JP5288348B2 - 高分子微粒子の製造方法 - Google Patents
高分子微粒子の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5288348B2 JP5288348B2 JP2008539826A JP2008539826A JP5288348B2 JP 5288348 B2 JP5288348 B2 JP 5288348B2 JP 2008539826 A JP2008539826 A JP 2008539826A JP 2008539826 A JP2008539826 A JP 2008539826A JP 5288348 B2 JP5288348 B2 JP 5288348B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- latex
- antigen
- reagent
- bsa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 20
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims description 19
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 title claims description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 138
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 67
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 67
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 67
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 28
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 14
- DCAYPVUWAIABOU-UHFFFAOYSA-N alpha-n-hexadecene Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC DCAYPVUWAIABOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 11
- 239000007870 radical polymerization initiator Substances 0.000 claims description 9
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 8
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 8
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 8
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 7
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- 239000012966 redox initiator Substances 0.000 claims description 6
- 238000007720 emulsion polymerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims description 2
- DCAYPVUWAIABOU-NJFSPNSNSA-N hexadecane Chemical group CCCCCCCCCCCCCCC[14CH3] DCAYPVUWAIABOU-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 148
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 148
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 60
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 description 29
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 20
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 18
- 230000008859 change Effects 0.000 description 15
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 13
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 12
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 12
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 5
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 4
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 239000000282 fibrinogen degradation product Substances 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000004342 Benzoyl peroxide Substances 0.000 description 2
- OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N Benzoylperoxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OOC(=O)C1=CC=CC=C1 OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710138848 Chymotrypsin-like elastase family member 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100023336 Chymotrypsin-like elastase family member 3B Human genes 0.000 description 2
- 239000003154 D dimer Substances 0.000 description 2
- 101710099240 Elastase-1 Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 2
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 2
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 2
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 2
- 102000012607 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 2
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 2
- 102000003801 alpha-2-Antiplasmin Human genes 0.000 description 2
- 108090000183 alpha-2-Antiplasmin Proteins 0.000 description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- -1 ammonium peroxide Chemical class 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium peroxydisulfate Substances [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)OOS([O-])=O VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019400 benzoyl peroxide Nutrition 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N decan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCO MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N di-tert-butyl peroxide Chemical compound CC(C)(C)OOC(C)(C)C LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- 150000004968 peroxymonosulfuric acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-difluorophenoxy)pyridin-3-amine Chemical compound NC1=CC=CN=C1OC1=CC=C(F)C=C1F LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYGWHHGCAGTUCH-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-cyano-4-methylpentan-2-yl)diazenyl]-2,4-dimethylpentanenitrile Chemical compound CC(C)CC(C)(C#N)N=NC(C)(C#N)CC(C)C WYGWHHGCAGTUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWTYTFSSTWXZFU-UHFFFAOYSA-N 3-chloroprop-1-enylbenzene Chemical compound ClCC=CC1=CC=CC=C1 IWTYTFSSTWXZFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFXXTYGQYWRHJP-UHFFFAOYSA-N 4,4'-azobis(4-cyanopentanoic acid) Chemical compound OC(=O)CCC(C)(C#N)N=NC(C)(CCC(O)=O)C#N VFXXTYGQYWRHJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011546 CRP measurement Methods 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000001016 Ostwald ripening Methods 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000005396 acrylic acid ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000001767 cationic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 125000005397 methacrylic acid ester group Chemical group 0.000 description 1
- ZQMHJBXHRFJKOT-UHFFFAOYSA-N methyl 2-[(1-methoxy-2-methyl-1-oxopropan-2-yl)diazenyl]-2-methylpropanoate Chemical compound COC(=O)C(C)(C)N=NC(C)(C)C(=O)OC ZQMHJBXHRFJKOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L sodium persulfate Substances [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MNCGMVDMOKPCSQ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-phenylethenesulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)C=CC1=CC=CC=C1 MNCGMVDMOKPCSQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 150000003440 styrenes Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920003051 synthetic elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005061 synthetic rubber Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F2/00—Processes of polymerisation
- C08F2/12—Polymerisation in non-solvents
- C08F2/16—Aqueous medium
- C08F2/22—Emulsion polymerisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F2/00—Processes of polymerisation
- C08F2/44—Polymerisation in the presence of compounding ingredients, e.g. plasticisers, dyestuffs, fillers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/5436—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand physically entrapped within the solid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Polymerization Catalysts (AREA)
- Polymerisation Methods In General (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
本発明は、ミニエマルション重合において抗原又は抗体を共存させることにより、前記抗原又は抗体が表面に導入された高分子微粒子の製造方法に関する。
現在、臨床診断検査の現場では、多数の検体について疾病診断の指標となる多岐に渡る物質を短時間且つ高精度に測定し、その結果を迅速・正確に治療現場にフィードバックすることが求められており、中でも抗原抗体反応を利用した免疫学的測定によって、微量な分析対象物の正確な定量が多く実施されている。特に検出感度や正確性を向上させるための方法として、分析対象物質に対する抗原又は抗体を、ポリスチレン等の合成高分子（いわゆるラテックス）粒子の表面に担持させた粒子を利用したラテックス凝集法が公知である。ラテックス凝集法とは、分析対象物質と、ラテックス粒子に結合した抗原又は抗体との反応により生じるラテックス粒子の凝集の程度を目視あるいは光学的に検出することにより、短時間に分析対象物質を測定する方法である。
また、ラテックス粒子を磁性粒子にすることで、磁性粒子に結合した第一抗体により分析対象物をトラップし、磁石で集積させて未反応物等を洗浄後（いわゆるＢ／Ｆ分離）、酵素や蛍光剤等シグナルを発生する物質を標識した第二抗体を添加して分析するサンドイッチ法も多用されている。
抗原抗体反応によって定量する分析対象物質の多くは、一般的に生体試料中に含まれる微量成分であり、低濃度領域における定量性を重視している。しかし、疾病の進行度合いによっては測定対象物質濃度が異常に高値を示す場合があるため、臨床検査の現場においては、低値から高値までを正確に測定できる性能を有する試薬が求められている。
また、ラテックス粒子を磁性粒子にすることで、磁性粒子に結合した第一抗体により分析対象物をトラップし、磁石で集積させて未反応物等を洗浄後（いわゆるＢ／Ｆ分離）、酵素や蛍光剤等シグナルを発生する物質を標識した第二抗体を添加して分析するサンドイッチ法も多用されている。
抗原抗体反応によって定量する分析対象物質の多くは、一般的に生体試料中に含まれる微量成分であり、低濃度領域における定量性を重視している。しかし、疾病の進行度合いによっては測定対象物質濃度が異常に高値を示す場合があるため、臨床検査の現場においては、低値から高値までを正確に測定できる性能を有する試薬が求められている。
ラテックス凝集法でもサンドイッチ法でも、ラテックス粒子を用いる場合には、ラテックス粒子の表面に抗原又は抗体を固定することが必要であり、その方法としては、物理的又は化学的に担持させる方法が用いられている。例えば、物理的吸着によりラテックス粒子に抗原又は抗体を直接固定化するか、あるいは、ラテックス粒子の表面の官能基、例えば、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、又はエポキシ基などを介した共有結合により、ラテックス粒子に抗原又は抗体を結合させる方法が使用されている。
しかし、これらの物理的又は化学的な結合方法では、ラテックス表面に担持可能な抗原又は抗体の量に限界があり、前記ラテックス凝集法やサンドイッチ法の実施には測定範囲や検出感度の面で限界があった。即ち、ラテックス粒子自体の特性（表面の電荷、官能基の導入率、粒度分布等）がロット間、メーカー間で一定ではなく、その為、抗原又は抗体を結合する操作が一定であっても、調製された抗体結合ラテックス粒子の性能はバラツキが生じる。例えば、ラテックス表面への物理的又は化学的な結合方法においても、抗原又は抗体が全て結合できずに、結合後の洗浄により取り除かれたり、遠心や分散処理により、結合した抗原又は抗体が剥がれ落ちたりした。即ち、結合する抗原又は抗体の量がばらつくため、測定範囲や検出感度に影響がある。
また、近年あらたな問題として、非特許文献１に開示されているように、ラテックス粒子表面に抗原又は抗体を結合させることで抗原又は抗体に構造的な変性が起こり、試料中に共存する「変性部位に対して結合する物質」による非特異反応を起こす検体がみられることがあった。これにより、測定結果の信頼性が失われることになり、正確な疾病診断ができなくなる。この問題は、抗原又は抗体、あるいはラテックス粒子をそれぞれ個別に検討しても解決できるものではなく、非常に困難性の高い課題である。
また、近年あらたな問題として、非特許文献１に開示されているように、ラテックス粒子表面に抗原又は抗体を結合させることで抗原又は抗体に構造的な変性が起こり、試料中に共存する「変性部位に対して結合する物質」による非特異反応を起こす検体がみられることがあった。これにより、測定結果の信頼性が失われることになり、正確な疾病診断ができなくなる。この問題は、抗原又は抗体、あるいはラテックス粒子をそれぞれ個別に検討しても解決できるものではなく、非常に困難性の高い課題である。
「臨床病理」，２０００年８月，第４８巻，第８号，７６０−７６３頁
本発明者は、これまで用いられてきた物理的又は化学的な結合方法に代わる、ラテックス表面への抗原又は抗体の結合方法を鋭意検討した結果、ラテックス粒子を合成する際に、抗原又は抗体であるタンパク質を同時に共存させておくことにより、合成完了時に前記抗原又は抗体がラテックス粒子表面に導入されたラテックス粒子が得られることを見出した。しかも、驚くべきことに、導入された抗原又は抗体の特性は維持されたまま、物理的吸着等による従来試薬と比較して、前記ラテックス粒子が分析対象物と高い反応性を示すこと、更には、ラテックス粒子表面に導入された抗原又は抗体は、結合による構造的な変性が起こることがなく、従って従来みられていた非特異反応を起こす検体との反応が回避できることも見出した。本発明者は、ラテックス粒子の合成反応において、前記抗原又は抗体を共存させた状態で、特定条件下でモノマーを重合させることができることを見出し、本発明を完成させた。
本発明の課題は、検出感度が高く、且つ、従来発生していた非特異的反応を回避することができる免疫学的分析試薬を提供可能な、新規の高分子微粒子製造法を提供することにある。
前記課題は、本発明による、モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤、及びハイドロフォーブを用いてミニエマルション重合を行う際に、抗原又は抗体を共存させて高分子微粒子を製造することを特徴とする、表面に前記抗原又は抗体が導入された高分子微粒子の製造方法により解決することができる。
また、本発明は、前記製造方法により得られる、高分子微粒子の表面にタンパク質が導入された高分子微粒子に関する。
また、本発明は、前記製造方法により得られる、高分子微粒子の表面にタンパク質が導入された高分子微粒子に関する。
本発明の好ましい態様によれば、前記ミニエマルション重合が、重合反応を低温（好ましくは０〜４０℃）で行う低温エマルション重合である。
本発明の別の好ましい態様によれば、前記ラジカル重合開始剤がレドックス開始剤であり、より好ましくはアスコルビン酸とＨ２Ｏ２との組合せである。
本発明の更に別の好ましい態様によれば、前記乳化剤が界面活性剤であり、より好ましくはポリエチレングリコール鎖を有する重合性界面活性剤である。
本発明の更に別の好ましい態様によれば、前記ハイドロフォーブがヘキサデカン又はポリスチレンである。
本発明の別の好ましい態様によれば、前記ラジカル重合開始剤がレドックス開始剤であり、より好ましくはアスコルビン酸とＨ２Ｏ２との組合せである。
本発明の更に別の好ましい態様によれば、前記乳化剤が界面活性剤であり、より好ましくはポリエチレングリコール鎖を有する重合性界面活性剤である。
本発明の更に別の好ましい態様によれば、前記ハイドロフォーブがヘキサデカン又はポリスチレンである。
更に、本発明は、
［１］ラテックス粒子の合成反応において、分析対象物質に対する抗原又は抗体を共存させた状態でモノマーを重合させ、前記ラテックス粒子の表面に前記抗原又は抗体が導入されたラテックス粒子の懸濁液を含む、免疫学的分析試薬；
［２］（１）分析対象化合物を含む可能性のある被検試料と、
（２）ラテックス粒子の合成反応において、前記分析対象物質に対する抗原又は抗体を共存させた状態でモノマーを重合させ、前記ラテックス粒子の表面に前記抗原又は抗体が導入されたラテックス粒子と
を液中で接触させる、免疫学的分析方法；
［３］前記接触の後、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する、［２］の免疫学的分析方法；
［４］前記接触の後、前記液と前記ラテックス粒子とを分離し、前記ラテックス粒子に結合した分析対象物質、あるいは、前記液中に残存する分析対象物質を分析する、［２］の免疫学的分析方法
に関する。
［１］ラテックス粒子の合成反応において、分析対象物質に対する抗原又は抗体を共存させた状態でモノマーを重合させ、前記ラテックス粒子の表面に前記抗原又は抗体が導入されたラテックス粒子の懸濁液を含む、免疫学的分析試薬；
［２］（１）分析対象化合物を含む可能性のある被検試料と、
（２）ラテックス粒子の合成反応において、前記分析対象物質に対する抗原又は抗体を共存させた状態でモノマーを重合させ、前記ラテックス粒子の表面に前記抗原又は抗体が導入されたラテックス粒子と
を液中で接触させる、免疫学的分析方法；
［３］前記接触の後、抗原抗体反応により生じたラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する、［２］の免疫学的分析方法；
［４］前記接触の後、前記液と前記ラテックス粒子とを分離し、前記ラテックス粒子に結合した分析対象物質、あるいは、前記液中に残存する分析対象物質を分析する、［２］の免疫学的分析方法
に関する。
本発明によれば、検出感度が高く、且つ、従来発生していた非特異的反応を回避可能な免疫学的分析試薬を提供可能な新規高分子微粒子を提供することができる。
本発明の製造方法は、ミニエマルション重合を行う際に抗原又は抗体を共存させることを特徴とする。本発明の製造方法によれば、高分子微粒子（特にラテックス粒子）の表面に前記抗原又は抗体が導入された高分子微粒子（特にラテックス粒子）（以下、パートナー導入高分子微粒子と称する）を製造することができる。
本発明の製造方法は、重合反応の際に抗原又は抗体を共存させること以外は、従来公知のミニエマルション重合（例えば、M. Antonietti, K. Landfester, Prog. Polym. Sci., 2002, 27, 689-757、J.
M. Asua, Prog. Polym. Sci., 2002, 27, 1283-1346）と同様にして実施することができる。
M. Asua, Prog. Polym. Sci., 2002, 27, 1283-1346）と同様にして実施することができる。
通常のミニエマルション重合は、これに限定されるものではないが、例えば、モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤、及びハイドロフォーブを混合する工程、前記混合物を剪断する工程、並びに前記混合物を重合開始温度まで加熱して重合させる工程を含むことができる。ミニエマルション重合では、重合用モノマーと乳化剤とを混合した後、例えば、超音波照射による剪断工程を実施することにより、前記剪断力によりモノマーが引きちぎられ、乳化剤に覆われたモノマー微小油滴が形成される。ラジカル重合開始剤の重合開始温度まで加熱することにより、モノマー微小油滴をそのまま重合し、高分子微粒子が得られる。
本発明で用いる抗原又は抗体は、界面活性を示す抗原又は抗体である限り、特に限定されるものではなく、ラテックス法（例えば、ラテックス凝集法、ラテックスを用いたＢ／Ｆ分離）に利用可能な抗原又は抗体であることが好ましい。或る抗原又は抗体が界面活性を示すか否かは、公知方法、例えば、表面張力測定、あるいは、ピレンを蛍光プローブに用いた蛍光スペクトル測定により確認することができる。また、本発明で使用する抗原又は抗体としては、前記ピレンを蛍光プローブに用いた蛍光スペクトル測定において、ピレンの第一発光ピーク（Ｉ１）と第三発光ピーク（Ｉ３）の強度比（Ｉ１／Ｉ３）が０．５〜１．６（より好ましくは０．６〜１．５）である抗原又は抗体が好ましい。例えば、前記抗原又は抗体としては、各種抗体、レセプター、酵素、脂質、糖鎖等を挙げることができ、具体的には、ＩｇＧ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン、β−２マイクログロブリン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ＩｇＥ、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＳ抗体又はＨＢｃ抗体）、Ｄダイマー、フィブリン・フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）、可溶性フィブリン（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｉｂｒｉｎ：ＳＦ）、プラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体（ＰＰＩ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エラスターゼ１、エラスターゼＸＤＰ、トロンボモジュリン、又はアルブミン（好ましくは血清アルブミン）等を挙げることができる。
抗体を用いる場合には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いることができる。また、抗体の種類としては、免疫グロブリン分子自体のほか、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ等も使用可能である。
本発明で用いることのできるモノマーとしては、通常のミニエマルション重合で使用可能なモノマーを使用することができ、例えば、スチレン、スチレン誘導体（例えば、クロロメチルスチレン、スチレンスルホン酸ナトリウム）、アクリル酸若しくはメタクリル酸、アクリル酸エステル若しくはメタクリル酸エステル［例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ヘキサデシル（メタ）アクリレート］、酢酸ビニルを挙げることができる。
本発明で用いることのできるラジカル重合開始剤としては、通常のミニエマルション重合で使用可能なラジカル重合開始剤を使用することができ、例えば、過酸化開始剤、過硫酸開始剤、アゾ系開始剤、又はレドックス開始剤を挙げることができる。本発明においては、重合反応を低温で行うことができる点で、レドックス開始剤を用いることが好ましい。重合反応時に共存させる抗原又は抗体が生理活性を有する場合、前記重合反応を低温で行うことにより、生理活性の低下を抑制することができる。
前記過酸化開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）、ジ−ｔ−ブチルペルオキシド（ＤＢＰＯ）、過酸化アンモニウムを挙げることができる。前記過硫酸開始剤としては、例えば、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、過硫酸ナトリウム（ＮＰＳ）を挙げることができる。前記アゾ系開始剤としては、例えば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ジメチル２，２’−アゾビスイソブチレート（ＭＡＩＢ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）を挙げることができる。
前記レドックス開始剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン［N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine（ＴＭＥＤＡ）］／過硫酸カリウム［potassium persulfate（ＫＰＳ）］、ＦｅＳＯ４／ＫＰＳ、ＦｅＳＯ４／Ｈ２Ｏ２、アスコルビン酸（ビタミンＣ）／Ｈ２Ｏ２等を挙げることができる。高い転化率（例えば、７５〜９８％）を達成することができる点で、アスコルビン酸／Ｈ２Ｏ２の組合せが好ましい。
本発明で用いることのできる乳化剤としては、ミニエマルション重合で一般に使用される各種界面活性剤を用いることができ、例えば、アニオン性化合物、カチオン性化合物、ノニオン性化合物を挙げることができる。前記ノニオン性化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有する重合性界面活性剤、長鎖アルコール、ポリビニルアルコール、Ｂｒｉｊ ３５（ＰＩＥＲＣＥ社）を挙げることができる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有する重合性界面活性剤としては、例えば、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ３（ｎは２以上の整数、好ましくは２〜１００、より好ましくは５〜８０、更に好ましくは８〜５０、特に好ましくは９〜２３）を挙げることができ、より具体的には、例えば、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３ＣＨ３［ｎ＝２３；（商品名）ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ（商品名）；新中村化学工業株式会社］、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）９ＣＨ３［ｎ＝９；（商品名）ＮＫエステルＭ−９０Ｇ；新中村化学工業株式会社］を挙げることができる。前記重合性界面活性剤を乳化剤として用いることで、立体反発による分散安定性を得ることができる。
前記長鎖アルコールとしては、例えば、１−ペンタノール、デカノールを挙げることができる。
前記長鎖アルコールとしては、例えば、１−ペンタノール、デカノールを挙げることができる。
本発明で用いることのできるハイドロフォーブとしては、通常のミニエマルション重合で使用可能なハイドロフォーブを使用することができ、例えば、ヘキサデカン、シルセスキオキサン、又は疎水性ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル）を挙げることができ、ヘキサデカン又はポリスチレンが好ましい。ハイドロフォーブを用いることにより、オストワルド熟成による粒径の不均一性の増大を抑制し、単分散なラテックス粒子を合成することができる。
重合時の反応条件、例えば、溶媒、混合比、温度、反応時間などは、使用するモノマー及び抗原又は抗体の種類、合成する高分子微粒子の平均粒径、微粒子表面に担持させる抗原又は抗体の量などに応じて、例えば、パイロット試験を実施することにより適宜決定することができる。
例えば、重合用モノマー（例えば、スチレンモノマー）４０ｍｍｏｌに対して、抗原又は抗体［例えば、ウシ血清アルブミン、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２］を、通常０．０１〜５ｇ、好ましくは０．０２〜２ｇ、より好ましくは０．０８〜０．８ｇの量で；ラジカル重合開始剤（例えば、アスコルビン酸、Ｈ２Ｏ２）を、通常０．０１〜４ｍｍｏｌ、好ましくは０．０２〜２ｍｍｏｌの量で；乳化剤（例えば、ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ、ＮＫエステルＭ−９０Ｇ）を、通常０．１〜１０ｍｍｏｌ、好ましくは０．２〜５ｍｍｏｌ、より好ましくは０．４〜４ｍｍｏｌの量で；それぞれ、用いることができる。反応時間は、通常１時間以上、好ましくは３〜４８時間、より好ましくは４〜２４時間である。反応温度は、通常０〜８０℃、好ましくは０〜６０℃、より好ましくは０〜４０℃である。
例えば、重合用モノマー（例えば、スチレンモノマー）４０ｍｍｏｌに対して、抗原又は抗体［例えば、ウシ血清アルブミン、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２］を、通常０．０１〜５ｇ、好ましくは０．０２〜２ｇ、より好ましくは０．０８〜０．８ｇの量で；ラジカル重合開始剤（例えば、アスコルビン酸、Ｈ２Ｏ２）を、通常０．０１〜４ｍｍｏｌ、好ましくは０．０２〜２ｍｍｏｌの量で；乳化剤（例えば、ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ、ＮＫエステルＭ−９０Ｇ）を、通常０．１〜１０ｍｍｏｌ、好ましくは０．２〜５ｍｍｏｌ、より好ましくは０．４〜４ｍｍｏｌの量で；それぞれ、用いることができる。反応時間は、通常１時間以上、好ましくは３〜４８時間、より好ましくは４〜２４時間である。反応温度は、通常０〜８０℃、好ましくは０〜６０℃、より好ましくは０〜４０℃である。
本発明の製造方法によれば、ラテックス粒子の表面に抗原又は抗体が導入されたラテックス粒子を製造することができる。
従来使用されているラテックス粒子では、例えば、物理的吸着によりラテックス粒子に抗原又は抗体を直接固定化するか、あるいは、ラテックス粒子の表面の官能基、例えば、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、又はエポキシ基などを介した共有結合により、ラテックス粒子に抗原又は抗体を結合させていた。本発明の製造方法で製造することのできる抗原又は抗体導入ラテックス粒子は、抗原又は抗体の一部がラテックス粒子に埋め込まれることにより、前記抗原又は抗体がラテックス表面に担持されているラテックス粒子である。
ラテックス粒子を合成する際に共存させる抗原又は抗体を導入させる方法として、低温ミニエマルション重合により作製されたラテックス粒子は、合成完了時に抗原又は抗体がラテックス粒子表面に導入させることで、従来結合できずに洗浄により取り除かれたり、遠心や分散処理により結合した抗原又は抗体が剥がれ落ちたりすることがないラテックス粒子を作製することができ、このようなラテックス粒子を使用することにより高い反応性を得ることが可能である。また、合成完了時に抗原又は抗体がラテックス粒子表面に導入されているため、結合による立体障害による変性が起こることがなく、従って従来みられていた非特異反応を起こす検体との反応を回避することができる。
本発明の製造方法において、ミニエマルション重合の際に共存させた抗原又は抗体が高分子微粒子（例えば、ラテックス）表面に導入される作用機序は明らかでないが、本発明者は以下のとおり推測している。すなわち、本発明で用いる抗原又は抗体は界面活性を示すため、その親水的な部分により、水との接合帯である高分子微粒子（例えば、ラテックス）表面に存在すると考えられる。なお、本発明は、この推測に限定されるものではない。
また、本発明は、新規の免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法に関する。本発明の免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法では、従来使用されている、物理的又は化学的結合によりラテックス表面に抗原又は抗体を担持させたラテックス粒子に代えて、ラテックス粒子の表面に抗原又は抗体（すなわち、免疫学的パートナー）が導入されたラテックス粒子（パートナー導入ラテックス粒子）を使用する。前記パートナー導入ラテックス粒子は、抗原又は抗体の一部がラテックス粒子に埋め込まれることにより、前記抗原又は抗体がラテックス表面に担持されているラテックス粒子である限り、特に限定されるものではないが、例えば、本発明の製造方法により調製することができる。
本発明では分析においてラテックス法（例えば、ラテックス凝集法、ラテックスを用いたＢ／Ｆ分離）を用いる。分析対象物質に対する抗原又は抗体（例えば、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又はそれらの抗体フラグメント）を導入したラテックス粒子と、分析対象物質とを接触させるラテックス上での抗原抗体反応を実施する系において、導入された抗原又は抗体が立体障害による変性のない状態であるため、変性部位に対する非特異的な検体とは反応せずに、従来法より高感度で分析対象物質を分析（検出又は測定、好ましくは測定）することができる。
本発明により分析することのできる物質（分析対象物質）は、一般に抗原抗体反応を利用して抗原又は抗体として分析することのできる物質（特に生理活性物質）であれば特に限定されない。分析対象物質の代表例としては、タンパク質、脂質、糖鎖等を挙げることができ、より詳しくは、例えば、各種抗体、レセプター、又は酵素等を挙げることができる。具体的には、ＩｇＧ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン、β−２マイクログロブリン、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ＩｇＥ、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＳ抗体又はＨＢｃ抗体）、Ｄダイマー、フィブリン・フィブリノゲン分解産物（ＦＤＰ）、可溶性フィブリン（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｉｂｒｉｎ：ＳＦ）、プラスミン・α２−プラスミンインヒビター複合体（ＰＰＩ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エラスターゼ１、エラスターゼＸＤＰ、トロンボモジュリン、又はアルブミン（好ましくは血清アルブミン）等を挙げることができる。
また、本発明で分析可能な被検試料は、前記分析対象物質を含む可能性のある試料であれば、特に限定されず、特には生体試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、又は細胞若しくは組織破砕液などを挙げることができる。
また、本発明で分析可能な被検試料は、前記分析対象物質を含む可能性のある試料であれば、特に限定されず、特には生体試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、又は細胞若しくは組織破砕液などを挙げることができる。
本発明では、その分析においてラテックス法を用いる。本発明におけるラテックス法では、分析対象物質に特異的に反応する抗原又は抗体を導入したラテックス粒子を用いる。
パートナー導入ラテックス粒子の平均粒径は、分析対象物質の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、通常、０．０５〜０．５μｍの範囲で適宣選択することができる。
パートナー導入ラテックス粒子の平均粒径は、分析対象物質の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、通常、０．０５〜０．５μｍの範囲で適宣選択することができる。
ラテックス粒子に導入させる抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いることができる。また、抗体の種類としては、免疫グロブリン分子自体のほか、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ等も使用可能である。
本発明による免疫学的分析試薬は、例えば、抗原又は抗体を導入したラテックス粒子と緩衝液を含む１液系の試薬；緩衝液である第１試薬と、抗原又は抗体を導入したラテックス粒子とモノクローナル抗体との両方を含む第２試薬とで構成される２液系の試薬；あるいは、緩衝液と導入したラテックス粒子との両方を含む第１試薬と、抗原又は抗体を感作したラテックス粒子を含む第２試薬とで構成される２液系の試薬など、種々の形態であることができる。
本発明においては、前記のような試薬を用いて凝集反応を行い、生じた凝集の度合い（凝集度）を光学的に分析（特には測定）することにより、被検試料中の分析対象物質の量を分析（特には測定）することができる。ラテックス粒子の凝集度を光学的に検出する具体的方法においては、例えば、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて測定を行うことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。測定方法は、公知の方法に従い、用いるラテックス粒子の大きさ（平均粒径）若しくは濃度の選択、又は反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより行うことができる。また、これらの方法を併用することも可能である。
あるいは、前記試薬と被検試料とを液中で接触させた後、Ｂ／Ｆ分離を行うことにより、ラテックス粒子と液とを分離し、前記ラテックス粒子に結合した分析対象物質、あるいは、前記液中に残存する分析対象物質を分析（特に測定）することにより、被検試料中の分析対象物質の量を分析（特には測定）することができる。
あるいは、前記試薬と被検試料とを液中で接触させた後、Ｂ／Ｆ分離を行うことにより、ラテックス粒子と液とを分離し、前記ラテックス粒子に結合した分析対象物質、あるいは、前記液中に残存する分析対象物質を分析（特に測定）することにより、被検試料中の分析対象物質の量を分析（特には測定）することができる。
本発明においては、導入させる抗原又は抗体の種類を選択することに加え、ラテックス凝集反応に影響を与える他の因子を調節することによって、ラテックス粒子凝集反応を更に精密に増幅し、低濃度域の定量可能範囲を更に拡張させることや更に非特異反応を抑制することができる。ラテックス凝集反応に影響を与える他の因子としては、例えば、ラテックス粒子の濃度、ラテックス粒子に導入される抗原若しくは抗体量、又はラテックス粒子の粒径等を挙げることができる。
本発明で用いる抗原抗体反応の条件は通常の条件と同様であってよく、反応媒体としては、分析対象物質の種類に応じた各種緩衝液を適宜選択することができる。この緩衝液は、分析対象物質を失活させることがなく、且つ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよい。例えば、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、又はトリス緩衝液を使用することができる。反応のｐＨは、５〜１０、特に６〜８が好ましい。反応温度は０〜５０℃、特に２０〜４０℃が好ましい。反応時間は適宜決めることができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：抗ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）抗体測定試薬の調製》
（１）ＢＳＡ導入ラテックス粒子の調製
スチレン４０ｍｍｏｌ、ヘキサデカン４ｍｍｏｌ、ＢＳＡ２００ｍｇ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３ＣＨ３（ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ；新中村化学工業株式会社）０．８ｍｍｏｌ、アスコルビン酸０．４ｍｍｏｌ、及び水２０ｇを混合し、ソニケーション（ＵＨ−３００：株式会社エスエムテー）を出力８０％、パルス５０％で氷浴下１５分間実施した。三口フラスコに入れ、１００ｒｐｍで攪拌しながら窒素バブリングを１５分間実施した後、Ｈ２Ｏ２ ０．４ｍｍｏｌを入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら３０℃又は６０℃で６時間重合してＢＳＡ導入ラテックス粒子を調製した。なお、得られたＢＳＡ導入ラテックス粒子の平均粒径は０．１０９μｍ（３０℃の場合）及び０．１２１μｍ（６０℃の場合）であった。
（１）ＢＳＡ導入ラテックス粒子の調製
スチレン４０ｍｍｏｌ、ヘキサデカン４ｍｍｏｌ、ＢＳＡ２００ｍｇ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３ＣＨ３（ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ；新中村化学工業株式会社）０．８ｍｍｏｌ、アスコルビン酸０．４ｍｍｏｌ、及び水２０ｇを混合し、ソニケーション（ＵＨ−３００：株式会社エスエムテー）を出力８０％、パルス５０％で氷浴下１５分間実施した。三口フラスコに入れ、１００ｒｐｍで攪拌しながら窒素バブリングを１５分間実施した後、Ｈ２Ｏ２ ０．４ｍｍｏｌを入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら３０℃又は６０℃で６時間重合してＢＳＡ導入ラテックス粒子を調製した。なお、得られたＢＳＡ導入ラテックス粒子の平均粒径は０．１０９μｍ（３０℃の場合）及び０．１２１μｍ（６０℃の場合）であった。
（２）ＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液の調製
ＢＳＡ導入ラテックス粒子（１％濃度）１ｍＬに対して、免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂株式会社）１ｍＬを添加し、室温にて３０分間攪拌した。この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、ＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液を調製した。
ＢＳＡ導入ラテックス粒子（１％濃度）１ｍＬに対して、免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂株式会社）１ｍＬを添加し、室温にて３０分間攪拌した。この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、ＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（３）緩衝液の調製
０．５重量％ＢＳＡを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ＰＨ８．０）に、０．９重量％の濃度となるように塩化ナトリウムを添加して緩衝液とした。以下、ＢＳＡを含まないＮａＣｌ含有トリス緩衝液を「緩衝液Ａ」と、ＢＳＡを含有するＮａＣｌ含有トリス緩衝液を「緩衝液Ｂ」と称する。
０．５重量％ＢＳＡを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ＰＨ８．０）に、０．９重量％の濃度となるように塩化ナトリウムを添加して緩衝液とした。以下、ＢＳＡを含まないＮａＣｌ含有トリス緩衝液を「緩衝液Ａ」と、ＢＳＡを含有するＮａＣｌ含有トリス緩衝液を「緩衝液Ｂ」と称する。
（４）抗ＢＳＡ抗体測定試薬
実施例１（２）で調製したＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液（第２試薬）と、実施例１（３）で調製した緩衝液Ａ又はＢ（第１試薬）とから構成される２液系の試薬を、本発明の免疫学的分析試薬としての抗ＢＳＡ抗体測定試薬として、以下の実施例で評価した。
実施例１（２）で調製したＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液（第２試薬）と、実施例１（３）で調製した緩衝液Ａ又はＢ（第１試薬）とから構成される２液系の試薬を、本発明の免疫学的分析試薬としての抗ＢＳＡ抗体測定試薬として、以下の実施例で評価した。
《実施例２：抗ＢＳＡ抗体標準溶液の測定》
（１）抗ＢＳＡ抗体標準溶液の調製
抗ＢＳＡ抗体（Rabbit Anti
cow albumin；DAKO社、９００単位）を生理食塩水で倍々希釈し、９００、４５０、２２５、１１３、５６、２８、１４、及び７単位濃度の標準抗ＢＳＡ抗体希釈列を調製した。
（１）抗ＢＳＡ抗体標準溶液の調製
抗ＢＳＡ抗体（Rabbit Anti
cow albumin；DAKO社、９００単位）を生理食塩水で倍々希釈し、９００、４５０、２２５、１１３、５６、２８、１４、及び７単位濃度の標準抗ＢＳＡ抗体希釈列を調製した。
（２）抗ＢＳＡ抗体標準溶液の測定
標準抗ＢＳＡ抗体希釈列１５μＬに、実施例１（３）で調製した緩衝液Ａ又はＢ９０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例１（２）で調製したＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液９０μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長８００／５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の５７０ｎｍ吸光度変化量と８００ｎｍ吸光度変化量の差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。
なお、比較のために、平均粒径０．１１μｍのポリスチレンラテックス粒子（日本合成ゴム製：固形分１０％）を用いて、前記粒子１％濃度１ｍＬにＢＳＡを０．３％（３ｍｇ／ｍＬ）量感作して調製したＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液を使用した。
標準抗ＢＳＡ抗体希釈列１５μＬに、実施例１（３）で調製した緩衝液Ａ又はＢ９０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例１（２）で調製したＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液９０μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長８００／５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の５７０ｎｍ吸光度変化量と８００ｎｍ吸光度変化量の差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。
なお、比較のために、平均粒径０．１１μｍのポリスチレンラテックス粒子（日本合成ゴム製：固形分１０％）を用いて、前記粒子１％濃度１ｍＬにＢＳＡを０．３％（３ｍｇ／ｍＬ）量感作して調製したＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液を使用した。
結果を表１及び図１、並びに表２に示す。表１及び図１には、緩衝液Ａ又はＢを使用した場合の、実施例１（４）に記載の本発明試薬（重合温度＝３０℃）の結果を、従来試薬の結果と併せて示す。また、表２には、緩衝液Ａ（すなわち、ＢＳＡ不含）を用いた場合の、実施例１（４）に記載の本発明試薬（重合温度＝３０℃又は６０℃）の結果を、従来試薬の結果と併せて示す。
表１及び図１から明らかなように、緩衝液Ａ（すなわち、ＢＳＡ不含）を用いた場合、ＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液の場合（本発明試薬）には、抗ＢＳＡ抗体濃度が９００単位で吸光度変化量（ΔＡｂｓ）２４５１３に対して、ＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液の場合（従来試薬）には、９００単位で吸光度変化量（ΔＡｂｓ）３８５と、明らかにＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液が高感度であった。また、緩衝液Ｂ（すなわち、０．５％ＢＳＡ含有）を用いると、ＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液、ＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液ともに、抗ＢＳＡ抗体希釈列との反応性はみられなかった。
表２から明らかなように、ＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液（本発明試薬）において、重合反応を低温（３０℃）で実施して得られたＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液の場合には、抗ＢＳＡ抗体濃度が９００単位で吸光度変化量（ΔＡｂｓ）２４５１３に対して、高温（６０℃）で実施して得られたＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液は９００単位で吸光度変化量（ΔＡｂｓ）８４８０と、低温でのＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液のほうが高感度であった。また、ＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液の場合（従来試薬）には、９００単位で吸光度変化量（ΔＡｂｓ）３８５と、明らかにＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液が高感度であった。
《実施例３：抗ＢＳＡ抗体測定試薬によるヒト血清の測定》
本実施例では、標準抗ＢＳＡ抗体希釈列の代わりに、正常検体であるヒト血清５例（検体Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５）と非特異的検体であるヒト血清３例（検体Ｎｏ．６〜Ｎｏ．８）を用いること以外は、前記実施例２（２）の操作を繰り返した。なお、前記非特異的検体は、ラテックス粒子にＢＳＡを結合したＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液に対して非特異的に反応し、ＢＳＡを結合していないラテックス粒子懸濁液とは反応しない検体である。
本実施例では、標準抗ＢＳＡ抗体希釈列の代わりに、正常検体であるヒト血清５例（検体Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５）と非特異的検体であるヒト血清３例（検体Ｎｏ．６〜Ｎｏ．８）を用いること以外は、前記実施例２（２）の操作を繰り返した。なお、前記非特異的検体は、ラテックス粒子にＢＳＡを結合したＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液に対して非特異的に反応し、ＢＳＡを結合していないラテックス粒子懸濁液とは反応しない検体である。
結果を表３に示す。
表３から明らかなように、正常検体（血清ＮＯ．１〜Ｎｏ．５）、非特異的検体（血清Ｎｏ．６〜Ｎｏ．８）ともにＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液との反応はみられないが、ＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液においては、ＢＳＡを含まない緩衝液（緩衝液Ａ）においても、０．５％ＢＳＡを懸濁させた緩衝液（緩衝液Ｂ）においても、非特異検体との強い反応がみられた。
表３から明らかなように、正常検体（血清ＮＯ．１〜Ｎｏ．５）、非特異的検体（血清Ｎｏ．６〜Ｎｏ．８）ともにＢＳＡ導入ラテックス粒子懸濁液との反応はみられないが、ＢＳＡ結合ラテックス粒子懸濁液においては、ＢＳＡを含まない緩衝液（緩衝液Ａ）においても、０．５％ＢＳＡを懸濁させた緩衝液（緩衝液Ｂ）においても、非特異検体との強い反応がみられた。
《実施例４：抗ＩｇＧ測定試薬の調製》
（１）ＩｇＧ導入ラテックス粒子の調製
スチレン４０ｍｍｏｌ、ヘキサデカン４ｍｍｏｌ、ＩｇＧ ２００ｍｇ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３ＣＨ３（ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ；新中村化学工業株式会社）０．６ｍｍｏｌ，アスコルビン酸０．４ｍｍｏｌ、及び水２０ｇを混合し、ソニケーション（ＵＨ−３００：株式会社エスエムテー）を出力８０％、パルス５０％で氷浴下１５分間実施した。三口フラスコに入れ、１００ｒｐｍで攪拌しながら窒素バブリングを１５分間実施した後、Ｈ２Ｏ２ ０．４ｍｍｏｌを入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら３０℃で６時間重合してＩｇＧ導入ラテックス粒子を調製した。なお、ＩｇＧ導入ラテックス粒子の平均粒径は０．３１８μｍであった。
（１）ＩｇＧ導入ラテックス粒子の調製
スチレン４０ｍｍｏｌ、ヘキサデカン４ｍｍｏｌ、ＩｇＧ ２００ｍｇ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３ＣＨ３（ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ；新中村化学工業株式会社）０．６ｍｍｏｌ，アスコルビン酸０．４ｍｍｏｌ、及び水２０ｇを混合し、ソニケーション（ＵＨ−３００：株式会社エスエムテー）を出力８０％、パルス５０％で氷浴下１５分間実施した。三口フラスコに入れ、１００ｒｐｍで攪拌しながら窒素バブリングを１５分間実施した後、Ｈ２Ｏ２ ０．４ｍｍｏｌを入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら３０℃で６時間重合してＩｇＧ導入ラテックス粒子を調製した。なお、ＩｇＧ導入ラテックス粒子の平均粒径は０．３１８μｍであった。
（２）ＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液の調製
ＩｇＧ導入ラテックス粒子（１％濃度）１ｍＬに対して、免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂株式会社）１ｍＬを添加し、室温にて３０分間攪拌した。この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、ＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液を調製した。
ＩｇＧ導入ラテックス粒子（１％濃度）１ｍＬに対して、免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂株式会社）１ｍＬを添加し、室温にて３０分間攪拌した。この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、ＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（３）抗ＩｇＧ抗体測定試薬
実施例４（２）で調製したＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液（第２試薬）と、実施例１（３）で調製した緩衝液Ｂ（第１試薬）とから構成される２液系の試薬を、本発明の免疫学的分析試薬としての抗ＩｇＧ抗体測定試薬として、以下の実施例で評価した。
実施例４（２）で調製したＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液（第２試薬）と、実施例１（３）で調製した緩衝液Ｂ（第１試薬）とから構成される２液系の試薬を、本発明の免疫学的分析試薬としての抗ＩｇＧ抗体測定試薬として、以下の実施例で評価した。
《実施例５：抗ＩｇＧ抗体標準溶液の測定》
（１）抗ＩｇＧ抗体標準溶液の調製
抗ＩｇＧ抗体（Anti-IgG
H&L chains；MILES-YEDA社、２．８ｍｇ／ｍＬ）を生理食塩水で倍々希釈し、２．８、１．４、０．７、０．３５、０．１７５、０．０８８、及び０．０４４ｍｇ／ｍＬの、７濃度の標準抗ＩｇＧ抗体希釈列を調製した。
（１）抗ＩｇＧ抗体標準溶液の調製
抗ＩｇＧ抗体（Anti-IgG
H&L chains；MILES-YEDA社、２．８ｍｇ／ｍＬ）を生理食塩水で倍々希釈し、２．８、１．４、０．７、０．３５、０．１７５、０．０８８、及び０．０４４ｍｇ／ｍＬの、７濃度の標準抗ＩｇＧ抗体希釈列を調製した。
（２）抗ＩｇＧ抗体標準溶液の測定
標準抗ＩｇＧ抗体希釈列２μＬに、実施例１（３）で調製した緩衝液９０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例４（２）で調製したＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液９０μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長８００／５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の５７０ｎｍ吸光度変化量と８００ｎｍ吸光度変化量の差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。
なお、比較のために、平均粒径０．２８３μｍのポリスチレンラテックス粒子（セキスイ社製：固形分１０％）を用いて、前記粒子１％濃度１ｍＬにＩｇＧを１％（１０ｍｇ／ｍＬ）量感作して調製したＩｇＧ結合ラテックス粒子懸濁液と、ＩｇＧ未感作のラテックス粒子懸濁液とを使用した。
標準抗ＩｇＧ抗体希釈列２μＬに、実施例１（３）で調製した緩衝液９０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例４（２）で調製したＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液９０μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長８００／５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の５７０ｎｍ吸光度変化量と８００ｎｍ吸光度変化量の差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。
なお、比較のために、平均粒径０．２８３μｍのポリスチレンラテックス粒子（セキスイ社製：固形分１０％）を用いて、前記粒子１％濃度１ｍＬにＩｇＧを１％（１０ｍｇ／ｍＬ）量感作して調製したＩｇＧ結合ラテックス粒子懸濁液と、ＩｇＧ未感作のラテックス粒子懸濁液とを使用した。
実施例４（３）に記載の本発明試薬の結果を、従来試薬の結果と併せて、表４及び図２に示す。
表４及び図２から明らかなように、ＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液を用いた場合（本発明試薬）には、抗ＩｇＧ抗体濃度が１．４ｍｇ／ｍＬで吸光度変化量（ΔＡｂｓ）８１２に対して、ＩｇＧ結合ラテックス粒子懸濁液を用いた場合（従来試薬）には、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）２１９と、明らかにＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液が高感度であった。
表４及び図２から明らかなように、ＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液を用いた場合（本発明試薬）には、抗ＩｇＧ抗体濃度が１．４ｍｇ／ｍＬで吸光度変化量（ΔＡｂｓ）８１２に対して、ＩｇＧ結合ラテックス粒子懸濁液を用いた場合（従来試薬）には、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）２１９と、明らかにＩｇＧ導入ラテックス粒子懸濁液が高感度であった。
《実施例６：抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２測定試薬の調製》
（１）抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子の調製
スチレン１０ｍｍｏｌ、ヘキサデカン１ｍｍｏｌ、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２ ５０ｍｇ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３ＣＨ３（ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ；新中村化学工業株式会社）０．２ｍｍｏｌ、アスコルビン酸０．１ｍｍｏｌ、及び水５ｇを混合し、ソニケーション（ＵＨ−３００：株式会社エスエムテー）を出力５０％、パルス５０％で氷浴下１５分間実施した。三口フラスコに入れ、１００ｒｐｍで攪拌しながら窒素バブリングを１５分間実施した後、Ｈ２Ｏ２ ０．１ｍｍｏｌを入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら室温で６時間重合して抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子を調製した。なお、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子の平均粒径は０．２４９μｍであった。
（１）抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子の調製
スチレン１０ｍｍｏｌ、ヘキサデカン１ｍｍｏｌ、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２ ５０ｍｇ、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２３ＣＨ３（ＮＫエステルＭ−２３０Ｇ；新中村化学工業株式会社）０．２ｍｍｏｌ、アスコルビン酸０．１ｍｍｏｌ、及び水５ｇを混合し、ソニケーション（ＵＨ−３００：株式会社エスエムテー）を出力５０％、パルス５０％で氷浴下１５分間実施した。三口フラスコに入れ、１００ｒｐｍで攪拌しながら窒素バブリングを１５分間実施した後、Ｈ２Ｏ２ ０．１ｍｍｏｌを入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら室温で６時間重合して抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子を調製した。なお、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子の平均粒径は０．２４９μｍであった。
（２）抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子懸濁液の調製
抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子（１％濃度）１ｍＬに対して、免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂株式会社）１ｍＬを添加し、室温にて３０分間攪拌した。この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子懸濁液を調製した。
抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子（１％濃度）１ｍＬに対して、免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂株式会社）１ｍＬを添加し、室温にて３０分間攪拌した。この混合液を３５０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子懸濁液を調製した。
（３）ＣＲＰ測定試薬
実施例６（２）で調製した抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子懸濁液（第２試薬）と、実施例１（３）で調製した緩衝液Ｂ（第１試薬）とから構成される２液系の試薬を、本発明の免疫学的分析試薬としてのＣＲＰ測定試薬として、以下の実施例で評価した。
実施例６（２）で調製した抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子懸濁液（第２試薬）と、実施例１（３）で調製した緩衝液Ｂ（第１試薬）とから構成される２液系の試薬を、本発明の免疫学的分析試薬としてのＣＲＰ測定試薬として、以下の実施例で評価した。
《実施例７：ＣＲＰ標準溶液の測定》
（１）ＣＲＰ標準溶液の調製
ＣＲＰ（オリエンタル酵母株式会社製リコンビナントＣＲＰ溶液１００ｍｇ／ｄＬ）を生理食塩水で希釈し、３．２、１．６、０．８、０．４、０．２、及び０．１ｍｇ／ｄＬの、６濃度の標準ＣＲＰ希釈列を調製した。
（１）ＣＲＰ標準溶液の調製
ＣＲＰ（オリエンタル酵母株式会社製リコンビナントＣＲＰ溶液１００ｍｇ／ｄＬ）を生理食塩水で希釈し、３．２、１．６、０．８、０．４、０．２、及び０．１ｍｇ／ｄＬの、６濃度の標準ＣＲＰ希釈列を調製した。
（２）ＣＲＰ標準溶液の測定
標準ＣＲＰ希釈列２μＬに、実施例１（３）で調製した緩衝液９０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例６（２）で調製した抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子懸濁液９０μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長８００／５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の５７０ｎｍ吸光度変化量と８００ｎｍ吸光度変化量の差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。
標準ＣＲＰ希釈列２μＬに、実施例１（３）で調製した緩衝液９０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、実施例６（２）で調製した抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２導入ラテックス粒子懸濁液９０μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長８００／５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の５７０ｎｍ吸光度変化量と８００ｎｍ吸光度変化量の差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。
実施例６（３）に記載の本発明試薬の結果を、表５に示す。
表５から明らかなように、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２ラテックス粒子懸濁液を用いた場合（本発明試薬）、０．１〜３．２ｍｇ／ｄＬの範囲においてＣＲＰ標準液と濃度依存的な反応性が得られた。
表５から明らかなように、抗ＣＲＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２ラテックス粒子懸濁液を用いた場合（本発明試薬）、０．１〜３．２ｍｇ／ｄＬの範囲においてＣＲＰ標準液と濃度依存的な反応性が得られた。
本発明は、免疫学的分析（特にラテックス凝集法）の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (8)
- モノマー、ラジカル重合開始剤、乳化剤、及びハイドロフォーブを用いてミニエマルション重合を行う際に、抗原又は抗体を共存させて高分子微粒子を製造することを特徴とする、表面に前記抗原又は抗体が導入された高分子微粒子の製造方法であって、前記ラジカル重合開始剤がレドックス開始剤であり、高分子微粒子の平均粒径が０．０５〜０．５μｍである、前記製造方法。
- 前記ミニエマルション重合が、重合反応を低温で行う低温エマルション重合である、請求項１に記載の製造方法。
- 重合反応を０〜４０℃で行う、請求項２に記載の製造方法。
- 前記レドックス開始剤が、アスコルビン酸とＨ２Ｏ２との組合せである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記乳化剤が界面活性剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記乳化剤が、ポリエチレングリコール鎖を有する重合性界面活性剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ハイドロフォーブがヘキサデカン又はポリスチレンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
- 請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法により得られる、平均粒径が０．０５〜０．５μｍであり、高分子微粒子の表面に抗原又は抗体が導入された高分子微粒子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008539826A JP5288348B2 (ja) | 2006-10-16 | 2007-10-16 | 高分子微粒子の製造方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006281840 | 2006-10-16 | ||
| JP2006281840 | 2006-10-16 | ||
| JP2008539826A JP5288348B2 (ja) | 2006-10-16 | 2007-10-16 | 高分子微粒子の製造方法 |
| PCT/JP2007/070189 WO2008047798A1 (fr) | 2006-10-16 | 2007-10-16 | Procédé de production de microparticules polymères |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2008047798A1 JPWO2008047798A1 (ja) | 2010-02-25 |
| JP5288348B2 true JP5288348B2 (ja) | 2013-09-11 |
Family
ID=39314025
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008539826A Expired - Fee Related JP5288348B2 (ja) | 2006-10-16 | 2007-10-16 | 高分子微粒子の製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8227263B2 (ja) |
| EP (1) | EP2088428B1 (ja) |
| JP (1) | JP5288348B2 (ja) |
| CN (1) | CN101542286B (ja) |
| ES (1) | ES2468243T3 (ja) |
| WO (1) | WO2008047798A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102914654A (zh) * | 2011-08-04 | 2013-02-06 | 董方 | 一种用于检测多种蛋白质的生物芯片的封闭液及其封闭方法 |
| JP6223693B2 (ja) * | 2012-03-06 | 2017-11-01 | ジャパンコーティングレジン株式会社 | 合成樹脂エマルジョン、及びそれを用いてなるコーティング剤、ならびにコーティング層 |
| US10557848B2 (en) | 2014-09-02 | 2020-02-11 | Lsi Medience Corporation | Polymer microparticle for carrying physiologically active substance and method for preparing same |
| CN111812336A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-10-23 | 苏州康和顺医疗技术有限公司 | 用于检测冠状病毒抗体的检测试剂盒及其制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6013145B2 (ja) * | 1974-10-16 | 1985-04-05 | イングヴアー・ギヨスタ・ホルゲル・シヨーホルム | 不動化された生物学的活性巨大分子物質 |
| JPH05247108A (ja) * | 1992-03-04 | 1993-09-24 | Konica Corp | 着色重合体粒子及びその製造法 |
| JPH0810224B2 (ja) * | 1987-04-30 | 1996-01-31 | 日東電工株式会社 | 生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬 |
| JP2006145256A (ja) * | 2004-11-16 | 2006-06-08 | Sekisui Chem Co Ltd | 磁性体内包粒子、免疫測定用粒子及びイムノクロマトグラフィ法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4609707A (en) * | 1983-11-10 | 1986-09-02 | Genetic Systems Corporation | Synthesis of polymers containing integral antibodies |
| US4843010A (en) * | 1983-11-10 | 1989-06-27 | Genetic Systems Corporation | Polymerization-induced separation immunoassays |
| US4711840A (en) * | 1984-01-27 | 1987-12-08 | Genetic Systems Corporation | Polymerization-induced separation immunoassays |
| US4752638A (en) * | 1983-11-10 | 1988-06-21 | Genetic Systems Corporation | Synthesis and use of polymers containing integral binding-pair members |
| US4511478A (en) * | 1983-11-10 | 1985-04-16 | Genetic Systems Corporation | Polymerizable compounds and methods for preparing synthetic polymers that integrally contain polypeptides |
| US5166077A (en) * | 1987-04-30 | 1992-11-24 | Nitto Denko Corporation | Latex for immobilization of physiologically active substances for immuno nephelometry |
| JPH0859715A (ja) | 1994-08-26 | 1996-03-05 | Konica Corp | 顔料含有重合体粒子およびその製造方法 |
| DE10031859B4 (de) | 2000-06-30 | 2007-08-09 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Verbesserte Mikrogele und Filme |
| JP4058623B2 (ja) | 2002-10-28 | 2008-03-12 | Ｊｓｒ株式会社 | ウイルス検出方法 |
| JP4245415B2 (ja) | 2002-11-25 | 2009-03-25 | 健二 山本 | 分子認識蛍光体の製造方法 |
| JP2007155691A (ja) | 2005-12-08 | 2007-06-21 | Summit Pharmaceuticals International Corp | 物質の測定方法ならびに測定用組成物 |
-
2007
- 2007-10-16 US US12/445,881 patent/US8227263B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-16 EP EP07829923.7A patent/EP2088428B1/en not_active Not-in-force
- 2007-10-16 JP JP2008539826A patent/JP5288348B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-16 WO PCT/JP2007/070189 patent/WO2008047798A1/ja active Application Filing
- 2007-10-16 CN CN200780038664.5A patent/CN101542286B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-16 ES ES07829923.7T patent/ES2468243T3/es active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6013145B2 (ja) * | 1974-10-16 | 1985-04-05 | イングヴアー・ギヨスタ・ホルゲル・シヨーホルム | 不動化された生物学的活性巨大分子物質 |
| JPH0810224B2 (ja) * | 1987-04-30 | 1996-01-31 | 日東電工株式会社 | 生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬 |
| JPH05247108A (ja) * | 1992-03-04 | 1993-09-24 | Konica Corp | 着色重合体粒子及びその製造法 |
| JP2006145256A (ja) * | 2004-11-16 | 2006-06-08 | Sekisui Chem Co Ltd | 磁性体内包粒子、免疫測定用粒子及びイムノクロマトグラフィ法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6012063823; Ｐｒｏｇ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．２７， Ｎｏ．４， ２００２， Ｐａｇｅ．６８９-７５７ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPWO2008047798A1 (ja) | 2010-02-25 |
| WO2008047798A1 (fr) | 2008-04-24 |
| EP2088428A1 (en) | 2009-08-12 |
| EP2088428B1 (en) | 2014-04-23 |
| CN101542286A (zh) | 2009-09-23 |
| US8227263B2 (en) | 2012-07-24 |
| EP2088428A4 (en) | 2010-10-06 |
| US20100304503A1 (en) | 2010-12-02 |
| CN101542286B (zh) | 2014-08-20 |
| ES2468243T3 (es) | 2014-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3443891B2 (ja) | タンパク質吸着防止剤 | |
| KR102013464B1 (ko) | 측정 시약용 라텍스 입자, 감작 라텍스 입자 및 면역 비탁법용 측정 시약 | |
| JP4853666B2 (ja) | 標的物質の検出方法、混合粒子、および標的物質の検出試薬 | |
| JP5288348B2 (ja) | 高分子微粒子の製造方法 | |
| JP5288349B2 (ja) | 免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法 | |
| CN114555650A (zh) | 颗粒以及制造颗粒的方法 | |
| JP6998004B2 (ja) | 生理活性物質担持用磁性粒子及びその製造方法 | |
| US6548310B1 (en) | Particle for diagnostic agent and turbidmetric immunoassay using the same | |
| JP6442291B2 (ja) | 粒子分散液、標的物質の検出に用いるためのキット、及び標的物質の検出方法 | |
| JP6671688B2 (ja) | 生理活性物質担持用高分子微粒子及びその製造方法 | |
| JP4151771B2 (ja) | 免疫学的凝集反応試薬 | |
| JP2004191332A (ja) | 免疫学的分析試薬及び免疫学的分析方法 | |
| JP2008215816A (ja) | 免疫診断用中空ポリマー粒子およびその製造方法、ならびに免疫診断用試薬 | |
| WO2023190275A1 (ja) | ラテックス粒子分散液 | |
| JPH09304384A (ja) | 免疫測定法 | |
| JP2004117068A (ja) | 免疫測定試薬および免疫測定方法 | |
| JPS6366464A (ja) | 診断試薬用担体ラテツクス | |
| JP2000088853A (ja) | 診断薬用粒子 | |
| JP2004325416A (ja) | 測定試薬用担体粒子ラテックス及び測定試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100913 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121211 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130204 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130507 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130527 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5288348 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |