WO2022209952A1 - 粒子、及びその製造方法 - Google Patents

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文生 山内
法重 掛川
賢 杉田
良 名取
健 村上
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キヤノン株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to particles used in latex immunoagglutination and a method for producing the same.
  • the latex immunoagglutination method is used as a method for measuring substances to be measured in biological samples (hereinafter referred to as specimens) in the field of clinical testing.
  • specimens biological samples
  • a dispersion of particles sensitized (bound) with an antibody or antigen as a ligand is mixed with a specimen that may contain the substance to be measured (antigen or antibody). If there is a substance to be measured (antigen or antibody) in the sample, the particles sensitized with the ligand will undergo an agglutination reaction, and this agglutination reaction is measured as the amount of change in scattered light intensity, transmitted light intensity, absorbance, etc. This makes it possible to identify and quantify the presence or absence of the substance to be measured.
  • Patent Literature 1 discloses latex particles having carboxyl groups introduced on their surfaces via amino acids.
  • the amino acid-derived amine present on the particle surface causes the surface charge of the particles to become positive. As a result, non-specific agglutination reactions may occur. In addition, there is a problem that it is difficult to increase the amount of ligand sensitization to the carboxyl group on the particle surface to a certain amount or more.
  • the object of the present invention is to provide particles capable of reducing non-specific agglutination reactions and increasing the amount of ligand sensitization.
  • a particle according to the present invention is a particle having a polymer containing a repeating unit derived from a vinyl-based monomer, the particle having a structure represented by the following formula (1), and a water-soluble polymer on the surface of the particle. have a reactive polymer.
  • X represents an atom contained in the polymer that bonds to Si in formula (1)
  • R is a carboxy group or a hydrogen atom
  • L 1 and L 2 each independently represent the number of carbon atoms. 1 to 15 alkylene or oxyalkylene groups.
  • a method for producing particles according to the present invention comprises mixing a vinyl-based monomer, water, a radical polymerization initiator, and a water-soluble polymer to form particles containing a polymer, and obtaining an aqueous dispersion containing the particles.
  • a structure represented by the following formula (1) is formed on the surface of the particles by mixing a silane coupling agent having a glycidyl group and a compound having a mercapto group and a carboxy group in the aqueous dispersion. a second step of causing
  • X represents an atom contained in the polymer that bonds to Si in formula (1)
  • R is a carboxy group or a hydrogen atom
  • L 1 and L 2 are each independently an alkylene or oxyalkylene group having 1 to 15 carbon atoms.
  • the particles according to the present embodiment are particles having a polymer containing repeating units derived from a vinyl-based monomer, and have a structure represented by the following formula (1).
  • the surface of the particles has a water-soluble polymer.
  • X represents an atom contained in the polymer that bonds to Si in formula (1)
  • R is a carboxy group or a hydrogen atom
  • L 1 and L 2 are each independently an alkylene or oxyalkylene group having 1 to 15 carbon atoms.
  • the particles according to this embodiment have a structure represented by the above formula (1) and have a water-soluble polymer on the particle surface. Therefore, the surface charge of the particles is large on the negative side, compared to the structure of Prior Art 1, which has amine on the particle surface and no water-soluble polymer on the particle surface. Furthermore, the particles according to this embodiment have highly hydrophilic carboxyl groups. As a result, non-specific agglutination reactions are reduced.
  • the ligand to be sensitized is an antibody, the antibody is cationic at the time of sensitization. Therefore, compared with the particles disclosed in Prior Art 1, the particles according to the present embodiment having a large negative surface charge on the particle surface can increase the sensitization amount of the ligand.
  • the particles according to this embodiment can be used for latex immunoagglutination.
  • particles for use in latex immunoagglutination that is, the particles according to this embodiment can immobilize a ligand, and the obtained ligand-sensitized particles bind to a target substance, so that the target substance can be measured by the latex immunoagglutination method. Since the particles according to the present embodiment have a large amount of ligand sensitization, the probability of binding to the target substance increases, and the target substance can be detected with high sensitivity by the latex immunoagglutination method.
  • the particles according to the present embodiment may be a copolymer in which the polymer has repeating units derived from two more types of vinyl-based monomers. Furthermore, the copolymer preferably contains repeating units derived from a styrene-based monomer and repeating units derived from an organosilane compound having a vinyl-based functional group.
  • the chemical structure of the repeating unit derived from a vinyl-based monomer in the present embodiment is not limited as long as the object of the present invention can be achieved.
  • a repeating unit derived from a styrene monomer, a repeating unit derived from a diene monomer, a repeating unit derived from a (meth)acrylic monomer, and a repeating unit derived from an organosilane compound having a vinyl functional group can be used. can be done.
  • "(meth)acryl” means acryl or methacryl.
  • the chemical structure of the repeating unit derived from a styrene-based monomer in the present embodiment is not limited as long as the object of the present invention can be achieved.
  • styrene, ⁇ -methylstyrene, ⁇ -methylstyrene, o-methylstyrene, m-methylstyrene, p-methylstyrene, 2,4-dimethylstyrene, pn-butylstyrene, p-tert-butylstyrene The group consisting of pn-hexylstyrene, pn-octylstyrene, pn-nonylstyrene, pn-decylstyrene, pn-dodecylstyrene, p-methoxystyrene, and p
  • a styrenesulfonic acid-based monomer such as sodium p-styrenesulfonate
  • a styrenesulfonic acid group as a functional group that is highly compatible with styrene and highly hydrophilic
  • repeating unit derived from diene-based monomer The chemical structure of the repeating unit derived from a diene-based monomer in the present embodiment is not limited as long as the object of the present invention can be achieved. Examples include repeating units derived from at least one monomer selected from the group consisting of isoprene, butadiene, and chloroprene.
  • the chemical structure of the repeating unit derived from the (meth)acrylic monomer in the present embodiment is not limited as long as the object of the present invention can be achieved. Examples thereof include repeating units derived from at least one monomer selected from the group consisting of (meth)acrylic acid alkyl ester monomers and (meth)acrylic acid alkoxyalkyl ester monomers.
  • Examples of (meth)acrylic acid alkyl ester monomers include methyl (meth)acrylate, ethyl (meth)acrylate, n-propyl (meth)acrylate, isopropyl (meth)acrylate, n-butyl (meth)acrylate, A repeating unit derived from at least one monomer selected from the group consisting of isobutyl (meth)acrylate, n-hexyl (meth)acrylate, 2-ethylhexyl (meth)acrylate, and cyclohexyl (meth)acrylate are mentioned.
  • (Meth)acrylic acid alkoxyalkyl ester monomers such as methoxymethyl (meth)acrylate, ethoxymethyl (meth)acrylate, 2-methoxyethyl (meth)acrylate, 2-ethoxyethyl (meth)acrylate, At least selected from the group consisting of 2-propoxyethyl (meth)acrylate, 2-butoxyethyl (meth)acrylate, 3-methoxypropyl (meth)acrylate, and 4-methoxybutyl (meth)acrylate Repeating units derived from one kind of monomers can be mentioned.
  • Organic silane compounds having a vinyl functional group include, for example, vinyltrimethoxysilane, vinyltriethoxysilane, p-styryltrimethoxysilane, 3-methacryloxypropylmethyldimethoxysilane, 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane.
  • Radar polymerization initiator Azo compounds, organic peroxides, and the like can be used as the radical polymerization initiator in the present embodiment.
  • APS ammonium persulfate
  • NPS sodium persulfate
  • KPS potassium persulfate
  • the water-soluble polymer in this embodiment functions as a protective colloid during the synthesis of polymer-containing particles, and contributes to control of the particle size of the produced polymer particles.
  • the presence of the water-soluble polymer increases the surface charge of the particles toward the negative side and increases the hydrophilicity, thereby reducing non-specific aggregation.
  • the water-soluble polymer in this embodiment at least one selected from the group consisting of polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, and polyvinylpyrrolidone (PVP) can be used.
  • the molecular weight of the water-soluble polymer in the present embodiment is preferably 10,000 or more and 1,000,000 or less, more preferably 30,000 or more and 70,000 or less. This is because if the molecular weight is 10,000 or more, a high effect as a protective colloid can be obtained, and if the molecular weight is 1,000,000 or less, the viscosity of the aqueous medium does not increase and the handling becomes difficult. A part of these water-soluble polymers may adhere to the particle surface after synthesis by physical adsorption, chemical adsorption, or the like.
  • the particles in this embodiment have the structure represented by the above formula (1) on the surface.
  • an oxygen atom contained in the polymer and Si of Formula (1) form a siloxane bond.
  • the particles according to the present embodiment have siloxane bonds, so that the structure of formula (1) is strongly bonded to the particles.
  • a silane coupling agent having a glycidyl group and a compound having a mercapto group and a carboxy group can be used to introduce the structure represented by the above formula (1) into the particles.
  • Examples of silane coupling agents having a glycidyl group include 3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane and 3-glycidyloxypropyltriethoxysilane.
  • Examples of compounds having a mercapto group and a carboxy group include mercaptoacetic acid, mercaptopropionic acid, and mercaptosuccinic acid.
  • the polymer possessed by the particles according to this embodiment preferably contains a repeating unit represented by the following formula (2) and a repeating unit represented by the following formula (3).
  • a 1 to A 3 are each independently H, CH 3 , CH 2 CH 3 , or a bond that bonds to Si in formula (3) via a single bond.
  • a bond that bonds to Si in formula (3) through a single bond is a repeating unit represented by formula (3) when a polymer contains a plurality of repeating units represented by formula (3) and the position where O of the formula (3) of another repeating unit is bonded.
  • the particles according to the present embodiment are a combination of a polymer having repeating units represented by (2) and (3) above, the structure of formula (1) above, and a water-soluble polymer on the particle surface. Therefore, it has high hydrophilicity and a large negative charge. As a result, non-specific agglutination reactions can be reduced, and the amount of ligand sensitization can be increased. Thereby, the sensitivity of detection of target substances is high when used in latex immunoagglutination.
  • polymer in the present embodiment may further contain a repeating unit represented by the following formula (4).
  • Y in the above formula (4) is any one of H, Na, and K.
  • the particle diameter of the particles in the present embodiment is preferably 50 nm or more and 1 ⁇ m or less, more preferably 50 nm or more and 500 nm or less, as a number average particle diameter in water.
  • the average particle size in this embodiment can be measured by a dynamic light scattering method. Specifically, a dispersion of polymer particles is measured by a dynamic light scattering method, the obtained light intensity is converted into a number distribution, and the average value can be used as the particle size.
  • ligand This embodiment can also bind ligands to the carboxy groups of the particles according to this embodiment.
  • a particle obtained by binding a ligand to the particle according to this embodiment is hereinafter referred to as a ligand-sensitized particle.
  • binding of a ligand to particles in this embodiment is hereinafter referred to as ligand sensitization.
  • a ligand in this embodiment is a compound that specifically binds to a receptor possessed by a specific target substance.
  • the site where the ligand binds to the target substance is determined and selectively or specifically has high affinity. Examples thereof include antigens and antibodies, enzyme proteins and their substrates, signal substances such as hormones and neurotransmitters and their receptors, and nucleic acids, but the ligands of the present invention are not limited to these.
  • the sensitizing particle for latex immunoagglutination in the present embodiment means a sensitizing particle for latex immunoagglutination that has a high selective or specific affinity for a target substance.
  • conventionally known methods can be applied as the chemical reaction method for chemically immobilizing the carboxyl groups and ligands of the particles according to this embodiment, as long as the object of the present invention can be achieved.
  • carbodiimide-mediated reactions and NHS ester activation reactions are commonly used chemical reactions.
  • the chemical reaction method for chemically fixing the carboxyl group and the ligand in the present invention is not limited to these.
  • the carboxyl groups remaining without ligand binding may be subjected to active esterification to bind hydrophilic molecules.
  • active esterification This is generally referred to as inactivation of active esters, blocking treatment of carboxyl groups, or masking treatment.
  • the hydrophilic molecule is preferably polyethylene glycol (PEG) or trishydroxymethylaminomethane (Tris).
  • PEG is particularly preferred as it can greatly reduce protein adsorption to the particles.
  • PEG polyethylene glycol
  • Tris trishydroxymethylaminomethane
  • the molecular weight of PEG is preferably 350 or more and 5000 or less, and particularly preferably 1000 or more and 2000 or less.
  • PEG in the present embodiment those having a functional group reactive to a carboxy group or an active ester, for example, PEG having an amino group are preferable, and polyethylene glycol having a primary amine is particularly preferable.
  • Polyethylene glycol may be a linear polymer or a branched polymer.
  • Tris is represented by the following formula (5), and an example of PEG is represented by the following formulas (6) and (7). Note that n in formulas (4) and (5) is an integer of 1 or more indicating the number of oxyethylene units.
  • the amount of ligand binding is also an important factor, and when the amount of ligand binding (which can also be called the amount of immobilization) is small, the reactivity of the antigen-antibody decreases, which is not preferable. Conversely, when the amount of ligand binding is large, it also causes deterioration of the dispersibility of the ligand-sensitized particles. Although it depends on the particle size, if the average particle size is about 200 nm, it is preferably 1 ⁇ g or more and 500 ⁇ g or less, particularly preferably 10 ⁇ g or more and 200 ⁇ g or less, per 1 mg of particles.
  • the ligand-sensitized particles for latex immunoagglutination in the present embodiment use antibodies or antigens as ligands, and can be preferably applied to latex immunoagglutination assays widely used in areas such as clinical examination and biochemical research.
  • target antigens antibodies
  • foreign substances in serum adsorb non-specifically to the particle surface, resulting in unintended particle agglutination.
  • the problem is that it is detected and interferes with accurate measurement. Therefore, for the purpose of reducing deceptive noise, particles are usually coated with a biological substance such as albumin as a blocking agent to reduce non-specific adsorption to the particle surface.
  • the ligand-sensitized particles according to the present embodiment are particles that are highly hydrophilic and have enhanced ability to reduce the non-specific adsorption. The above problems can be solved without requiring a postcoat such as albumin.
  • testing reagent An in-vitro diagnostic test reagent according to this embodiment has the ligand-sensitized particles according to this embodiment and a dispersion medium.
  • the amount of the ligand-sensitized particles contained in the test reagent in this embodiment is preferably 0.001% by mass to 20% by mass, more preferably 0.01% by mass to 10% by mass.
  • the reagent of the present invention may also contain a third substance such as a solvent or a blocking agent, as long as the object of the present invention can be achieved.
  • Third substances such as solvents and blocking agents may be included in combination of two or more. Examples of the solvent used in the present invention include various buffers such as phosphate buffer, glycine buffer, Good's buffer, Tris buffer, and ammonia buffer. It is not limited to these.
  • the test kit for in-vitro diagnosis has a test reagent according to this embodiment and a housing containing the test reagent.
  • the test kit according to this embodiment preferably further comprises a reaction buffer solution containing albumin (hereinafter, reagent 2) in addition to the test reagent (hereinafter, reagent 1) according to this embodiment.
  • albumin include serum albumin, which may be protease-treated.
  • the amount of albumin contained in the reagent 2 is 0.001% by mass to 5% by mass as a guideline, but the test kit in the present embodiment is not limited to this.
  • Both or one of reagent 1 and reagent 2 may contain a sensitizer for latex immunoagglutination assay.
  • Sensitizers for latex immunoagglutination assays include, but are not limited to, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyalginic acid, and the like. Both or one of reagent 1 and reagent 2 may contain a surfactant. Since surfactants have the effect of stabilizing particles and proteins, for example, polyoxyethylene sorbitan monolaurate and poly(oxyethylene) octylphenyl ether are preferably used.
  • the test kit in this embodiment may also include a positive control, a negative control, a serum diluent, and the like. As a medium for the positive control and negative control, serum containing no measurable target substance, physiological saline, or a solvent may be used.
  • the method for detecting a target substance in a sample by the latex immunoagglutination method of the present embodiment is characterized by mixing the ligand-sensitized particles for latex immunoagglutination of the present embodiment with a sample that may contain the target substance. and Further, the ligand-sensitized particles for latex immunoagglutination of the present embodiment and the sample are preferably mixed in a pH range of 3.0 to 11.0. Also, the mixing temperature ranges from 20° C. to 50° C., and the mixing time ranges from 10 seconds to 30 minutes.
  • the concentration of the ligand-sensitized particles for latex immunoagglutination of this embodiment in the detection method of this embodiment is preferably 0.001% by mass to 5% by mass, more preferably 0.01% by mass, in the reaction system. to 1% by mass.
  • the detection method of this embodiment optically detects an agglutination reaction that occurs as a result of mixing the ligand-sensitized particles for latex immunoagglutination of this embodiment with a specimen. Specifically, by optically detecting the agglutination reaction, the target substance in the sample can be detected, and the concentration of the target substance can also be measured.
  • an optical instrument capable of detecting scattered light intensity, transmitted light intensity, absorbance, etc. may be used and the amount of change in these values may be measured.
  • the method for producing particles according to this embodiment includes at least the following first step and second step.
  • (First step) A step of mixing a vinyl-based monomer, water, a radical polymerization initiator, and a water-soluble polymer to form particles containing a copolymer (particulate copolymer), and obtaining an aqueous dispersion containing the particles.
  • (Second step) A step of mixing a silane coupling agent having a glycidyl group and a compound having a mercapto group and a carboxy group with an aqueous dispersion to form the structure represented by the above formula (1) on the surface of the particles. Details will be described below.
  • a vinyl-based monomer, an organic silane compound having a vinyl-based functional group, a water-soluble polymer, water, and a radical polymerization initiator are mixed to form a granular copolymer, which is dispersed in water.
  • the liquid Vinyl-based monomers, organic silane compounds having vinyl-based functional groups) and water-soluble polymers include, for example, styrene, 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, and polyvinylpyrrolidone.
  • the first step in the present embodiment includes, for example, mixing a silane coupling agent having a glycidyl group and a compound having a mercapto group and a carboxy group with the aqueous dispersion of the polymer.
  • a silane coupling agent having a glycidyl group and a compound having a mercapto group and a carboxy group for example, 3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane and mercaptosuccinic acid can be used.
  • the granular aqueous dispersion of the copolymer is first mixed with a silane coupling agent having a glycidyl group to modify the particle surface with a glycidyl group, and then mixed with a compound having a mercapto group and a carboxy group.
  • a silane coupling agent having a glycidyl group and a compound having a mercapto group and a carboxy group may be mixed in advance and mixed with the aqueous dispersion of the granular copolymer to modify the particle surface with a carboxy group. good.
  • Example 1 Synthesis of particles
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid
  • 50 mM pH 7.0
  • polyvinylpyrrolidone K-30 manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd., molecular weight 40000
  • the dispersion liquid of SA1 was centrifuged to recover SA, and the supernatant was discarded.
  • the collected SA1 was re-dispersed in pure water and then centrifuged again. Recovery of SA1 by a centrifugal separator and redispersion with pure water were repeated four times.
  • SA1 was mixed with 3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane and a compound having a mercapto group and a carboxy group as shown in Table 1, and reacted at 60°C for 24 hours.
  • the amount of carboxy groups in the particles can be calculated from the titration curve.
  • Table 1 summarizes the amount of carboxy groups in the produced particles.
  • Non-specific agglutination of particles was assessed by immunoturbidimetry.
  • particles are brought into contact with human serum, and non-specific aggregation of particles is measured with an absorbance meter using turbidity as an indicator. Absorbance increases if non-specific aggregation occurs. Absorbance was measured using a UV-visible spectrophotometer (GeneQuant 1300, GE Healthcare), and the sample was injected into a plastic cell (minimum sample volume: 70 ⁇ L) and measured at an optical path length of 10 mm. A specific measurement method is shown below.
  • the results are shown in Table 2.
  • the particles of this example had a ⁇ ODx10000 of 2000 or less, and no non-specific reaction was observed.
  • ⁇ ODx10,000 of 10,000 or more was observed for Imtex, which is an uncoated polystyrene particle.
  • the increase in the absorbance of the dispersion can be attributed to the non-specific adsorption of substances contained in human serum to the particles in the dispersion, resulting in inter-particle aggregation. I understood it. It was confirmed that the particles of this example can reduce non-specific adsorption compared to commercially available polystyrene particles.
  • Example 3 Preparation of antibody-sensitized particles
  • 0.1 mL (particles 1 mg) of the particle dispersion liquid (concentration 1.0 mass % solution, 10 mg/mL) of this example was transferred to a microtube (capacity 1.5 mL).
  • 0.12 mL of activation buffer 25 mM MES buffer, pH 6.0
  • an activation buffer solution was added and dispersed by ultrasonic waves using an ultrasonic cleaner (trade name: MODEL VS-100III AS ONE 3-frequency ultrasonic cleaner, manufactured by AS ONE, 28 kHz). .
  • an ultrasonic cleaner trade name: MODEL VS-100III AS ONE 3-frequency ultrasonic cleaner, manufactured by AS ONE, 28 kHz.
  • it was centrifuged at 15,000 rpm (20,400 g) at 4° C. for 20 minutes. The supernatant was discarded with a pipettor, 0.12 mL of activation buffer was added and dispersed by ultrasound.
  • the mixture was centrifuged at 15,000 rpm (20,400 g) at 4° C. for 20 minutes, and the supernatant was discarded with a pipettor.
  • the dispersion was centrifuged at 4°C and 15000 rpm (20400 g) for 20 minutes, and the supernatant was discarded with a pipettor.
  • 0.2 mL of immobilization buffer (25 mM MES buffer, pH 5.0) was added and dispersed by ultrasonic waves. After centrifugation at 4° C. and 15000 rpm (20400 g) for 20 minutes, the supernatant was discarded with a pipettor. 50 ⁇ L of an immobilization buffer solution was added per 1 mg of particles, and the particles with activated carboxy groups were dispersed by ultrasonic waves.
  • Anti-human CRP antibody (polyclonal antibody) was diluted with immobilization buffer to 100 ⁇ g/50 ⁇ L (referred to as antibody solution). 50 ⁇ L of the antibody solution was added to 50 ⁇ L of the carboxyl group-activated particle solution (containing 1 mg of particles), and the particles were dispersed by ultrasonic waves. The amount of antibody charged is 100 ⁇ g per 1 mg of particles (100 ⁇ g/mg). The tube was agitated for 60 minutes at room temperature to immobilize the antibody to the carboxy groups of the particles. Then, it was centrifuged at 15000 rpm (20400 g) at 4° C. for 20 minutes and the supernatant was discarded with a pipettor.
  • active ester inactivation buffer (1M Tris buffer, pH 8.0 containing 0.1% Tween (registered trademark) 20) containing tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) was added. , ultrasonically dispersed. After stirring for 1 hour at room temperature to bind Tris to the remaining activated esters, the mixture was allowed to stand overnight at 4°C.
  • washing/storage buffer (10 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic acid (HEPES) buffer, pH 7.9) and disperse with ultrasonic waves.
  • HEPES 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic acid
  • 1.0 mL of the washing/storage buffer was added and dispersed by ultrasonic waves. Since almost no particle loss was observed in the above steps, the final concentration of the antibody-sensitized particles was 0.1% by mass (1 mg/mL). It was stored in a refrigerator and redispersed with ultrasonic waves before use.
  • Protein quantification confirmed that the antibody was sensitized (immobilized) to the particles. Specifically, it is a method of reacting antibody-sensitized particles with a BCA reagent. First, 25 ⁇ L (particle amount: 25 ⁇ g) of a dispersion (0.1% solution) of antibody-sensitized particles was dispensed. 7 mL of A solution and 140 ⁇ L of B solution of the protein assay BCA kit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were mixed to prepare AB solution. 200 ⁇ L of AB solution was added to the particle solution (25 ⁇ L) and incubated at 60° C. for 30 minutes.
  • a BCA reagent 25 ⁇ L (particle amount: 25 ⁇ g) of a dispersion (0.1% solution) of antibody-sensitized particles was dispensed. 7 mL of A solution and 140 ⁇ L of B solution of the protein assay BCA kit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were mixed to prepare AB
  • the solution was centrifuged at 15,000 rpm (20,400 g) for 5 minutes at 4°C, and 200 ⁇ L of the supernatant was collected with a pipettor. Absorbance at 562 nm was measured with a multimode microplate reader (SynergyMX, BioTek) together with standard samples (antibodies in the range of 0 to 200 ⁇ g/mL at 10 mM HEPES). Antibody amounts were calculated from the standard curve. The amount of antibody sensitization to the particles (antibody binding amount per particle weight (antibody immobilization amount) ( ⁇ g/mg)) was obtained by dividing the calculated antibody amount by the particle weight (here, 0.025 mg). The sensitization efficiency was determined from the amount of antibody charged. Table 3 shows the results. It was found that the antibody-sensitized particles of this example had higher sensitization efficiency than the comparative example.
  • the surface charge is negative and uniform, and it is extremely hydrophilic.
  • a hydrophilic surface exhibits a high ability to suppress non-specific adsorption.
  • the antibody Upon sensitization, the antibody is in a cationic state and is electrostatically attracted to the negative surface, the region of the carboxy groups of the particle. As a result, the antibody is concentrated on the particle surface, greatly promoting the reaction between the antibody and the carboxyl group on the particle surface. As a result, it is believed that the rate of antibody sensitization to the particles is improved. Since the NHS-activated ester of the carboxy group hydrolyzes rapidly in water, the concentration action of the antibody on the particle surface is an important process.
  • the SAN1 particles of the comparative example have a carboxy group and an amino group located near the particle surface, and have less negative surface charges than the particles of this example. As a result, it is considered that the antibody sensitization rate to the particles decreased.
  • Example 5 Evaluation of sensitivity of antibody-sensitized particles to human CRP antigen
  • the sensitivity of antibody-sensitized particles was evaluated by latex immunoagglutination. Specifically, the antigen is reacted with antibody-sensitized particles to form an immune complex aggregate, the aggregate is irradiated with light, and the attenuation (absorbance) of the irradiated light due to scattering is measured with an absorbance meter. The method. The ratio of aggregates increases depending on the amount of antigen contained in the specimen, and the absorbance increases. In the evaluation of sensitivity, it is desirable that the amount of increase in absorbance (denoted by ⁇ OD ⁇ 10000) at a given PSA concentration is large.
  • a UV-visible spectrophotometer (GeneQuant 1300, GE Healthcare) was used to measure the absorbance, and the sample was injected into a plastic cell and measured at an optical path length of 10 mm. A specific measurement method is shown below.
  • CRP solution CRP concentration 0 ⁇ g/mL or 160 ⁇ g/mL
  • R1 buffer solution 50 ⁇ L
  • 50 ⁇ L of a dispersion solution of antibody-sensitized particles particle concentration 0.1 wt%, 10 mM HEPES, pH 7.9, 0.01 wt% Tween (registered trademark) 20
  • particle concentration 0.1 wt%, 10 mM HEPES, pH 7.9, 0.01 wt% Tween (registered trademark) 20 was added to R1 buffer solution (51 ⁇ L) containing CRP, and bubbles were generated.
  • the mixture was quickly pipetted while being careful not to enter, and used as a sample.
  • the absorbance of the sample at 572 nm was read and designated as Abs1. After warming the sample at 37° C. for 5 minutes, the absorbance of the sample was read at 572 nm and designated as Abs2. A value obtained by subtracting Abs1 from Abs2 was obtained and multiplied by 10000 to obtain a ⁇ ODx10000 value.
  • Example 6 Synthesis of particles using a styrenesulfonic acid-based monomer
  • 160 g of MES buffer manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd., 50 mM, pH 7.0
  • 2 g of polyvinylpyrrolidone K-30 manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd., molecular weight 40000
  • 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane (trade name: LS-3380, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) 2 g, styrene (manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) 6.4 g, sodium p-styrene sulfonate (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd.) 0 .1 g was added and stirred for 10 minutes with nitrogen blowing at room temperature. After that, the emulsion in the flask was heated to 70° C. in an oil bath.
  • SA2 was mixed with 3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane and a compound having a mercapto group and a carboxy group as shown in Table 5, and reacted at 70°C for 24 hours.
  • Table 5 summarizes the amount of carboxy groups in the produced particles (SAS5).
  • the average particle size of SAS5 was evaluated by DLS and found to be 76 nm. In other words, an increase in particle size and the presence of carboxyl groups were similarly confirmed in particles using a styrenesulfonic acid-based monomer.

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Abstract

ビニル系モノマーに由来する繰り返し単位を含む重合体を有する粒子であって、前記粒子がカルボキシ基を含む特定の構造を有し、前記粒子の表面には水溶性ポリマーを有する。

Description

粒子、及びその製造方法
　本発明は、ラテックス免疫凝集法で用いられる粒子、及びその製造方法に関する。
　臨床検査領域における生体試料（以下、検体という）中の測定対象物質の測定方法として、ラテックス免疫凝集法が用いられている。この方法では、リガンドとして抗体あるいは抗原を感作（結合）させた粒子の分散液と、測定対象物質（抗原あるいは抗体）を含有する可能性のある検体とを混合する。検体中に測定対象物質（抗原あるいは抗体）があれば、リガンドを感作させた粒子が凝集反応を起こすため、この凝集反応を、散乱光強度、透過光強度、吸光度等の変化量として測定することで測定対象物質の有無の特定や定量ができる。
　ラテックス免疫凝集法に用いられる粒子について、測定対象物質の検出感度の向上と、非特異的な凝集反応の低減が課題となっている。検出感度の向上には、粒子へのリガンド感作量を増やすことが考えられる。
　近年、測定対象物質に対して親和性を有するリガンドを粒子に結合させて成るアフィニティー粒子を使用して、測定対象物質を精製したり、定量したりする研究が行われている。特許文献１には、表面にアミノ酸を介してカルボキシ基が導入されたラテックス粒子が開示されている。
国際公開第２００７／０６３６１６号
　しかしながら、特許文献１に記載されたラテックス粒子は、粒子表面に存在する、アミノ酸由来のアミンが、粒子の表面電荷をプラス寄りにさせる。その結果、非特異的な凝集反応を起こすことがある。また、粒子表面のカルボキシ基へのリガンド感作量を一定量以上に増やすことが難しい、といった課題がある。
　そこで本発明では、非特異的な凝集反応を低減し、リガンド感作量を多くすることができる粒子を提供することを目的とする。
　本発明に係る粒子は、ビニル系モノマーに由来する繰り返し単位を含む重合体を有する粒子であって、前記粒子は下記式（１）で表される構造を有し、前記粒子の表面には水溶性ポリマーを有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記式（１）において、Ｘは式（１）におけるＳｉと結合する前記重合体に含まれる原子を表し、Ｒはカルボキシ基または水素原子であり、Ｌ１、Ｌ２は各々独立に、炭素数１以上１５以下のアルキレン基またはオキシアルキレン基である。
　本発明に係る粒子の製造方法は、ビニル系モノマー、水、ラジカル重合開始剤、及び水溶性ポリマーを混合して重合体を含む粒子を形成させ、前記粒子を含む水分散液を得る第１の工程と、前記水分散液に、グリシジル基を有するシランカップリング剤、およびメルカプト基とカルボキシ基を有する化合物を混合することで、前記粒子の表面に下記式（１）で表される構造を形成させる第２の工程を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　上記式（１）において、Ｘは式（１）におけるＳｉと結合する前記重合体に含まれる原子を表し、
　Ｒはカルボキシ基または水素原子であり、
　Ｌ１、Ｌ２は各々独立に、炭素数１以上１５以下のアルキレン基またはオキシアルキレン基である。
　本発明によれば、非特異的な凝集反応を低減し、リガンドの感作量を多くすることがで　きる粒子を提供できる。
　以下、本発明の実施形態について詳しく説明するが、本発明の技術範囲はこれらの実施形態に限定されない。
　本実施形態に係る粒子は、ビニル系モノマーに由来する繰り返し単位を含む重合体を有する粒子であって、この粒子は下記式（１）で表される構造を有する。また、粒子の表面には水溶性ポリマーを有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　上記式（１）において、Ｘは式（１）におけるＳｉと結合する前記重合体に含まれる原子を表し、
　Ｒはカルボキシ基または水素原子であり、Ｌ１、Ｌ２は各々独立に、炭素数１以上１５以下のアルキレン基またはオキシアルキレン基である。
　本実施形態に係る粒子は、粒子が上記式（１）で表される構造を有し、粒子表面に水溶性ポリマーを有する。そのため、先行技術１のような、粒子表面にアミンを有し、粒子表面に水溶性ポリマーがない構造に比べて、粒子の表面電荷がマイナス側に大きい。さらに、本実施形態に係る粒子は親水性の高いカルボキシ基を有する。その結果、非特異的な凝集反応が低減される。ここで、感作させるリガンドが抗体である場合、感作時の抗体がカチオニックな状態である。そのため、先行技術１で開示される粒子に比べて、粒子表面電荷がマイナス側に大きい本実施形態に係る粒子は、リガンドの感作量を多くできる。
　なお、本実施形態に係る粒子はラテックス免疫凝集用として用いることができる。具体的には、ラテックス免疫凝集法で用いるための粒子である。すなわち、本実施形態に係る粒子はリガンドを固定することが出来、得られたリガンド感作粒子は、標的物質と結合するため、ラテックス免疫凝集法により標的物質を測定することが可能になる。本実施形態に係る粒子はリガンド感作量が多いため、標的物質と結合する確率が高まり、ラテックス免疫凝集法により標的物質を感度高く検出することができる。
　本実施形態に係る粒子は重合体が、２種類上のビニル系モノマーに由来する繰り返し単位を有している共重合体であってもよい。さらに、当該共重合体が、スチレン系モノマーに由来する繰り返し単位、およびビニル系官能基を有する有機シラン化合物に由来する繰り返し単位を含むことが好ましい。
　（モノマー）
　本実施形態におけるビニル系モノマーに由来する繰り返し単位とは、本発明の目的を達成可能な範囲においてその化学構造は限定されない。例えば、スチレン系モノマーに由来する繰り返し単位、ジエン系モノマーに由来する繰り返し単位、（メタ）アクリル系モノマーに由来する繰り返し単位、およびビニル系官能基を有する有機シラン化合物に由来する繰り返し単位を用いることができる。本明細書において「（メタ）アクリル」とはアクリルまたはメタクリルを意味する。
　（スチレン系モノマーに由来する繰り返し単位）
　本実施形態におけるスチレン系モノマーに由来する繰り返し単位とは、本発明の目的を達成可能な範囲においてその化学構造は限定されない。例えば、スチレン、α－メチルスチレン、β－メチルスチレン、ｏ－メチルスチレン、ｍ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、２，４－ジメチルスチレン、ｐ－ｎ－ブチルスチレン、ｐ－ｔｅｒｔ－ブチルスチレン、ｐ－ｎ－ヘキシルスチレン、ｐ－ｎ－オクチルスチレン、ｐ－ｎ－ノニルスチレン、ｐ－ｎ－デシルスチレン、ｐ－ｎ－ドデシルスチレン、ｐ－メトキシスチレン、及びｐ－フェニルスチレンで構成される群から選択される少なくとも一種のモノマーに由来する繰り返し単位が挙げられる。この他にも各種モノマーと相溶性が高く、かつ、親水性の高い官能基を有するモノマーを単独であるいは複数種類を組み合わせて使用できる。例えば、スチレンと相溶性が高く、親水性の高い官能基としてスルホン酸基を有するスチレンスルホン酸系モノマー（ｐ－スチレンスルホン酸ナトリウムなど）を使用することができる。
　（ジエン系モノマーに由来する繰り返し単位）
　本実施形態におけるジエン系モノマーに由来する繰り返し単位とは、本発明の目的を達成可能な範囲においてその化学構造は限定されない。例えば、イソプレン、ブタジエン、及びクロロプレンで構成される群から選択される少なくとも一種のモノマーに由来する繰り返し単位が挙げられる。
　（メタアクリル系モノマーに由来する繰り返し単位）
　本実施形態における（メタ）アクリル系モノマーに由来する繰り返し単位とは、本発明の目的を達成可能な範囲においてその化学構造は限定されない。例えば、（メタ）アクリル酸アルキルエステルモノマー、及び（メタ）アクリル酸アルコキシアルキルエステルモノマーで構成される群から選択される少なくとも一種のモノマーに由来する繰り返し単位を挙げることができる。（メタ）アクリル酸アルキルエステルモノマーとして例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ｎ－プロピル、（メタ）アクリル酸イソプロピル、（メタ）アクリル酸ｎ－ブチル、（メタ）アクリル酸イソブチル、（メタ）アクリル酸ｎ－ヘキシル、（メタ）アクリル酸２－エチルヘキシル、及び（メタ）アクリル酸シクロヘキシルで構成される群から選択される少なくとも一種のモノマーに由来する繰り返し単位が挙げられる。（メタ）アクリル酸アルコキシアルキルエステル単量体として例えば、（メタ）アクリル酸メトキシメチル、（メタ）アクリル酸エトキシメチル、（メタ）アクリル酸２－メトキシエチル、（メタ）アクリル酸２－エトキシエチル、（メタ）アクリル酸２－プロポキシエチル、（メタ）アクリル酸２－ブトキシエチル、（メタ）アクリル酸３－メトキシプロピル、及び（メタ）アクリル酸４－メトキシブチルで構成される群から選択される少なくとも一種のモノマーに由来する繰り返し単位が挙げられる。
　（ビニル系官能基を有する有機シラン化合物に由来する繰り返し単位）
　本実施形態におけるビニル系官能基を有する有機シラン化合物に由来する繰り返し単位とは、本発明の目的を達成可能な範囲においてその化学構造は限定されない。ビニル系官能基を有する有機シラン化合物は例えば、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、ｐ－スチリルトリメトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、及び３－アクリロキシプロピルトリメトキシシランで構成される群から選択される少なくとも一種のモノマーに由来する繰り返し単位が挙げられる。
　（ラジカル重合開始剤）
　本実施形態におけるラジカル重合開始剤としては、アゾ化合物、有機過酸化物などを用いることができる。具体的には、２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’－アゾビス（２，４－ジメチルバレロニトリル）、２，２’－アゾビス（２－メチルブチロニトリル）、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオン酸）ジメチル、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド、過酸化ベンゾイル、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、過硫酸ナトリウム（ＮＰＳ）、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）などを挙げることができる。
　（水溶性ポリマー）
　本実施形態における水溶性ポリマーは、重合体を有する粒子の合成時に保護コロイドとして働き、生成されるポリマー粒子の粒径の制御に寄与する。また、水溶性ポリマーの存在により、粒子の表面電荷はマイナス側に大きくなり、親水性が高くなるため、非特異的な凝集を低減できる。本実施形態における水溶性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）で構成される群から選択される少なくとも一種を用いることができる。
　本実施形態における水溶性ポリマーの分子量は、１００００以上１００００００以下が好ましく、３００００以上７００００以下がさらに好ましい。分子量が１００００以上であれば保護コロイドとしての効果を高く得られ、分子量が１００００００以下であれば水系媒体の粘度が上昇し扱いにくくなることがないからである。また、これら水溶性ポリマーは、その一部が合成後の粒子表面に物理吸着、化学吸着などで密着していても構わない。
　（粒子表面の構造）
　本実施形態における粒子は、表面に上記式（１）で表される構造を有する。典型的には、重合体に含まれる酸素原子と、式（１）のＳｉがシロキサン結合を形成している。このように、本実施形態に係る粒子がシロキサン結合を有することで、式（１）の構造が粒子に強固に結合される。
　上記式（１）で表される構造を粒子に導入するためには、グリシジル基を有するシランカップリング剤、および、メルカプト基とカルボキシ基を有する化合物を用いることができる。グリシジル基を有するシランカップリング剤の例としては、３－グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、３－グリシジルオキシプロピルトリエトキシシランなどが挙げられる。
　メルカプト基とカルボキシ基を有する化合物の例としては、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、メルカプトコハク酸などが挙げられる。
　（粒子の構造の詳細）
　本実施形態に係る粒子の有する重合体は、下記式（２）で表される繰り返し単位と、下記式（３）で表される繰り返し単位とを含むことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記式（３）において、Ａ１乃至Ａ３は各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、または、単結合を介して式（３）におけるＳｉと結合する結合手のいずれかである。単結合を介して式（３）におけるＳｉと結合する結合手とは、式（３）で表される繰り返し単位が重合体中に複数含まれる場合に、ある１つの繰り返し単位の式（３）のＳｉと、別の繰り返し単位の式（３）のＯとが結合する位置を示す。
　後述するように、本実施形態に係る粒子は、上記（２）及び（３）で表される繰り返し単位を有する重合体と、上記式（１）の構造、及び粒子表面の水溶性ポリマーの組み合わせにより、高い親水性と、大きなマイナス電荷がもつ。その結果、非特異的な凝集反応を低減でき、リガンドの感作量を多くできる。それにより、ラテックス免疫凝集法で用いられる場合に、標的物質の検出の感度が高い。
　なお、本実施形態における重合体が、下記式（４）で表される繰り返し単位をさらに含んでもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　上記式（４）におけるＹは、Ｈ、Ｎａ、Ｋのいずれかである。
　（粒径）
　本実施形態における粒子の粒径は、水中における個数平均粒子径で５０ｎｍ以上１μｍ以下であることが好ましく、５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
　５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である場合、遠心操作におけるハンドリング性に優れ、且つ、粒子の特徴である非表面積の大きさが際立つ。本実施形態における平均粒径は動的光散乱法によって測定することができる。具体的には、動的光散乱法でポリマー粒子の分散液を測定し、得られる光強度を個数分布に換算し、平均をとった値を粒径とすることができる。
　（リガンド）
　本実施形態は、また、上記本実施形態に係る粒子のカルボキシ基にリガンドを結合させることができる。本実施形態に係る粒子にリガンドを結合させた粒子を以下ではリガンド感作粒子と呼ぶ。また、本実施形態において粒子へのリガンドの結合させることを以下ではリガンド感作と呼ぶ。
　本実施形態においてリガンドとは、特定の標的物質が有する受容体に特異的に結合する化合物のことである。リガンドが標的物質と結合する部位は決まっており、選択的または特異的に高い親和性を有する。例えば、抗原と抗体、酵素タンパク質とその基質、ホルモンや神経伝達物質などのシグナル物質とその受容体、核酸などが例示されるが、本発明のリガンドはこれらに限定されない。本実施形態におけるラテックス免疫凝集用の感作粒子とは、標的物質に対して選択的または特異的に高い親和性（アフィニティー）を有するラテックス免疫凝集用の感作粒子を意味する。
　本実施形態において、本実施形態に係る粒子が有するカルボキシ基とリガンドとを化学固定する化学反応の方法は、本発明の目的を達成可能な範囲において、従来公知の方法を適用することができる。例えば、カルボジイミド媒介性反応やＮＨＳエステル活性化反応は、良く用いられる化学反応である。ただし、本発明における、カルボキシ基とリガンドとを化学固定する化学反応の方法はこれらに限定されない。
　本実施形態におけるリガンド感作粒子において、リガンドが結合せずに残存したカルボキシ基を活性エステル化して、親水性分子を結合させても良い。これは一般的に活性エステル不活化、あるいはカルボキシ基のブロッキング処理、あるいはマスキング処理などと言われており、カルボキシ基へのタンパクの非特異的な吸着の低減やリガンド感作粒子の分散安定性向上のために行われる。本実施形態において、上記親水性分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）であることが好ましい。ＰＥＧは粒子へのタンパク質の吸着を大きく低減できるため、特に好ましい。実施例で後述するように、ＰＥＧを用いて活性エステル不活化を行う場合、ＰＥＧの分子量は重要であり、分子量が大きいと抗原抗体反応を阻害する可能性がある。そのためＰＥＧの分子量は３５０以上５０００以下であることが好ましく、１０００以上２０００以下であることが特に好ましい。本実施形態におけるＰＥＧとしては、カルボキシ基や活性エステルへの反応性がある官能基を有するもの、例えば、アミノ基を有するＰＥＧが好ましく、１級アミンを有するポリエチレングリコールが特に好ましい。ポリエチレングリコールは直鎖ポリマーであっても、分岐ポリマーであっても構わない。Ｔｒｉｓは下記式（５）で表され、ＰＥＧの一例は下記式（６）、（７）で表される。なお式（４）及び（５）におけるｎはオキシエチレンユニットの数を示す１以上の整数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２　　　　　式（６）
　ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２　　　式（７）
　リガンドを結合させる量も重要な因子であり、リガンド結合量（固定化量と呼ぶこともできる）が少ない場合、抗原抗体の反応性が低下するため、好ましくない。反対にリガンド結合量が多い場合も、リガンド感作粒子の分散性を悪化させる原因となる。粒子径に依存するが、平均粒子径が２００ｎｍ程度であれば、粒子１ｍｇに対して１μｇ以上５００μｇ以下であることが好ましく、１０μｇ以上２００μｇ以下であることが特に好ましい。
　本実施形態におけるラテックス免疫凝集用のリガンド感作粒子は、リガンドとして抗体あるいは抗原が用いられ、臨床検査、生化学研究等の領域において広く活用されているラテックス免疫凝集測定法に好ましく適用できる。一般的な粒子をラテックス免疫凝集測定法に適用した場合、標的物質である抗原（抗体）や血清中の異物等が粒子表面に非特異的吸着し、このことに起因して意図しない粒子凝集が検出されてしまい正確な測定の妨げになることが課題になっている。そのため、欺様性なノイズを低減することを目的として、通常、アルブミンなどの生物由来物質をブロッキング剤として粒子にコーティングし、粒子表面への非特的吸着を低減して用いられている。しかし、このような生物由来物質は、ロットによってその特性が少しずつ異なるため、これらによってコーティングされた粒子は、コーティング処理ごとに非特異的な吸着を低減する能力が異なる。そのため、非特異的吸着を抑制する能力が同水準の粒子を安定的に供給することに課題がある。また、粒子表面にコーティングされた生物由来物質は、変性によって疎水性を呈することがあり、必ずしも非特異的な吸着を低減する能力に優れるわけではない。また、生物汚染も課題として挙げられる。特許文献１では、非特異反応を低減する為に、ポストコートされたラテックス免疫凝集用のリガンド感作粒子を開示している。しかし、ポストコート剤は水溶性で、物理的吸着によって粒子表面をコーティングしていることから、本質的に、希釈によって遊離する懸念がある。本実施形態に係るリガンド感作粒子は高度に親水性化された粒子であって、上記の非特異的な吸着を低減する能力を高めた粒子である。アルブミンなどのポストコートを必要とせず、上記課題を解決することができる。
　（検査試薬）
　本実施形態に係る体外診断用の検査試薬は、本実施形態に係るリガンド感作粒子と分散媒とを有する。本実施形態における検査試薬中に含有されるリガンド感作粒子の量は、０．００１質量％から２０質量％が好ましく、０．０１質量％から１０質量％がより好ましい。本発明の試薬は、本発明の目的を達成可能な範囲において、本発明のラテックス免疫凝集用のリガンド感作粒子の他に、溶剤やブロッキング剤などの第三物質を含んでも良い。溶剤やブロッキング剤などの第三物質は２種類以上を組み合わせて含んでも良い。本発明に用いる溶剤の例としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩衝液などの各種緩衝液が例示されるが、本発明の試薬に含まれる溶剤はこれらに限定されない。
　本実施形態における体外診断用の検査キットは、本実施形態に係る検査試薬と、その検査試薬を内包する筐体とを有する。本実施形態に係る検査キットとしては、本実施形態に係る検査試薬（以下、試薬１）に加えて、アルブミンを含有する反応緩衝液（以下、試薬２）を更に備えるものであることが好ましい。前記アルブミンとしては血清アルブミン等が挙げられ、プロテアーゼ処理されたものでも良い。試薬２に含有されるアルブミンの量は、０．００１質量％から５質量％を目安とするが、本実施形態における検査キットはこれに限定されない。試薬１と試薬２の両方、或いは何れか一方に、ラテックス免疫凝集測定用の増感剤を含有させても良い。ラテックス免疫凝集測定用増感剤として、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアルギン酸等が挙げられるこれらに限定されない。試薬１と試薬２の両方、或いは何れか一方に、界面活性剤を含有させても良い。界面活性剤は粒子やタンパク質を安定化させる効果があるため、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートやポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルなどが好適に用いられる。また、本実施形態における検査キットは、試薬１、試薬２に加え、陽性コントロール、陰性コントロール、血清希釈液等を備えていても良い。陽性コントロール、陰性コントロールの媒体として、測定しうる標的物質が含まれていない血清、生理食塩水の他、溶剤を用いても良い。
　（検出方法）
　本実施形態のラテックス免疫凝集法による検体中の標的物質の検出方法は、本実施形態のラテックス免疫凝集用のリガンド感作粒子と、標的物質を含む可能性のある検体とを混合することを特徴とするものである。また、本実施形態のラテックス免疫凝集用のリガンド感作粒子と検体との混合は、ｐＨ３．０からｐＨ１１．０の範囲で行われることが好ましい。また、混合温度は２０℃から５０℃の範囲であり、混合時間は１０秒から３０分の範囲である。また、本実施形態の検出方法における本実施形態のラテックス免疫凝集用のリガンド感作粒子の濃度は、反応系中、好ましくは０・００１質量％から５質量％、より好ましくは０．０１質量％から１質量％である。本実施形態の検出方法は、本実施形態のラテックス免疫凝集用のリガンド感作粒子と検体との混合の結果として生じる凝集反応を光学的に検出する。具体的には、凝集反応を光学的に検出することで、検体中の標的物質が検出され、更に標的物質の濃度も測定することができる。凝集反応を光学的に検出する方法としては、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出可能な光学機器を用いて、これらの値の変化量を測定すれば良い。
　（製造方法）
　本発明の実施形態に係る粒子の製造方法について説明する。本実施形態に係る粒子の製造方法は、以下の第１の工程と第２の工程を少なくとも含む。
　（第１の工程）
　ビニル系モノマー、水、ラジカル重合開始剤、及び水溶性ポリマーを混合して共重合体を含む粒子（粒状の共重合体）を形成させ、その粒子を含む水分散液を得る工程。
　（第２の工程）
　水分散液に、グリシジル基を有するシランカップリング剤、およびメルカプト基とカルボキシ基を有する化合物を混合することで、粒子の表面に上記式（１）で表される構造を形成させる工程。以下詳細を説明する。
　本実施形態における第１の工程は例えば、ビニル系モノマー、ビニル系官能基を有する有機シラン化合物、水溶性ポリマー、水、ラジカル重合開始剤を混合して粒状の共重合体を形成させ、水分散液を得る。ビニル系モノマー、ビニル系官能基を有する有機シラン化合物）、水溶性ポリマーとして、例えば、スチレン、３－メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、ポリビニルピロリドンを用いることができる。
　本実施形態における第１の工程は、例えば、前記重合体の水分散液に、グリシジル基を有するシランカップリング剤、メルカプト基とカルボキシ基を有する化合物、を混合する工程を含む。それにより、粒子表面に上記式（１）で表される構造、すなわち、カルボキシ基が導入された粒子の水分散液を得る。グリシジル基を有するシランカップリング剤、メルカプト基とカルボキシ基を有する化合物として例えば、３－グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、メルカプトコハク酸を用いることができる。
　ここで、粒状の共重合体の水分散液は、グリシジル基を有するシランカップリング剤と先に混合して、粒子表面にグリシジル基を修飾した後に、メルカプト基とカルボキシ基を有する化合物と混合してもよい。また、グリシジル基を有するシランカップリング剤と、メルカプト基とカルボキシ基を有する化合物を予め混合しておき、前記粒状共重合体の水分散液に、混ぜて粒子表面にカルボキシ基を修飾してもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　（実施例１　粒子の合成）
　２００ｍＬのフラスコに２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（東京化成社製、５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を１６０ｇ入れ、これにポリビニルピロリドンＫ－３０（キシダ化学社製、分子量４００００）１．３ｇを溶かした。次に３－メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（商品名：ＬＳ－３３８０、信越化学工業社製）４．１ｇ、スチレン（キシダ化学社製）１２．９ｇを添加し、室温で窒素を吹き込みながら撹拌を１０分間行った。その後オイルバスでフラスコ内の乳濁液を７０℃に加熱した。ペルオキソ二硫酸カリウム（和光純薬工業社製）０．４ｇを純水１０ｍＬに溶かした溶液を、前記７０℃に加熱した乳濁液中に添加した。７０℃のまま７時間撹拌した後、室温に戻し、粒子（以下、ＳＡ１とする）の分散液を得た。
　さらに、ＳＡ１の分散液を遠心分離器にかけ、ＳＡを回収し、上澄みは捨てた。回収したＳＡ１は、純水中に再分散した後、再度遠心分離器にかけた。遠心分離器によるＳＡ１の回収と純水による再分散を４回繰り返した。
　ＤＬＳにより、ＳＡ１の平均粒径を評価したところ、１６１ｎｍであった。
　次にＳＡ１に対して、３－グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、および、メルカプト基とカルボキシ基を有する化合物を表１に示す通りに混合し、６０℃で２４時間反応させた。粒子溶液の電気伝導度を測定しながら酸塩基滴定することで、その滴定曲線から粒子のカルボキシ基の量を算出することができる。作製した粒子のカルボキシ基の量を表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　（比較例１　アミノ基とカルボキシ基を有する化合物を用いたカルボキシ基修飾）
　実施例１に記載のメルカプト基とカルボキシ基を有する化合物を、アミノ基とカルボキシ基を有する化合物に変えたのみは、ＳＡＳ１と同じ方法で粒子を作製した（以下、ＳＡＮ１とする）。カルボキシ基の量を算出した結果、ＳＡＮ１は、１３ｎｍｏｌ／ｍｇであり、実施例１に記載の粒子と比較して少ないことが分かった。この理由のひとつは、グリシジル基に対する反応性がメルカプト基の方が優れているためであると考えられる。別の理由としては、ＳＡＮ１においては、グリシジル基にカルボキシ基が反応する反応が起きていたためであると考えられる。
　（比較例２　ポリスチレン粒子）
　比較例として、カルボキシ基を有するポリスチレン粒子であるイムテックス（ＪＳＲ製、Ｐ０１１３，１８８ｎｍ）を用いた。イムテックスをイオン交換水で０．１ｗｔ溶液に希釈したものを用いた。
　（実施例２　粒子の非特異的な凝集反応（非特異凝集）の評価）
　粒子の非特異凝集は免疫比濁法により評価した。ヒト血清と粒子を接触させ、非特異的に起こる粒子の凝集を濁度を指標として吸光度計で計測する方法である。非特異凝集が起きれば、吸光度が増加する。吸光度の測定には、紫外可視分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ　１３００、ＧＥヘルスケア）を用い、試料はプラスチックセル（サンプル量　最少７０μＬ）に注入し光路長１０ｍｍにて測定した。以下に、具体的に測定方法を示す。
　ヒト血清５μＬとＲ１緩衝液５０μＬをプラスチックセル内で混和し、３７℃で５分間加温した。粒子分散溶液（粒子濃度０．１ｗｔ％）５０μＬを、ヒト血清を含むＲ１緩衝液（５５μＬ）に添加し、気泡が入らないよう注意しながら素早くピペッティングし、サンプルとした。サンプルの５７２ｎｍの吸光度を読み取り、Ａｂｓ１とした。サンプルを３７℃で５分間加温した後、サンプルの５７２ｎｍの吸光度を読み取り、Ａｂｓ２とした。Ａｂｓ２からＡｂｓ１を引いた値を求め、１００００倍したものを、ΔＯＤｘ１００００値とする。ΔＯＤｘ１００００値が２０００以上であれば非特異凝集が起きていると判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　結果を表２に示す。本実施例の粒子は、ΔＯＤｘ１００００は２０００以下であり、非特異反応は認められなかった。一方、被覆されていないポリスチレン粒子であるイムテックスは、１００００以上のΔＯＤｘ１００００が認められた。分散液の吸光度上昇は、分散液中の粒子に、ヒト血清に含まれる物質が非特異的に吸着した結果、粒子間凝集が生じることに起因すると考察できることから、イムテックスは血清により非特異凝集したことがわかった。本実施例の粒子は、市販のポリスチレン粒子と比較して非特的吸着を低減できることが確認された。
　（実施例３　抗体感作粒子の調製）
　本実施例の粒子の分散液（濃度１．０質量％溶液、１０ｍｇ／ｍＬ）を０．１ｍＬ（粒子１ｍｇ）、それぞれマイクロチューブ（容量１．５ｍＬ）に移し取った。これらに、０．１２ｍＬの活性化緩衝液（２５ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０）を添加して、４℃、１５０００ｒｐｍ（２０４００ｇ）で２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清をピペッタで廃棄した。続いて、活性化緩衝液０．１２ｍＬを添加して、超音波洗浄器（商品名：ＭＯＤＥＬ　ＶＳ－１００ＩＩＩ　アズワン３周波超音波洗浄器、アズワン社製、２８ｋＨｚ）を用いて超音波により分散させた。次に、４℃で１５０００ｒｐｍ（２０４００ｇ）、２０分間遠心分離した。上清をピペッタで廃棄し、活性化緩衝液０．１２ｍＬを添加して、超音波にて分散させた。続いて４℃、１５０００ｒｐｍ（２０４００ｇ）で２０分間遠心分離し、上清をピペッタで廃棄した。続いてＷＳＣ溶液（ＷＳＣ５０ｍｇを活性化緩衝液１ｍＬに溶解させたもの）及びＮ－ヒドロキシスルホコハク酸イミド（Ｓｕｌｆｏ　ＮＨＳ）溶液（Ｓｕｌｆｏ　ＮＨＳ５０ｍｇを活性化緩衝液１ｍＬに溶解させたもの）をそれぞれ６０μＬ添加した。添加後、超音波にて分散させた。さらに室温で３０分間撹拌することで、粒子のカルボキシ基を活性エステルに変換させた。
　次に、分散液を４℃、１５０００ｒｐｍ（２０４００ｇ）で２０分間遠心分離し、上清をピペッタで廃棄した。固定化緩衝液（２５ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．０）０．２ｍＬを添加して、超音波にて分散させた。４℃、１５０００ｒｐｍ（２０４００ｇ）で２０分間遠心分離し、上清をピペッタで廃棄した。固定化緩衝液を粒子１ｍｇあたり５０μＬ添加して、カルボキシ基が活性化された粒子を超音波にて分散させた。
　抗ヒトＣＲＰ抗体（ポリクローナル抗体）を１００μｇ／５０μＬとなるように固定化緩衝液で希釈した（抗体溶液と記載する）。カルボキシ基が活性化された粒子の溶液５０μＬ（粒子１ｍｇを含む）に抗体溶液５０μＬを添加して、超音波にて粒子を分散させた。仕込みの抗体量は、粒子１ｍｇあたり１００μｇとなる（１００μｇ／ｍｇ）。室温、６０分間、チューブを撹拌して、抗体を粒子のカルボキシ基に固定させた。次いで、４℃、１５０００ｒｐｍ（２０４００ｇ）で２０分間遠心分離し、上清をピペッタで廃棄した。
　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）を含む活性エステル不活化緩衝液（１Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０に０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むもの）０．２４ｍＬを添加して、超音波にて分散させた。室温で１時間撹拌し、残存している活性化エステルにＴｒｉｓを結合させた後、４℃で一晩、静置した。
　次に、４℃、１５０００ｒｐｍ（２０４００ｇ）で２０分間遠心分離し、上清をピペッタで廃棄した。洗浄・保存緩衝液（１０ｍＭ　２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ｐＨ７．９）０．２ｍＬを添加して、超音波にて分散させた。洗浄・保存緩衝液０．２ｍＬによる洗浄操作を２回繰り返した後、洗浄・保存緩衝液１．０ｍＬを添加して、超音波にて分散させた。上記の工程で、粒子のロスがほとんど見られないので、最終的に抗体感作粒子の濃度は０．１質量％（１ｍｇ／ｍＬ）となった。冷蔵庫で保存し、使用時には超音波にて再分散させた。
　（比較例３　比較例の粒子への抗体感作）
　比較例として、前述のＳＡＮ１、および、ＪＳＲ製ポリスチレン粒子（イムテックス、Ｐ０１１３）に抗体を感作した。実施例３の粒子を変更した以外は、実施例３と同様の実験操作によって比較例としての抗体感作粒子を得た。
　（実施例４　抗体感作効率の測定）
　タンパク定量により、抗体が粒子に感作（固定）していることを確認した。具体的には、抗体感作粒子とＢＣＡ試薬を反応させる方法である。まず、抗体感作粒子の分散液（０．１％溶液）を２５μＬ（粒子量２５μｇ）分取した。プロテインアッセイＢＣＡキット（和光純薬）のＡ液　７ｍＬ、Ｂ液　１４０μＬを混合して、ＡＢ液とした。粒子溶液（２５μＬ）に対して、ＡＢ液２００μＬを加え、６０℃で３０分間インキュベートした。
　溶液を４℃で１５０００ｒｐｍ（２０４００ｇ）、５ｍｉｎ、遠心し、上清２００μＬをピペッタで回収した。標準サンプル（抗体を１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳで０～２００μｇ／ｍＬの範囲で数点）とともにマルチモードマイクロプレートリーダー（ＳｙｎｅｒｇｙＭＸ，ＢｉｏＴｅｋ）で５６２ｎｍの吸光度を測定した。標準曲線から抗体量を算出した。粒子への抗体感作量（粒子重量あたりの抗体結合量（抗体固定化量）（μｇ／ｍｇ））は、算出した抗体量を粒子重量（ここでは０．０２５ｍｇ）で割ることで求めた。感作効率は、仕込んだ抗体量から求めた。結果を表３に示す。本実施例の抗体感作粒子は、比較例に比べて、感作効率が高いことが分かった。
　本実施例の粒子の高い感作効率について説明する。本実施例の粒子は、カルボキシ基が表面近傍に位置しており、また粒子表面は水溶性ポリマー（ＰＶＰ）で被覆されている。
　つまり、表面電荷はマイナスで均一であり、非常に親水性が高い。親水性表面は高い非特異吸着抑制能を示す。感作時、抗体はカチオニックな状態であり、マイナス表面である粒子のカルボキシ基の領域と静電的に引き合う。この結果、抗体は粒子表面に濃縮され、粒子表面での抗体とカルボキシ基の反応が大きく促進される。その結果、粒子への抗体感作率が向上すると考えられる。カルボキシ基のＮＨＳ活性化エステルは水中で速やかに加水分解するため、抗体の粒子表面への濃縮作用が重要なプロセスである。
　比較例のＳＡＮ１粒子は、粒子表面近傍にカルボキシ基と、アミノ基が位置しており、本実施例の粒子に比較して、表面電荷のマイナスが少ない。その結果粒子への抗体感作率が低下したと考えられる。
　一方で、市販のポリスチレンでは粒子表面が疎水性であることから、カルボキシ基領域以外の疎水部への抗体の物理吸着が起こる。物理吸着は脱離と吸着を繰り返すことになる結果、市販のポリスチレン粒子では、感作効率は低くなると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　（実施例５　抗体感作粒子のヒトＣＲＰ抗原に対する感度評価）
　抗体感作粒子の感度はラテックス免疫凝集法により評価した。具体的には、抗原に抗体感作粒子を反応させ、免疫複合体の凝集物を形成させ、その凝集物に光を照射して、散乱による照射光の減衰（吸光度）を吸光度計で計測する方法である。検体に含まれる抗原量に依存して凝集物の割合が増加して、吸光度が増加する。感度の評価では、既定のＰＳＡ濃度における吸光度の増加量（ΔＯＤｘ１００００で記載）が大きいことが望ましい。吸光度の測定には、紫外可視分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ　１３００、ＧＥヘルスケア）を用い、試料はプラスチックセルに注入し光路長１０ｍｍにて測定した。以下に、具体的に測定方法を示す。
　具体的には、ＣＲＰ溶液（ＣＲＰ濃度　０μｇ／ｍＬ、または、１６０μｇ／ｍＬ）１μＬをサンプルとして、このサンプルとＲ１緩衝液５０μＬをプラスチックセル内で混和し、３７℃で５分間加温した。抗体感作粒子の分散溶液（粒子濃度０．１ｗｔ％，１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９，０．０１ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）５０μＬを、ＣＲＰを含むＲ１緩衝液（５１μＬ）に添加し、気泡が入らないよう注意しながら素早くピペッティングし、サンプルとした。サンプルの５７２ｎｍの吸光度を読み取り、Ａｂｓ１とした。サンプルを３７℃で５分間加温した後、サンプルの５７２ｎｍの吸光度を読み取り、Ａｂｓ２とした。Ａｂｓ２からＡｂｓ１を引いた値を求め、１００００倍したものを、ΔＯＤｘ１００００値とした。
　結果を表４に示す。本実施例の抗体感作粒子は、ＣＲＰの存在下、ΔＯＤｘ１００００の増加が認められた。これは、抗原であるＣＲＰに抗体感作粒子が結合し、粒子凝集体を形成した結果であり、ラテックス免疫凝集法に用いるための粒子として機能することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　（実施例６　スチレンスルホン酸系モノマーを用いる粒子の合成）
　２００ｍＬのフラスコにＭＥＳ緩衝液（東京化成社製、５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を１６０ｇ入れ、これにポリビニルピロリドンＫ－３０（キシダ化学社製、分子量４００００）２ｇを溶かした。次に３－メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（商品名：ＬＳ－３３８０、信越化学工業社製）２ｇ、スチレン（キシダ化学社製）６．４ｇ、ｐ－スチレンスルホン酸ナトリウム（東京化成社製）０．１ｇを添加し、室温で窒素を吹き込みながら撹拌を１０分間行った。その後オイルバスでフラスコ内の乳濁液を７０℃に加熱した。ペルオキソ二硫酸カリウム（和光純薬工業社製）０．５ｇを純水１０ｍＬに溶かした溶液を、前記７０℃に加熱した乳濁液中に添加した。７０℃のまま７時間撹拌した後、室温に戻し、粒子（以下、ＳＡ２とする）の分散液を得た。
　さらに、ＳＡ２の分散液を遠心分離器にかけ、ＳＡ２を回収し、上澄みは捨てた。回収したＳＡ２は、純水中に再分散した後、再度遠心分離器にかけた。遠心分離器によるＳＡ２の回収と純水による再分散を４回繰り返した。
　ＤＬＳにより、ＳＡ２の平均粒径を評価したところ、７２ｎｍであった。
　次にＳＡ２に対して、３－グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、および、メルカプト基とカルボキシ基を有する化合物を表５に示す通りに混合し、７０℃で２４時間反応させた。作製した粒子（ＳＡＳ５）のカルボキシ基の量を表５にまとめた。ＤＬＳにより、ＳＡＳ５の平均粒径を評価したところ、７６ｎｍであった。すなわち、スチレンスルホン酸系モノマーを用いた粒子においても、同様に粒径の増加とカルボキシ基の存在が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０２１年３月３１日提出の日本国特許出願特願２０２１－０６１１２１と２０２２年１月１９日提出の日本国特許出願特願２０２２－００６４４３を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。

Claims (13)

  1. 　ビニル系モノマーに由来する繰り返し単位を含む重合体を有する粒子であって、
    　前記粒子は下記式（１）で表される構造を有し、前記粒子の表面には水溶性ポリマーを有する粒子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    　上記式（１）において、Ｘは式（１）におけるＳｉと結合する前記重合体に含まれる原子を表し、
    　Ｒはカルボキシ基または水素原子であり、
    　Ｌ１、Ｌ２は各々独立に、炭素数１以上１５以下のアルキレン基またはオキシアルキレン基である。
  2. 　前記重合体が、スチレン系モノマーに由来する繰り返し単位、およびビニル系官能基を有する有機シラン化合物に由来する繰り返し単位を含む請求項１に記載の粒子。
  3. 　前記重合体が、下記式（２）で表される繰り返し単位と、下記式（３）で表される繰り返し単位とを含む請求項１または２に記載の粒子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    　上記式（３）において、Ａ１乃至Ａ３は各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、及び単結合を介して式（３）におけるＳｉと結合する結合手、のいずれかである。
  4. 　前記重合体が下記式（４）で表される繰り返し単位をさらに含む請求項１乃至３のいずれか一項に記載の粒子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    　上記式（４）におけるＹは、Ｈ、Ｎａ、Ｋのいずれかである。
  5. 　前記粒子の粒径が５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である請求項１乃至４のいずれか一項に記載の粒子。
  6. 　前記水溶性ポリマーが、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、及びポリビニルピロリドンで構成される群から選択される少なくとも一種である請求項１乃至５のいずれか一項に記載の粒子。
  7. 　前記粒子がシロキサン結合を含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の粒子。
  8. 　請求項１乃至７のいずれか一項に記載の粒子に含まれるカルボキシ基に、リガンドが結合しているリガンド感作粒子。
  9. 　前記粒子に結合している前記リガンドの結合量が、前記粒子１ｍｇに対して、１μｇ以上５００μｇ以下である請求項８に記載のリガンド感作粒子。
  10. 　請求項８または９に記載のリガンド感作粒子と、前記リガンド感作粒子を分散させる分散媒と、を有する体外診断用の検査試薬。
  11. 　前記リガンドが抗体または抗原であり、ラテックス免疫凝集法により、検体中の抗原または抗体の検出に用いられる請求項１０に記載の検査試薬。
  12. 　請求項１０または１１に記載の検査試薬と、前記検査試薬を内包する筐体とを有する体外診断用の検査キット。
  13. 　ビニル系モノマー、水、ラジカル重合開始剤、及び水溶性ポリマーを混合して重合体を含む粒子を形成させ、前記粒子を含む水分散液を得る第１の工程と、
    　前記水分散液に、グリシジル基を有するシランカップリング剤、およびメルカプト基とカルボキシ基を有する化合物を混合することで、前記粒子の表面に下記式（１）で表される構造を形成させる第２の工程を有する粒子の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    　上記式（１）において、Ｘは式（１）におけるＳｉと結合する前記重合体に含まれる原子を表し、
    　Ｒはカルボキシ基または水素原子であり、
    　Ｌ１、Ｌ２は各々独立に、炭素数１以上１５以下のアルキレン基またはオキシアルキレン基である。
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