缓冲溶液中。然后，迅速用移液管吸取所得混合物，同时注意不使气泡进入其中，来制备用于测量的样品。读取样品对波长为572nm的光的吸光度，并将其标示为Abs1。将样品在37℃加热5分钟，然后读取样品对波长为572nm的光的吸光度，并将其标示为Abs2。确定从Abs2减去Abs1得到的值，并将上述值乘以10000所得值定义为ΔOD×10000值。为了评估非特异性反应，还类似地测定使用以下溶液制备的样品的ΔOD×10000值：该溶液是通过将1μL不含CRP的血清溶液(CRP浓度为0μg/mL)和50μL的R1缓冲溶液以及抗体敏化颗粒的分散溶液混合而得到的。
结果如表8所示。对于用于本评估的所有抗体敏化颗粒，观察到ΔOD×10000随着CRP浓度的增加而增加。发现这是抗体敏化颗粒与CRP(其为抗原)结合从而形成颗粒凝集物的结果，并且这些颗粒作为乳胶免疫凝集方法中所用的颗粒。另外，发现当CRP浓度为0μg/mL时用于本评估的抗体敏化颗粒的ΔOD×10000值为100以下，并且没有发生非特异性凝集。此外，表明用于本评估的抗体敏化颗粒通过增加使颗粒敏化的抗体的量来增加ΔOD×10000的值。
[表8]
表8
Figure BDA0003597534370000351
<乳胶凝集反应的评估3抗体敏化颗粒对人PSA的敏感性评估>
对于在抗体结合实施例3中制备的抗体敏化颗粒，根据乳胶凝集反应的评估2中所述的方法评估对PSA的敏感性。
具体地，将16μL的PSA标准溶液(PSA浓度为91.7ng/mL)和60μL的R1缓冲溶液在塑料样品池中混合，并在37℃加热5分钟。将30μL抗体敏化颗粒的分散溶液(颗粒浓度为0.2质量％)添加到包含PSA标准溶液的R1缓冲溶液(76μL)中，迅速用移液管吸取所得混合物，同时注意不使气泡进入其中，来制备用于测量的样品。读取样品对波长为572nm的光的吸光度，并将其标示为Abs3。将样品在37℃加热5分钟，然后读取样品对波长为572nm的光的吸光度，并将其标示为Abs4。确定从Abs4减去Abs3得到的值，并将上述值乘以10000所得值定义为ΔOD×10000值。为了评估非特异性反应，还类似地测定使用以下溶液制备的样品的ΔOD×10000值：该溶液是通过混合1μL的不含PSA的血清溶液(CRP浓度为0ng/mL)和50μL的R1缓冲溶液以及抗体敏化颗粒的分散溶液而得到的。
结果如表9所示。对于用于本评估的所有抗体敏化颗粒，在PSA存在下观察到ΔOD×10000的增加。发现这是抗体敏化颗粒与PSA(其为抗原)结合从而形成颗粒凝集物的结果，并且这些颗粒作为乳胶免疫凝集方法中使用的颗粒。另外，发现当PSA浓度为0ng/mL时用于本评估的抗体敏化颗粒的ΔOD×10000值为100以下，并且没有发生非特异性凝集。
[表9]
表9
Figure BDA0003597534370000361
[实施例17]
PSSX-1对白蛋白的非特异性凝集抑制性能的评估
作为对实施例1中获得的PSSX-1的非特异性凝集抑制性能的评估，确认对于白蛋白的非特异性凝集。首先，混合50μL的0.1质量％PSSX-1水分散体和50μL的0.05％或0.5％的牛血清白蛋白溶液(牛血清白蛋白溶解在磷酸盐缓冲盐水中)，并将所得混合物在37℃保温5分钟。在保温前后测量572nm处的吸光度，并测量在保温前后的吸光度的变化量。当对于白蛋白发生非特异性凝集时，吸光度的变化量×10000的值为1000以上。
吸光度变化量×10000的数值如下所示。
0.05％白蛋白溶液：20
0.5％白蛋白溶液：80
从以上结果可以清楚，PSSX-1不会被白蛋白凝集。
[实施例18]
PSSX-1对人血清球蛋白组分的非特异性凝集抑制性能的评价
作为对实施例1中得到的PSSX-1的非特异性凝集抑制性能的评估，确认了对人血清球蛋白组分的非特异性凝集。首先，将球蛋白浓度为0.48mg/mL或48mg/mL的球蛋白溶液16μL添加到60μL磷酸盐缓冲溶液中，将所得混合物在37℃下培养5分钟。然后，向其中添加30μL的0.1质量％的PSSX-1水分散体，并将混合物在37℃下保温5分钟。在保温前后测量572nm处的吸光度，并测量保温前后的吸光度的变化量。当人血清球蛋白组分发生非特异性凝集时，吸光度变化量×10000的值为1000以上。
吸光度变化量×10000的值如下所示。
球蛋白浓度为0.48mg/mL:0
球蛋白浓度为48mg/mL:60
从以上结果可以看出，PSSX-1不会被人血清球蛋白组分凝集。
[实施例19]
PSSX-1对人血清纤维蛋白的非特异性凝集抑制性能的评估
作为对实施例1中得到的PSSX-1的非特异性凝集抑制性能的评估，确认了对人血清纤维蛋白的非特异性凝集。首先，将50μL的0.1质量％的PSSX-1水分散液和50μL的人血清纤维蛋白溶液(在使用才前制备)混合，并将所得混合物在37℃保温5分钟。作为保温后目视观察颗粒凝集的结果，没有观察到颗粒凝集。
从以上结果可以清楚，PSSX-1不会被人血清纤维蛋白凝集。
[实施例20]
具有不同粒径的颗粒的合成与评估
如表10所示改变PSS-2和PSS-4制备中使用的每种材料的量，除上述之外，以与PSS-2和PSS-4中的相同方式获得聚苯乙烯-氧化硅混合细颗粒。将得到的颗粒分别标示为PSSX-18至PSSX-33。颗粒的粒径和分散性如表10所示。通过改变配方，可将粒径控制在93.1nm至423.2nm的范围内。当粒径超过340nm时，观察到颗粒在水中的分散性趋于劣化。
[表10]
Figure BDA0003597534370000391
[实施例21]
颗粒的COOH量的测量以及非特异性反应抑制的评估
对实施例8中获得的PSSX-23、PSSX-24、PSSX-26至PSSX-33的颗粒表面COOH量以及颗粒的非特异性反应抑制能力进行评估。结果如表11所示。通过改变配方，可将COOH的量控制在18nmol/mg至334nmol/mg。由于向这些颗粒溶液中添加人血清，吸光度的变化量小于1000，这表明不存在非特异性反应，因此没有观察到人血清的非特异性反应。
[表11]
表11
Figure BDA0003597534370000401
本发明不限于上述实施方案，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改和变化。因此，随附以下权利要求以公开本发明的范围。
本申请要求基于2019年10月15日提交的日本专利申请第2019-188848号的优先权，通过引用将其公开内容整体并入本文。

Claims (37)

1.一种制造颗粒的方法，包括：
第一步,将自由基聚合性的单体、具有与烷氧基键合的硅原子且具有自由基聚合性的有机硅烷化合物、自由基聚合引发剂、水溶性聚合物和水性介质混合以制备乳液；和
第二步，在第一步之后添加反应性化合物，
其中所述反应性化合物由下式(1)表示：
[化学式1]
Figure FDA0003597534360000011
其中R1和R2各自表示具有1个以上且30个以下的碳原子的直链或支化烷基，其被至少一个羧基或至少一个氨基取代，且任选地包括-NH-CO-、-NH-、-O-、-S-或-CO-。
2.根据权利要求1所述的制造颗粒的方法，其中式(1)中的R1和R2中的至少任一个具有至少一个羧基。
3.根据权利要求1或2所述的制造颗粒的方法，进一步包括在所述第一步之后加热所述乳液。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制造颗粒的方法，其中所述自由基聚合性的单体是不含硅原子的单体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制造颗粒的方法，其中所述自由基聚合性的单体是选自苯乙烯系单体、丙烯酸酯系单体和甲基丙烯酸酯系单体中的至少一种。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制造颗粒的方法，其中所述自由基聚合性的单体是选自苯乙烯、丁二烯、乙酸乙烯酯、氯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯腈和丙烯酸甲酯中的至少一种。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制造颗粒的方法，其中在所述第一步中，进一步混合对苯乙烯磺酸盐来制备乳液。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制造颗粒的方法，其中所述水溶性聚合物是选自聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯吡咯烷酮-聚丙烯酸共聚物中的至少一种。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制造颗粒的方法，其中所述有机硅烷化合物是选自下列中的至少一种：乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、对苯乙烯基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷和3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的制造颗粒的方法，其中所述水性介质的pH为6以上且9以下。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的制造颗粒的方法，其中式(1)中的R1和R2中的至少一个具有下式(2)所示的结构：
[化学式2]
Figure FDA0003597534360000031
其中Z表示具有1以上且10以下碳原子的直链或支化、饱和或不饱和烷基。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的制造颗粒的方法，其中所述式(1)中的R1和R2中的至少一个由下式(3)表示：
[化学式3]
Figure FDA0003597534360000032
13.根据权利要求1-12中任一项所述的制造颗粒的方法，包括在所述第二步之后添加配体。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的制造颗粒的方法，其中通过权利要求1-13中任一项所述的方法制造的颗粒的平均粒径为100nm以上且400nm以下，并且所述颗粒的粒径的变动系数为5以下。
15.一种制造检验试剂的方法，包括将通过权利要求1-14中任一项所述的方法制造的颗粒分散在分散介质中。
16.一种包含共聚物的颗粒，所述共聚物包含由下式(I)表示的重复单元和由下式(II)表示的重复单元，并且具有由下式(I I I)表示的结构：
[化学式4]
Figure FDA0003597534360000041
[化学式5]
Figure FDA0003597534360000042
[化学式6]
Figure FDA0003597534360000043
其中在式(I I)中，A1至A3各自独立地为-H、-CH3、-CH2CH3和通过-O-与式(II)中的Si键合的键中的任一种，
在式(III)中，X1-X4各自独立地表示：经由O与式(III)所示的相邻结构所具有的Si的键、和与式(II)中的与Si键合的O的键、或羟基，由式(III)表示的结构单元中的至少一个具有与所述共聚物的键，并且R3和R4中的至少任一个表示具有1个以上且30个以下的碳原子的直链或支化烷基，其被至少一个羧基或至少一个氨基取代，且任选地包括-NH-CO-、-NH-、-O-、-S-或-CO-。
17.根据权利要求16所述的颗粒，其中所述共聚物进一步包含由下式(IV)表示的重复单元：
[化学式7]
Figure FDA0003597534360000051
其中Y是H、Na和K中的任一个。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的颗粒，其中式(III)中的R3和R4中的至少一个由下式(3)表示：
[化学式8]
Figure FDA0003597534360000052
19.一种颗粒，由以下步骤制造：
第一步,将自由基聚合性的单体、具有与烷氧基键合的硅原子且具有自由基聚合性的有机硅烷化合物、自由基聚合引发剂、水溶性聚合物和水性介质混合以制备乳液；和
第二步，在第一步之后添加反应性化合物，
其中所述反应性化合物由下式(1)表示：
[化学式9]
Figure FDA0003597534360000053
其中R1和R2各自表示具有1个以上且30个以下的碳原子的直链或支化烷基，其被至少一个羧基或至少一个氨基取代，且任选地包括-NH-CO-、-NH-、-O-、-S-或-CO-。
20.根据权利要求19所述的颗粒，其中式(1)中的R1和R2中的至少任一个具有至少一个羧基。
21.根据权利要求19或20所述的颗粒，其中式(1)中的R1和R2中的至少一个具有由下式(2)表示的结构：
[化学式10]
Figure FDA0003597534360000061
其中Z表示具有1以上且10以下碳原子的直链或支化、饱和或不饱和的烷基。
22.根据权利要求19或20所述的颗粒，其中式(4)中的R3和R4中的至少一个具有由下式(3)表示的结构：
[化学式11]
Figure FDA0003597534360000062
23.根据权利要求19-22中任一项所述的颗粒，其中所述自由基聚合性的单体是不含硅原子的单体。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的颗粒，其中所述自由基聚合性的单体是选自苯乙烯系单体、丙烯酸酯系单体和甲基丙烯酸酯系单体中的至少一种。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的颗粒，其中所述自由基聚合性的单体是选自苯乙烯、丁二烯、乙酸乙烯酯、氯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯腈和丙烯酸甲酯中的至少一种。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的颗粒，其中在所述第一步中，进一步混合对苯乙烯磺酸盐来制备所述乳液。
27.根据权利要求19-26中任一项所述的颗粒，其中所述水溶性聚合物是选自聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯吡咯烷酮-聚丙烯酸共聚物中的至少一种。
28.根据权利要求19-27中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒具有一个或多个由下式(4)表示的结构单元：
[化学式12]
Figure FDA0003597534360000071
其中各个X独立地表示经由O与式(3)所示的相邻结构所具有的Si的键、与由乳液制备的颗粒的核的键、或羟基，并且由式(4)表示的结构单元中的至少一个具有与核的键，和
R3和R4中的至少任何一个表示具有1个以上且30个以下的碳原子的直链或支化烷基，其被至少一个羧基或至少一个氨基取代，且任选地包括-NH-CO-、-NH-、-O-、-S-或-CO-。
29.根据权利要求28所述的颗粒，其中式(4)中的R3和R4中的至少一个具有由下式(2)表示的结构：
[化学式13]
Figure FDA0003597534360000072
其中Z表示具有1个以上且10个以下碳原子的直链或支化、饱和或不饱和的烷基。
30.根据权利要求28所述的颗粒，其中式(4)中的R3和R4中的至少一个具有由下式(3)表示的结构：
[化学式14]
Figure FDA0003597534360000081
31.一种亲和颗粒，其含有权利要求19-30中任一项所述的颗粒以及与所述反应性化合物结合的配体。
32.根据权利要求31所述的亲和颗粒，其中所述配体是抗体、抗原和核酸中的任一种。
33.一种用于体外诊断的检验试剂，其含有权利要求31或32所述的亲和颗粒以及用于分散所述亲和颗粒的分散介质。
34.根据权利要求33所述的检验试剂，其中所述配体是抗体或抗原，并且用于通过凝集法检测试样中的抗原或抗体。
35.一种体外诊断检验试剂盒，其包含权利要求33或34所述的检验试剂以及容纳所述检验试剂的外壳。
36.一种用于检测试样中的目标物质的方法，包括：
将试样混合到权利要求33或34所述的检验试剂中。
37.一种通过凝集法检测试样中的目标物质的方法，包括：
将试样混合到权利要求33或34所述的检验试剂中以获得混合物；
用光照射所述混合物；和
检测用以照射混合物的光的透射光和散射光中的至少任何。
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