ES2468243T3 - Procedimiento de producción de partículas de pol�mero - Google Patents

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Akihiro Mizuno
Tokio Sawai
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Abstract

Un procedimiento de producción de partículas de polímero que tienen un antígeno o un anticuerpo introducido en la superficie de las mismas, caracterizado porque comprende la etapa de llevar a cabo la polimerización en miniemulsión usando un monómero, un iniciador de polimerización por radicales, un emulsionante y un hidrófobo en presencia del antígeno o anticuerpo, por medio de lo cual producir las partículas de polímero, en las que el iniciador de polimerización por radicales es un iniciador redox.

Description

Procedimiento de producción de partículas de pol�mero
Campo técnico
La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de partículas de pol�mero que presentan un ant�geno
o un anticuerpo introducido en la superficie de las mismas, mediante la coexistencia del ant�geno o anticuerpo en la polimerizaci�n en miniemulsi�n.
T�cnica anterior
En el campo de ensayos de diagnóstico cl�nicos, diversas sustancias, que se pueden usar como un índice de diagnóstico de enfermedades, debería medirse rápidamente y de forma precisa en un gran número de muestras, y se debería darse una realimentación rápida y precisa de los resultados a una sala de tratamiento. En particular, la medida inmunol�gica basada en una reacción ant�geno-anticuerpo se usa ampliamente para cuantificar de forma exacta una cantidad traza de una sustancia que se va a analizar. A este respecto, como un procedimiento para la mejora de la sensibilidad a detección
o precisión, se lleva a cabo un procedimiento de aglutinación en l�tex que usa partículas hechas de un pol�mero sintético tal como poliestireno (el denominado l�tex), en el que se conoce un ant�geno o anticuerpo específico para una sustancia que se va a analizar sobre la superficie de las partículas. El procedimiento de aglutinación del l�tex es un procedimiento para la medida rápida de una sustancia que se va a analizar, mediante detección visual u óptica de un grado de aglutinación de l�tex-partícula provocado por una reacción de la sustancia que se va a analizar con el ant�geno o anticuerpo inmovilizado en las partículas de l�tex.
Adicionalmente, también es ampliamente usado un procedimiento s�ndwich, que usa partículas magnéticas en lugar de partículas de l�tex, atrapando una sustancia que se va a analizar con un primer anticuerpo inmovilizado sobre las partículas magnéticas, lavando las partículas magnéticas acumuladas con un imán para eliminar sustancias no reaccionadas y similares (la denominada separación B/F), y añadiendo un segundo anticuerpo etiquetado con una sustancia que genera señal tal como un enzima o un agente fluorescente para llevar a cabo de este modo el análisis.
Casi todas las sustancias a analizar, que son cuantificadas usando una reacción ant�geno-anticuerpo, son por lo general componentes traza contenidas en muestras biológicas y, por tanto, es importante la precisión en un intervalo a baja concentración. Sin embargo, debido a que hay un caso donde se observa un nivel anormalmente alto de una sustancia que se va a medir de acuerdo con el progreso de una enfermedad, se desea un reactivo capaz de medir de forma precisa desde un intervalo a baja concentración hasta un intervalo a alta concentración en el campo de ensayos de diagnóstico cl�nicos.
En procedimientos que usan partículas de l�tex que incluyen el procedimiento de aglutinación en l�tex y el procedimiento s�ndwich, es esencial inmovilizar un ant�geno o anticuerpo sobre la superficie de las partículas de l�tex, y se usa un procedimiento de inmovilización física o química del ant�geno o anticuerpo sobre la superficie. Por ejemplo, se usa un procedimiento de inmovilización directamente del ant�geno o anticuerpo sobre las partículas de l�tex mediante adsorción física, o un procedimiento de unión del ant�geno o anticuerpo a las partículas de l�tex mediante una unión covalente con un grupo funcional localizado sobre la superficie de las partículas de l�tex, por ejemplo, un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo mercapto, un grupo hidroxilo, un grupo aldeh�do, un grupo epoxi, o similares.
Sin embargo una cantidad del ant�geno o anticuerpo capaz de ser portado en la superficie del l�tex se ve limitada en estos procedimientos de unión física o química, y por tanto, hay un límite para un intervalo de medida o una sensibilidad de detección cuando el procedimiento de aglutinación del l�tex o el procedimiento del s�ndwich se lleva a cabo. Esto es, las propiedades (por ejemplo, una carga de superficie, una tasa de grupo funcional introducido, una distribución del tamaño de partícula, o similares) de las partículas de l�tex de por s� no son uniformes entre diferentes lotes o fabricantes, y por tanto, aunque si un procedimiento de unión de ant�geno o anticuerpo a partículas de l�tex fuese uniforme, las propiedades de las partículas de l�tex unido a anticuerpo no son uniformes. Por ejemplo, en los procedimientos de unión física o química de un ant�geno o anticuerpo a la superficie del l�tex, no toda la cantidad del ant�geno o anticuerpo se une al l�tex, y el ant�geno o anticuerpo no unido se elimina mediante lavado tras el procedimiento de unión, o el ant�geno o anticuerpo unido se pelan frecuentemente del l�tex mediante centrifugaci�n o dispersi�n. Es decir, un cambio en la cantidad de una unión de ant�geno o anticuerpo afecta a un intervalo de medida o a una sensibilidad de detección.
Adem�s, como un nuevo problema surgido recientemente, se han observado a veces muestras que provocan una reacción no específica, como se muestra en la referencia no de patente 1. Cuando un ant�geno o anticuerpo se une a la superficie de partículas de l�tex, el ant�geno o anticuerpo se desnaturaliza estructuralmente, y es provocada la reacción no específica por “una sustancia que se une a la parte desnaturalizada” contenida en las muestras. Debido a la reacción no específica, la fiabilidad de los valores medidos se pierde, y no se puede hacer un diagnóstico exacto. Este problema no se solventaría con exámenes individuales como para un ant�geno o anticuerpo, o partículas de l�tex, y es muy difícil de resolver.
Referencia no de patente 1: Rinsho Byori (The Japanese Journal of Clinical Pathology), Agosto de 2000, vol. 48 n� 8, páginas 760-763.
El documento WO-A-02/02647 describe un procedimiento para la producción de partículas de tamaño nanom�trico que presentan sitios de reconocimiento específicos de la molécula, el procedimiento comprende la formación de una emulsión que comprende dos fases no miscibles entre s�, en las que la emulsión contiene a) al menos un mon�mero, b) al menos un agente que da especificidad de molécula, c) de forma opcional al menos un iniciador, d) opcionalmente al menos un agente reticulante, y e) al menos un emulsionante; y subsiguientemente llevar a cabo una polimerizaci�n en emulsión. La polimerizaci�n en emulsión se inicia térmicamente o fotoqu�micamente.
Divulgaci�n de la invención
Problemas a resolver por la invención
Los presentes inventores has llevado a cabo estudios intensivos de un procedimiento de unión de un ant�geno o anticuerpo a la superficie del l�tex, en lugar de los procedimientos de unión física o química convencionales anteriores, y encontraron que cuando un ant�geno o anticuerpo coexisten como una proteína, se pueden obtener partículas de l�tex en las que el ant�geno o anticuerpo es introducido en la superficie de las partículas de l�tex una vez que la síntesis se complete. Los presentes inventores han encontrado, además de forma sorprendente, que las partículas de l�tex muestran una mayor reactividad a una sustancia que se analiza en comparación con reactivos convencionales en base a la adsorción física o similares, mientras que las propiedades del ant�geno o anticuerpo introducido se mantienen, y que el ant�geno o anticuerpo introducido en la superficie de las partículas de l�tex no se desnaturaliza estructuralmente con la unión, y por tanto, pueden evitarse reacciones no específicas con muestras que reaccionan no específicamente con reactivos convencionales. Los presentes inventores encontraron que un mon�mero puede polimerizarse en condiciones específicas, en un estado que el ant�geno o anticuerpo coexiste en la reacción sintética de partículas de l�tex y se complementa en la presente invención.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento nuevo de producción e partículas de pol�mero que puedan proporcionar un reactivo para análisis inmunol�gico, que presente una sensibilidad a la detección excelente y sea capaz de evitar la reacción no específica que tiene lugar en procedimientos convencionales.
Medios para resolver los problemas
El problema se puede resolver con la presente invención, un procedimiento para la producción de partículas de pol�mero que presenta un ant�geno o un anticuerpo introducido en la superficie del mismo, caracterizado porque comprende la etapa de llevar a cabo la polimerizaci�n en miniemulsi�n usando un mon�mero, un iniciador de polimerizaci�n por radicales, un emulsionantes, y un hidrófobo en presencia del ant�geno o anticuerpo con el que se producen las partículas de pol�mero, en el que el iniciador de la polimerizaci�n por radicales es un iniciador redox.
La presente invención proporciona una partícula de pol�mero que presenta una proteína introducida en la superficie de la misma, que se puede obtener con el procedimiento.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la reacción de polimerizaci�n se lleva a cabo a baja temperatura (más preferiblemente de 0 a 40� C) en la polimerizaci�n en miniemulsi�n.
De acuerdo con la presente invención, el iniciador de polimerizaci�n por radicales es un iniciador redox, preferiblemente una combinación de ácido asc�rbico y H2O2.
De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, el emulsionante es un tensioactivo, más preferiblemente un tensioactivo polim�rico que presenta una cadena de polietilenglicol.
De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, el hidrófobo es hexadecano o poliestireno.
Adem�s se describe en la presente memoria:
[1] un reactivo para análisis inmunol�gico, que comprende una suspensión de partículas de l�tex que presenta un ant�geno o un anticuerpo específico para una sustancia que se va a analizar introducida en la superficie de las partículas de l�tex, producido por polimerizaci�n de un mon�mero en presencia del ant�geno o anticuerpo con el que se va a sintetizar las partículas de l�tex,
[2] un procedimiento para el análisis inmunol�gico, que comprende la etapa de poner en contacto, en un líquido, (1) una muestra que se sospecha contiene una sustancia que se va a analizar, con (2) partículas de l�tex que presentan un ant�geno o un anticuerpo específico para la sustancia introducida en la superficie de las partículas de l�tex, producida por polimerizaci�n de un mon�mero en presencia de un ant�geno o anticuerpo con el que se sintetiza las partículas de l�tex,
[3] el procedimiento de [2], que comprende además la etapa de analizar �pticamente un grado de aglutinación de l�texpart�cula provocado por una reacción de ant�geno-anticuerpo, tras la etapa de poner en contacto, y
[4] el procedimiento de [2], que comprende además, tras la etapa de poner en contacto, la etapa de separar las partículas de l�tex del líquido, y analizar �pticamente la sustancia que se va a analizar unida a las partículas de l�tex, o la sustancia que se va a analizar que queda en el líquido.
Efectos de la invención
De acuerdo con la presente invención, se pueden proporcionar nuevas partículas de pol�mero, que pueden proporcionar un reactivo para análisis inmunol�gico, que presentan una excelente sensibilidad a detección y son capaces de evitar la reacción no específica que tiene lugar en procedimientos convencionales.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos por medida de serie diluidas dos veces de una solución patrón de un anticuerpo anti-BSA, usando un reactivo preparado con la presente invención que contiene partículas de l�tex con BSA introducido, o un reactivo convencional que contiene partículas de l�tex unidas a BSA.
La figura 2 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos por medida de dos diluciones en serie de una solución patrón de un anticuerpo anti-IgG, usando un reactivo preparado con la presente invención que contiene partículas de l�tex con BSA introducido, o un reactivo convencional que contiene partículas de l�tex unidas a BSA.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
El procedimiento de la presente invención se caracteriza por la coexistencia de un ant�geno o un anticuerpo en el procedimiento de polimerizaci�n en miniemulsi�n. De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, se pueden producir partículas de pol�mero (de forma particular, partículas de l�tex) que presentan el ant�geno o el anticuerpo introducido en la superficie del mismo (en adelante denominadas como las partículas de pol�mero introducidas asociadas).
El procedimiento de la presente invención se puede llevar a cabo de una forma similar a la polimerizaci�n en miniemulsi�n convencional (por ejemplo, M. Antonietti, K. Landfester, Prog. Polym. Sci., 2002, 27, 689-757, and J. M. Asua, Prog. Polym. Sci., 2002, 27, 1283-1346), excepto en que coexisten un ant�geno o anticuerpo en la reacción de polimerizaci�n.
La polimerizaci�n en miniemulsi�n convencional puede comprender, pero sin limitarse a estas, las etapas de, por ejemplo, mezclar un mon�mero, un iniciador de polimerizaci�n por radicales, un emulsionante, y un hidrófobo para preparar una mezcla, someter a cizallamiento la mezcla, y calentar la mezcla cizallada hasta una temperatura de inicio de la polimerizaci�n con la que se lleve a cabo la polimerizaci�n. En la polimerizaci�n en miniemulsi�n, después de que un mon�mero para polimerizaci�n se mezcle con un emulsionante, se lleva a cabo una etapa de cizallamiento mediante, por ejemplo, radiación supersónica, para alterar el mon�mero mediante una fuerza de cizallamiento y formar gotas de mon�mero recubiertas con el emulsionante. Las gotas de mon�mero se polimerizan calentando la mezcla hasta la temperatura de inicio de polimerizaci�n del iniciador de polimerizaci�n por radicales para obtener las partículas de pol�mero.
El ant�geno o anticuerpo usado en la presente invención no est� particularmente limitado, en tanto muestre una actividad de superficie, y es preferible un ant�geno o anticuerpo que se pueda usar en un procedimiento de l�tex (por ejemplo, un procedimiento de aglutinamiento de l�tex o una separación B/F que use l�tex). Que un cierto ant�geno o anticuerpo muestre o no una actividad de superficie se puede confirmar con un procedimiento conocido, tal como una medida de la tensión de superficie, o una medida de un espectro fluorescente que usa pireno como una sonda fluorescente. Un ant�geno o anticuerpo preferido usado en la presente invención muestra una relación de intensidad (I1/I3) del primer pico de emisión (I1) al tercer pico de emisión (I3) de 0,5 a 1,6 (más preferiblemente de 0,6 a 1,5) en la medida con espectro fluorescente que usa pireno como una sonda fluorescente. Ejemplos del ant�geno o anticuerpo incluyen diversos anticuerpos, receptores, enzimas, lípidos y cadenas de azúcar, más particularmente, IgG, proteína reactiva frente a C (CRP), ferritina, microglobulina β-2, α-fetoprote�na (AFP), IgE, virus de la hepatitis B (anticuerpo HBs o anticuerpo HBc), d�mero D, producto de degradación de la fibrina/fibrin�geno (FDP), fibrina soluble (SF), complejo inhibidor de plasminaα2-plasmina (PPI), ant�geno específico de la pr�stata (PSA), elastasa 1, elastasa XDP, trombomodulina y albúmina (preferiblemente albúmina de suero).
Como el anticuerpo se puede usar un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. El anticuerpo se puede usar como una molécula de inmunoglobulina tal cual, o un fragmento del mismo, tal como Fab, Fab’, F(ab’)2 o Fv.
Se puede usar en la presente invención un mon�mero que se puede usar en polimerizaci�n en miniemulsi�n convencional. Ejemplos del mon�mero incluyen estireno, derivados de estireno (por ejemplo, clorometilestireno o estirenosulfonato de sodio), ácido acr�lico o ácido metacr�lico, ésteres de ácido acr�lico o ésteres de ácido metacr�lico [por ejemplo, (met)acrilato de metilo, (met)acrilato de etilo, (met)acrilato de butilo, (met)acrilato de hexadecilo] y acetato de vinilo.
Un iniciador de polimerizaci�n por radicales que se pueda usar en una polimerizaci�n en miniemulsi�n convencional puede ser, por ejemplo, un iniciador de peróxido, un iniciador de persulfato, un iniciador azo, o un iniciador redox. En la presente invención el iniciador de polimerizaci�n por radicales es un iniciador redox. El iniciador redox es preferible en la presente invención debido a que la reacción de polimerizaci�n puede ser a baja temperatura. Cuando el ant�geno o anticuerpo que coexiste en la reacción de polimerizaci�n presenta actividades fisiológicas, se puede suprimir una reducción en las actividades fisiológicas llevando a cabo la reacción de polimerizaci�n a baja temperatura.
Ejemplos del iniciador de peróxido incluyen peróxido de benzo�lo (BPO), peróxido de di-t-butilo (DBPO) y peróxido de amonio. Ejemplos del iniciador de persulfato incluyen persulfato de potasio (KPS), persulfato de amonio (APS) y persulfato de sodio (NPS). Ejemplos del iniciador azo incluyen azobisisobutironitrilo (AIBN), 2,2’-azobiisobutirato de dimetilo (MAIB), ácido 4,4’-azobis(4-cianoval�rico) y 2,2’-azobis(2,4-dimeilvaleronitrilo).
Ejemplos del iniciador redox incluyen N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TMEDA)/persulfato de potasio (KPS), FeSO4/KPS, FeSO4/H2O2 y ácido asc�rbico (vitamina C)/H2O2. La combinación de ácido asc�rbico/H2O2 es preferible, debido que se puede lograr una alta tasa de conversión (por ejemplo, de 75 a 98%).
Diversos tensioactivos que se pueden usar en la polimerizaci�n en miniemulsi�n convencional se pueden usar como el emulsionante en la presente invención y pueden incluir compuestos ani�nicos, compuestos cati�nicos, y compuestos no iónicos. Ejemplos de los compuestos no iónicos incluyen un tensioactivo polim�rico que presenta una cadena de polietilenglicol (PEG), un alcohol de cadena larga, poli(alcohol vin�lico) y Brij 35 (PIERCE).
El tensioactivo polim�rico que presenta una cadena de polietilenglicol (PEG) puede ser, por ejemplo, CH2=C(CH3)COO(CH2CH2O)nCH3 (n es un número entero de 2 o más, preferiblemente de 2 a 100, más preferiblemente de 5 a 80, aún más preferiblemente de 8 a 50, lo más preferiblemente de 9 a 23), de forma más particular, por ejemplo, CH2=C(CH3)COO(CH2CH2O)23CH3 [n=23; (nombre del producto) éster NK M-230G; Shinnakamura Chemical Co. Ltd.], o CH2=C(CH3)COO(CH2CH2O)9CH3 [n=9; (nombre del producto) éster NK M-90G; Shin-nakamura Chemical Co. Ltd.]. La estabilidad de la dispersi�n debida a la repulsión est�rica puede obtenerse usando el tensioactivo polim�rico anterior como el emulsionante.
Ejemplos del alcohol de cadena larga incluyen 1-pentanol y decanol.
Se puede usar un hidrófobo en la polimerizaci�n en miniemulsi�n convencional en la presente invención, y puede ser, por ejemplo, hexadecano, silsesquioxano, o un pol�mero hidrófobo (por ejemplo, metacrilato de poliestireno o polimetilo). Es preferible hexadecano o poliestireno. Cuando se usa el hidrófobo se puede suprimir un aumento en la heterogeneidad del tamaño de partícula debido a la maduración de Oswald, y por lo tanto se puede sintetizar partículas de l�tex monodispersadas.
Las condiciones de reacción en la polimerizaci�n, tales como disolvente, relación de mezcla, temperatura, o tiempo de reacción, se pueden seleccionar de forma apropiada, por ejemplo, llevando a cabo un experimento piloto, de acuerdo con el tipo de un mon�mero y un ant�geno o anticuerpo usado, el tamaño de partícula medio de las partículas de pol�mero que se sintetizan, la cantidad del ant�geno o anticuerpo portado en la superficie de las partículas, o similares.
Por ejemplo, respecto a 40 mmol de un mon�mero para polimerizaci�n (por ejemplo, un mon�mero de estireno), se puede usar respectivamente un ant�geno o anticuerpo [por ejemplo, albúmina de suero bovino, IgG, o F(ab’)2] en una cantidad por lo general de 0,01 a 5 g, preferiblemente de 0,02 a 2 g, más preferiblemente de 0,08 a 0,8 g; un iniciador de polimerizaci�n por radicales (por ejemplo, ácido asc�rbico o H2O2) en una cantidad por lo general de 0,01 a 4 mmol, preferiblemente de 0,02 a 2 mmol; y un emulsionante (por ejemplo, éster NK M-230G o éster NK M-90G) en una cantidad por lo general de 0,1 a 10 mmol, preferiblemente de 0,2 a 5 mmol, más preferiblemente de 0,4 a 4 mmol. El tiempo de reacción es por lo general de 1 hora o más, preferiblemente de 3 a 48 horas, más preferiblemente de 4 a 24 horas. La temperatura de reacción es por lo general de 0 a 80� C, preferiblemente de 0 a 60� C, más preferiblemente de 0 a 40� C.
De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, se pueden producir partículas de l�tex que presentan un ant�geno o anticuerpo introducido en la superficie de las partículas de l�tex.
En partículas de l�tex convencionales, por ejemplo, un ant�geno o anticuerpo se inmoviliza directamente sobre las partículas de l�tex mediante adsorción química, o un ant�geno o anticuerpo se une a las partículas de l�tex mediante una unión covalente por un grupo funcional localizado sobre la superficie de las partículas de l�tex, por ejemplo, un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo mercapto, un grupo hidroxilo, un grupo aldeh�do, un grupo epoxi, o similares. En las partículas de l�tex con ant�geno o anticuerpo introducido que se pueden obtener mediante el procedimiento de la presente invención, se porta el ant�geno o anticuerpo sobre la superficie del l�tex embebiendo parte del ant�geno o anticuerpo en las partículas de l�tex.
Cuando se producen partículas de l�tex por polimerizaci�n en miniemulsi�n llevada a cabo a temperatura baja, como un procedimiento de introducción de un ant�geno o anticuerpo coexistente en partículas de l�tex en la síntesis de las partículas de l�tex, el ant�geno o anticuerpo se introduce en la superficie de las partículas de l�tex cuando la síntesis se completa, y como consecuencia, se puede evitar la eliminación del ant�geno o anticuerpo no unido de las partículas de l�tex por lavado o el pelado del ant�geno o anticuerpo unido desde las partículas de l�tex por centrifugaci�n o dispersi�n, lo que tiene lugar en partículas de l�tex producidas por procedimientos convencionales. Adicionalmente se puede obtener una alta reactividad usando tales partículas de l�tex. Además, debido a que el ant�geno o anticuerpo es introducido en la superficie de las partículas de l�tex cuando se completa la síntesis no tiene lugar la desnaturalización debida a obstáculos est�ricos por la unión, y por tanto, se puede evitar una reacción con una muestra en la que se observa una reacción no específica cuando se usan partículas de l�tex convencionales.
En el procedimiento de la presente invención, no se clarifica un mecanismo de la introducción del ant�geno o anticuerpo coexistente en la superficie de las partículas de pol�mero (por ejemplo, l�tex) en la polimerizaci�n en miniemulsi�n, pero
los presentes inventores suponen el siguiente mecanismo. Esto es, el ant�geno o anticuerpo usado en la presente invención muestra una actividad de superficie, y por tanto, se considera que el ant�geno o anticuerpo existe en la superficie de las partículas de pol�mero (por ejemplo, l�tex), como una interfaz con agua, debido a la parte hidrófila. A este respecto la presente invención no se ve limitada por la suposición.
La presente invención proporciona partículas de pol�mero útiles como un agente nuevo para análisis inmunol�gico y en un procedimiento nuevo para análisis inmunol�gico. En el agente y procedimiento para análisis inmunol�gico se usan partículas de l�tex que presentan un ant�geno o anticuerpo (es decir, un asociado inmunol�gico) introducido en la superficie de las partículas de l�tex (partículas de l�tex a las que se introduce un asociado), en lugar de partículas de l�tex convencionales que portan un ant�geno o anticuerpo sobre la superficie de las mismas con una unión física o química. Las partículas de l�tex en las que se introduce un asociado no se encuentran particularmente limitadas, en tanto el ant�geno o anticuerpo sea portado en la superficie de las partículas de l�tex mediante embebido de parte del ant�geno
o anticuerpo en las partículas de l�tex. Las partículas de l�tex en las que se introduce un asociado se pueden producir con el procedimiento de la presente invención.
Se pueden usar partículas de pol�mero preparadas con la presente invención en un procedimiento de l�tex (un procedimiento de aglutinación de l�tex o una separación B/F que usa l�tex) para llevar a cabo el análisis. En un sistema en el que las partículas de l�tex en las que se introduce un ant�geno o anticuerpo específico de una sustancia que se va a analizar se pusieron en contacto con la sustancia que se va a analizar (es decir, un sistema en el que se lleva a cabo una reacción ant�geno-anticuerpo en el l�tex), no tiene lugar la desnaturalización debida al obstáculo est�rico en el ant�geno o anticuerpo introducido, y por tanto, las partículas de l�tex no reaccionan con una muestra no específica para la parte desnaturalizada, y como consecuencia, la sustancia que se va analizar se puede analizar (detectar o medir, preferiblemente medir) a una mayor sensibilidad, en comparación con procedimientos convencionales.
No se ve particularmente limitada una sustancia que se pueda analizar (una sustancia que se va a analizar), en tanto se pueda analizar como un ant�geno o un anticuerpo usando por lo general una reacción ant�geno-anticuerpo, y son preferibles sustancias fisiológicamente activas. Ejemplos de la sustancia que se va a analizar incluyen proteínas, lípidos y cadenas de azúcar, más particularmente, IgG, proteína reactiva C (CRP), ferritina, microglobulina β-2, α-fetoprote�na (AFP), IgE, virus de la hepatitis B (anticuerpo HVs o anticuerpo HBc), d�mero D, producto de degradación de fibrina/fibrin�geno (FDP), fibrina soluble (SF), complejo inhibidor de pl�smido-α2-pl�smido (PPI), ant�geno específico de la pr�stata (PSA), elastasa 1, elastasa XDP, trombomodulina y albúmina (preferiblemente albúmina de suero).
Una muestra que se puede analizar no se ve particularmente limitada en tanto sea sospechosa de poner en contacto la anterior sustancia que se va a analizar. La muestra puede ser, en particular, muestras biológicas, tales como sangre, suero, plasma, orina, fluido cerebroespinal, extractos de célula o líquidos de tejido alterados.
Se pueden usar partículas de pol�mero preparadas con la presente invención en un procedimiento de l�tex para llevar a cabo un análisis. En el procedimiento de l�tex se usan partículas de l�tex en las que se introduce un ant�geno o anticuerpo específico para una sustancia que se va analizar.
Se puede seleccionar de forma apropiada un tamaño de partícula medio de las partículas de l�tex introducidas asociadas de acuerdo con una concentración de detección de la sustancia que se va a analizar, o un equipo de medida. El tamaño de partícula medio se puede seleccionar de forma apropiada dentro de un intervalo por lo general de 0,05 a 0,5 μm.
Como el anticuerpo introducido en las partículas de l�tex se puede usar un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. El anticuerpo se pueden usar como una molécula de inmunoglobulina tal cual, o un fragmento de la misma, tal como Fab, Fab’, F(ab’)2 o Fv.
El agente para análisis inmunol�gico se puede preparar de varias formas, por ejemplo, un sistema de componente de un reactivo que contiene un tampón y las partículas de l�tex en las que se introduce un ant�geno o anticuerpo; un sistema de componentes de dos reactivos en el que el primer reactivo contiene un tampón y el segundo reactivo contiene un anticuerpo monoclonal y las partículas de l�tex en las cuales se introduce un ant�geno o anticuerpo; o un sistema de componentes de dos reactivos en el que el primer reactivo contiene un tampón y las partículas de l�tex introducidas y el segundo reactivo contiene partículas de l�tex sensibilizadas con un ant�geno o anticuerpo.
En el procedimiento se usan el(los) anterior(es) reactivo(s) para llevar a cabo una reacción de aglutinación y un grado de la aglutinación se analiza de forma óptica (en particular se mide) para analizar (en particular medir) una cantidad de la sustancia que se va a analizar contenida en una muestra. El análisis óptico de un grado de la aglutinación de partículas de l�tex se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante un instrumento óptico para la medida de la intensidad de una luz difractada, una absorbancia, o una intensidad de una luz transmitida. Una longitud de onda de medida preferida es de 300 a 800 nm. El grado de aglutinación se puede llevar a cabo de acuerdo con un procedimiento conocido, por selección de un tamaño (tamaño de partícula medio) de la partícula de l�tex, una concentración de partícula de l�tex, o un tiempo de reacción, y medida de un aumento o reducción en una intensidad de luz difractada, una absorbancia o una intensidad de luz transmitida, o una combinación de los mismos.
De forma alternativa se puede analizar una cantidad de la sustancia que se va a analizar contenida en una muestra (en particular medir), poniendo en contacto el(los) anterior(es) reactivo(s) con una muestra en un líquido, llevando a cabo una separación B/F para separar las partículas de l�tex del líquido, y analizar (en particular medir) la sustancia que se va a
analizar unida a las partículas de l�tex, o la sustancia que se va a analizar que queda en el líquido.
La reacción de aglutinación de l�tex-partículas se puede medir de forma más precisa, se puede extender un intervalo medible en una concentración baja, y se puede evitar una reacción no específica, pero no solo seleccionando el tipo de un ant�geno o anticuerpo que se va a introducir, sino también ajustando otros factores que pueden afectar la reacción de aglutinación del l�tex. Como los factores que se pueden citar se encuentran, por ejemplo, una concentración de partículas de l�tex, una cantidad de un anticuerpo introducido en las partículas de l�tex, o un tamaño de partícula de la partícula de l�tex.
La reacción ant�geno-anticuerpo usada se puede llevar a cabo en las mismas condiciones que las de la reacción ant�geno-anticuerpo convencional. Como un medio de reacción se pueden seleccionar de forma apropiada diversos tampones de acuerdo con el tipo de la sustancia que se va analizar. No se ven particularmente limitados una resistencia iónica y un pH del tampón, en tanto el tampón no inactive la sustancia que se va a analizar y no inhiba la reacción ant�geno-anticuerpo. Como el tampón, por ejemplo, se puede usar un tampón de Good, un tampón de glicina, o un tampón tris. El pH en la reacción es preferiblemente 5 a 10, más preferiblemente 6 a 8. La temperatura de reacción es preferiblemente de 0 a 50� C, más particularmente 20 a 40� C. El tiempo de reacción se puede seleccionar de forma apropiada.
Ejemplos
La presente invención se ilustrar� ahora adicionalmente con los siguientes ejemplos, pero sin limitarse a estos. Ejemplo 1(1), ejemplo 4(1), y ejemplo 6(1) se encuentran dentro de las reivindicaciones.
Ejemplo 1: Preparación de reactivo para medida de anticuerpo de albúmina de suero anti-bovino (BSA)
(1)
Preparación de partículas de l�tex con BSA introducido
Despu�s de haberse mezclado 40 mmol de estireno, 4 mmol de hexadecano, 200 mg de BSA, 0,8 mmol de CH2=C(CH3)COO(CH2CH2O)23CH3 (éster NK M-230G; Shin-nakamura Chemical Co. Ltd.), 0,4 mmol de ácido asc�rbico, y 20 g de agua, se sometió la mezcla a ultrasonidos [salida: 80%, pulso: 50%, UH-300 (SMT Co., Ltd.)] en un baño de hielo durante 15 minutos. Se transfirió la totalidad a un matraz de tres bocas, y se burbuje� gas nitrógeno a través de todo durante 15 minutos mientras se agitaba a 100 rpm. Después se a�adi� 0,4 mmol de H2O2 y se polimeriz� a 30� C � 60� C durante 6 horas mientras se agitaba a 200 rpm para preparar partículas de l�tex con BSA introducido. Los tamaños de partícula medios de las partículas de l�tex con BSA introducido fueron de 0,109 μm (polimerizaci�n a 30� C) y 0,121 μm (polimerizaci�n a 60� C).
(2)
Preparación de suspensión de partículas de l�tex con BSA introducido
Respecto a 1 ml de partículas de l�tex con BSA introducido (concentración: 1%), se a�adi� 1 ml de un reactivo de bloqueo para la medida inmunol�gica N101 (NOF Corporation), y se agit� a temperatura ambiente durante 30 minutos. Esta mezcla se centrifug� a 35000 rpm. Se suspendió el precipitado resultante (es decir, el l�tex) en 10 ml de un tampón Tris (pH 8,0) para preparar una suspensión de partículas de l�tex con BSA introducido.
(3)
Preparación de tampón
Se a�adi� cloruro de sodio a 0,1 mol/l de tampón Tris (pH 8,0) que contiene 0,5% en peso de BSA de modo que se llegue a una concentración de 0,9% en peso para preparar un tampón. Después de esto un tampón Tris que contiene NaCl sin BSA se designa como “tampón A” y un tampón Tris que contiene NaCl con BSA se designa como “tampón B”.
(4)
Reactivo para la medida de anticuerpo anti-BSA
Se evalu� un sistema de componentes de dos reactivos constituido por la suspensión de partículas de l�tex con BSA introducido (segundo reactivo) preparado en el ejemplo 1(2) y tampón A � B (primer reactivo) preparado en el ejemplo 1(3) en los siguientes ejemplos, como un reactivo para la medida de un anticuerpo anti-BSA, un reactivo para análisis inmunol�gico de la presente invención.
Ejemplo 2: medida de solución patrón de anticuerpo anti-BSA
(1)
Preparación de solución patrón de anticuerpo anti-BSA
Se diluyó en serie un anticuerpo anti-BSA (albúmina de vaca anti-ratón; DAKO, 900 unidades) dos veces con solución salina fisiológica para preparar una serie de diluciones en serie de un anticuerpo anti-BSA patrón que presenta concentraciones de 900, 450, 225, 113, 56, 28, 14 y 7 unidades.
(2)
Medida de solución patrón de anticuerpo anti-BSA
Despu�s de haberse mezclado 90 μl de tampón A � B preparado en el ejemplo 1(3) con 15 μl de cada una de las series de dilución, e incubarse a 37� C durante un periodo de tiempo predeterminado, se a�adi� luego 90 μl de la suspensión de partículas de l�tex con BSA introducido preparada en el ejemplo 1(2) y se agit�. De la última adición se midieron las
0 7 14 28 56 113 225 450 900
absorbancias a longitudes de onda de 800 nm y 570 nm durante 5 minutos. La diferencia entre una variación de la absorbancia (es decir, un grado de cambio en absorbancia) a 570 nm y una variación de la absorbancia a 800 nm fue considerada como una variación de la absorbancia (ΔAbs). La medida se llev� a cabo usando un analizador automatizado (Hitachi 7170, Hitachi Ltd.).
A título comparativo las partículas de l�tex de poliestireno que presentan un tamaño de partícula medio de 0,11 μm (JSR Corporation, contenido en sólidos: 10%) se usaron para preparar una suspensión de partículas de l�tex unidas a BSA mediante sensibilizaci�n de 1 ml de las partículas (concentración: 1%) con 0,3% (3 mg/ml) de BSA.
Los resultados se muestran en la tabla 1 y figura 1, y tabla 2. La tabla 1 y la figura 1 muestran los resultados del reactivo (temperatura de polimerizaci�n = 30� C) de la presente invención descritos en el ejemplo 1(4) usando tampón A � B, as� como también los resultados de un reactivo convencional. La tabla 2 muestra los resultados de los reactivos (temperatura de polimerizaci�n = 30� C � 60� C) de la presente invención descritos en el ejemplo 1(4) usando tampón A (es decir, sin BSA) as� como también los resultados de un reactivo convencional.
Como es evidente en la tabla 1 y figura 1, cuando se us� el tampón A (es decir, sin BSA), la suspensión de partículas de l�tex con BSA introducido (reactivo de la presente invención) mostr� una variación de la absorbancia (ΔAbs) de 24513 a una concentración de anticuerpo anti-BSA de 900 unidades, mientras que la suspensión de partículas de l�tex unidas a BSA (reactivo convencional) mostr� una variación de la absorbancia (ΔAbs) de 385 a una concentración de anticuerpo anti-BSA de 900 unidades, y por tanto, la suspensión de partículas de l�tex con BSA introducido muestra de forma aparente una mayor sensibilidad. Cuando se us� tampón B (es decir, sin 0,5% de BSA), no se observaba reacción con las series de dilución del anticuerpo anti-BSA usando cualquier suspensión.
Tabla 1
Variaci�n de la absorbancia (ΔAbs)
Anticuerpo anti-BSA Reactivo convencional partículas unidas a Reactivo de la invención partículas unidas a (título) BSA BSA
Tamp�n A Tampón B Tampón A Tampón B
-20 -38 -19 -19 -18 -15 -5 63 385
Como es evidente en la tabla 2, cuando se usaron las suspensiones de partículas de l�tex con BSA introducido (reactivo de la presente invención, la suspensión de partículas de l�tex con BSA introducido obtenida llevando a cabo la reacción de polimerizaci�n a una temperatura baja (30� C) mostr� una variación de la absorbancia (ΔAbs) de 24513 a una concentración de anticuerpo anti-BSA de 900 unidades, mientras que la suspensión de partículas de l�tex con BSA introducido obtenida llevando a cabo la reacción de polimerizaci�n a una temperatura alta (60� C) mostr� una variación de la absorbancia (ΔAbs) de 8480 a una concentración de anticuerpo anti-BSA de 900 unidades, y por tanto, la suspensión de partículas de l�tex con BSA introducido preparadas a baja temperatura mostraban una mayor sensibilidad. Además, la suspensión de partículas de l�tex unidas a BSA (reactivo convencional) mostr� una variación de la absorbancia (ΔAbs) de 385 a una concentración de anticuerpo anti-BSA de 900 unidades, y por tanto, las suspensiones de partículas de l�tex con BSA introducido mostraron aparentemente una mayor sensibilidad.
-10 -7 -7 -9 -6 -6 -2 2 11 -102 84 407 1439 4546 7024 11471 16397 24513
-50 -50 -48 -46 -45 -48 -49 -43 -46
0 14 28 56 113 225 450 900
Tabla 2 Variación de la absorbancia (ΔAbs)
Part�culas unidas a BSA Partículas con BSA introducido
Anticuerpo anti-BSA (título) Temperatura de polimerizaci�n 30� C 60� C
-20 -19 -19 -18 -15 -5 63 385
Ejemplo 3: medida de suero humano usando reactivo para medida de anticuerpo anti-BSA
En este ejemplo se repitieron los procedimientos descritos en el ejemplo 2(2), excepto que se usaron cinco muestras de suero humano (números 1 a 5) como muestras normales y tres muestras de suero humano (números 6 a 8) como muestras no específicas en lugar de las series de dilución de un anticuerpo anti-BSA patrón. Las muestras no específicas reaccionaron de forma no específica con una suspensión de partículas de l�tex a las que se unió BSA (es decir, partículas de l�tex unidas a BSA), pero no reaccionaron con una suspensión de partículas de l�tex a las que no estaba unida BSA.
Los resultados se muestran en la tabla 3.
Como se muestra en la tabla 3, las muestras de suero normal (números 1 a 5) y las muestras de suero no específicas (números 6 a 8) no reaccionaron con la suspensión de partículas de l�tex con BSA introducido. Sin embargo la suspensión de partículas de l�tex con BSA unido reaccionaron fuertemente con las muestras no específicas cuando se usaba el tampón sin BSA (tampón A) o el tampón en el que se suspendió BSA al 0,5% (tampón B).
Tabla 3
Variaci�n de la absorbancia (ΔAbs)
Muestras de suero humano
Reactivo convencional partículas unidas a BSA Reactivo de la invención partículas unidas a BSA
Tamp�n A
Tampón B Tamp�n A Tampón B
[Normal]
N� 1
-76 -54 -4 2
N� 2
-88 25 -31 -16
N� 3
53 63 -47 -39
N� 4
89 92 -5 116
N� 5
100 129 2 14
[No específico]
N� 6
6382 6463 20 60
N� 7
2536 3570 23 71
N� 8
1571 2317 13 74
-
102 407 1439 4546 7024 11471 16397 24513 -73 -55 -1 114 406 1169 3507 8480 10
Ejemplo 4: preparación de reactivo para medida de anti-IgG
(1) Preparación de partículas de l�tex con IgG introducido
Despu�s de haberse mezclado 40 mmol de estireno, 4 mmol de hexadecano, 200 mg de IgG, 0,6 mmol de CH2=C(CH3)COO(CH2CH2O)23CH3 (éster NK M-230G; Shin-nakamura Chemical Co. Ltd.), 0,4 mmol de ácido asc�rbico, y 20 g de agua, se sometió la mezcla a ultrasonidos [salida: 80%, pulso: 50%, UH-300 (SMT Co., Ltd.)] en un baño de hielo durante 15 minutos. Se transfirió la totalidad a un matraz de tres bocas, y se burbuje� gas nitrógeno a través de todo durante 15 minutos mientras se agitaba a 100 rpm.
Despu�s se a�adi� 0,4 mmol de H2O2 y se polimeriz� a 30� C durante 6 horas mientras se agitaba a 200 rpm para preparar partículas de l�tex con IgG introducido. Los tamaños de partícula medios de las partículas de l�tex con IgG introducido fueron de 0,318 μm.
(2)
Preparación de suspensión de partículas de l�tex con IgG introducido
Respecto a 1 ml de partículas de l�tex con IgG introducido (concentración: 1%), se a�adi� 1 ml de un reactivo de bloqueo para la medida inmunol�gica N101 (NOF Corporation), y se agit� a temperatura ambiente durante 30 minutos. Esta mezcla se centrifug� a 35000 rpm. Se suspendió el precipitado resultante (es decir, el l�tex) en 10 ml de un tampón Tris (pH 8,0) para preparar una suspensión de partículas de l�tex con IgG introducido.
(3)
Reactivo para la medida de anticuerpo anti-IgG
Se evalu� un sistema de componentes de dos reactivos constituido por la suspensión de partículas de l�tex con IgG introducido (segundo reactivo) preparado en el ejemplo 4(2) y tampón B (primer reactivo) preparado en el ejemplo 1(3) en los siguientes ejemplos, como un reactivo para la medida de un anticuerpo anti-IgG, un reactivo para análisis inmunol�gico de la presente invención.
Ejemplo 5: medida de solución patrón de anticuerpo anti-IgG
(1)
Preparación de solución patrón de anticuerpo anti-IgG
Se diluyó en serie un anticuerpo anti-IgG (cadenas anti-IgG H&L; MILES-YEDA, 2,8 mg/ml) dos veces con solución salina fisiológica para preparar una serie de siete diluciones en serie de un anticuerpo anti-IgG patrón que presenta concentraciones de 2,8, 1,4, 0,7, 0,35, 0,175, 0,088 y 0,044 mg/ml.
(2)
Medida de solución patrón de anticuerpo anti-IgG
Despu�s de haberse mezclado 90 μl del tampón preparado en el ejemplo 1(3) con 2 μl de cada una de las series de dilución, e incubarse a 37� C durante un periodo de tiempo predeterminado, se a�adi� luego 90 μl de la suspensión de partículas de l�tex con IgG introducido preparada en el ejemplo 4(2) y se agit�. De la última adición se midieron las absorbancias a longitudes de onda de 800 nm y 570 nm durante 5 minutos. La diferencia entre una variación de la absorbancia a 570 nm y una variación de la absorbancia a 800 nm fue considerada como una variación de la absorbancia (ΔAbs). La medida se llev� a cabo usando un analizador automatizado (Hitachi 7170, Hitachi Ltd.).
A título comparativo las partículas de l�tex de poliestireno que presentan un tamaño de partícula medio de 0,283 μm (Sekisui, contenido en sólidos: 10%) se usaron para preparar una suspensión de partículas de l�tex unidas a IgG mediante sensibilizaci�n de 1 ml de las partículas (concentración: 1%) con 1% (10 mg/ml) de IgG, y se usaron la suspensión resultante de partículas de l�tex unidas a IgG y una suspensión de partículas de l�tex no sensibilizadas con IgG.
Los resultados del reactivo de la presente invención descrito en el ejemplo 4(3) se muestran en la tabla 4 y figura 2, junto con los resultados del reactivo convencional.
Como es evidente a partir de la tabla 4 y figura 2 la suspensión de partículas de l�tex con IgG introducido (reactivo de la presente invención) mostraron una variación de la absorbancia (ΔAbs) de 812 a una concentración de anticuerpo anti-IgG de 1,4 mg/ml, mientras que la suspensión de partículas de l�tex unidas a IgG (reactivo convencional) mostr� una variación de la absorbancia (ΔAbs) de 219, y por tanto, la suspensión de partículas de l�tex con IgG introducido muestran de forma aparente una mayor sensibilidad.
0,044 0,088 0,175 0,35 0,7 1,4 2,8
Tabla 4 Variación de la absorbancia (ΔAbs)
Anticuerpo anti-IgG (mg/ml)
Reactivo de la invención Reactivo convencional
Part�culas introducidas en BSA
Partículas unidas a Partículas no unidas
BSA
-
1 104 174 311 504 703 812 757
Ejemplo 6: preparación de reactivo de medida con anticuerpo anti-CRP-F(ab’)2 introducido
(1)
Preparación de partículas de l�tex con anticuerpo anti-CRP-F(ab’)2 introducido
Despu�s de mezclar 10 mmol de estireno, 1 mmol de hexadecano, 50 mg de anticuerpo anti-CRP F(ab’)2, 0,2 mmol de CH2=C(CH3)COO (CH2CH2O)23CH3 (éster NK M-230G; Shin-nakamura Chemical Co. Ltd.), 0,1 mmol de ácido asc�rbico, y 5 g de agua, se sometió la mezcla a ultrasonidos [salida: 50%, pulso: 50%, UH-300 (SMT Co., td)] en un baño de hielo durante 15 minutos. Se transfirió la totalidad a un matraz de tres bocas, y se burbuje� nitrógeno a través de todo durante 15 minutos mientras se agitaba a 100 rpm. Después se a�adi� 0,1 mmol de H2O2 y se polimeriz� a temperatura ambiente durante 6 horas mientras se agitaba a 200 rpm para preparar las partículas de l�tex con anticuerpo anti-CRP-F(ab’)2 introducido. Los tamaños de partícula medios de las partículas de l�tex con anticuerpo anti-CRP-F(ab’)2 introducido resultantes eran de 0,249 μm.
(2)
Preparación de suspensión de partículas de l�tex con anticuerpo anti-CRP-F(ab’)2 introducido
Respecto a 1 ml de partículas de l�tex con anticuerpo anti-CRP-F(ab’)2 introducido (concentración: 1%), se a�adi� 1 ml de un reactivo de bloqueo para la medida inmunol�gica N101 (NOF Corporation), y se agit� a temperatura ambiente durante 30 minutos. Esta mezcla se centrifug� a 35000 rpm. Se suspendió el precipitado resultante (es decir, el l�tex) en 10 ml de un tampón Tris (pH 8,0) para preparar una suspensión de partículas de l�tex con anticuerpo anti-CRP-F(ab’)2 introducido.
(3)
Reactivo para medida de CRP
Se evalu� un sistema de componentes de dos reactivos constituido por la suspensión de partículas de l�tex con anticuerpo anti-CRP-F(ab’)2 introducidos (segundo reactivo) preparado en el ejemplo 6(2) y tampón B (primer reactivo) en el ejemplo 1(3) en los siguientes ejemplos como un reactivo para la medida de CRP, un reactivo para análisis inmunol�gico de la presente invención.
Ejemplo 7: medida de solución patrón de CRP
(1)
Preparación de solución patrón de CRP
Se diluyó en serie CRP (Oriental Yeast Co., ltd., una solución de CRP recombinante, 100 mg/dl) con solución salina fisiológica para preparar una serie de seis diluciones en serie de un CRP patrón que presenta concentraciones de 3,2, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2 y 0,1 mg/dl.
(2)
Medida de solución patrón de CRP
Despu�s de haberse mezclado 90 μl del tampón preparado en el ejemplo 1(3) con 2 μl de cada una de las series de dilución, e incubarse a 37� C durante un periodo de tiempo predeterminado, se a�adi� luego 90 μl de la suspensión de partículas de l�tex con anticuerpo anti-CRP-F(ab’)2 introducido preparada en el ejemplo 6(2) y se agit�. De la última adición se midieron las absorbancias a longitudes de onda de 800 nm y 570 nm durante 5 minutos. La diferencia entre
-4 -3 7 35 71 132 219 262 -12 -8 -5 -4 -6 -2 -5 -5
una variación de la absorbancia a 570 nm y una variación de la absorbancia a 800 nm fue considerada como una variación de la absorbancia (ΔAbs). La medida se llev� a cabo usando un analizador automatizado (Hitachi 7170, Hitachi Ltd.).
Los resultados del reactivo de la presente invención descrito en el ejemplo 6(3) se muestran en la tabla 5.
Como es evidente a partir de la tabla 5, la suspensión de partículas de l�tex con anticuerpo anti-CRP-F(ab’)2 introducido (reactivo de la presente invención) mostr� una reactividad dependiente de la concentración con las soluciones patrón de CRP en el intervalo de 0,1 a 3,2 mg/dl.
Tabla 5
Variaci�n de la absorbancia (ΔAbs)
CRP (mg/dl) Reactivo de la invención partículas con anti-CRP-anticuerpo-F(ab’)2 introducido
0 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6 3,2
-
36 6 57 154 315 482 533
Aplicabilidad industrial
La presente invención se puede aplicar a análisis inmunol�gicos, de forma particular a un procedimiento de aglutinación en l�tex.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1.Un procedimiento de producción de partículas de pol�mero que tienen un ant�geno o un anticuerpo introducido en la superficie de las mismas, caracterizado porque comprende la etapa de llevar a cabo la polimerizaci�n en miniemulsi�n usando un mon�mero, un iniciador de polimerizaci�n por radicales, un emulsionante y un hidrófobo en presencia del
    5 ant�geno o anticuerpo, por medio de lo cual producir las partículas de pol�mero, en las que el iniciador de polimerizaci�n por radicales es un iniciador redox.
  2. 2.El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la reacción de polimerizaci�n se lleva a cabo a baja temperatura en la polimerizaci�n en miniemulsi�n.
  3. 3.El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la reacción de polimerizaci�n se lleva a cabo de 0 a 40� 10 C.
  4. 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 a 3, en el que el iniciador redox es una combinación de ácido asc�rbico y H2O2.
  5. 5.El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el emulsionante es un tensioactivo.
    15 6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el emulsionante es un tensioactivo polim�rico que tiene una cadena de polietilenglicol.
  6. 7.El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el hidrófobo es hexadecano o poliestireno.
ES07829923.7T 2006-10-16 2007-10-16 Procedimiento de producción de partículas de pol�mero Active ES2468243T3 (es)

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JP2006281840 2006-10-16
JP2006281840 2006-10-16
PCT/JP2007/070189 WO2008047798A1 (fr) 2006-10-16 2007-10-16 Procédé de production de microparticules polymères

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