CN101542286B - 高分子微粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了向表面导入了上述抗原或抗体的高分子微粒的制备方法，该方法是在使用单体、自由基聚合引发剂、乳化剂和疏水物进行细乳液聚合时，使抗原或抗体共存，制备高分子微粒。该方法可提供检测灵敏度高、并且可以避免以往发生的非特异性反应的免疫学分析试剂。

Description

高分子微粒的制备方法
技术领域
本发明涉及在细乳液聚合中、通过使抗原或抗体共存，上述抗原或抗体导入了表面的高分子微粒的制备方法。
背景技术
目前在临床诊断检查现场中，对于多数检体要求短时间且高精度地测定作为疾病诊断指标的多种物质，并将该结果迅速、准确地反馈给治疗临床现场，其中，通过利用抗原抗体反应的免疫学测定可以实施很多对微量的分析对象物的准确定量。特别是作为提高检测灵敏度或准确性的方法，已知有将分析对象物的抗原或抗体担载在聚苯乙烯等合成高分子(所谓的胶乳)颗粒表面，利用该颗粒进行的胶乳凝聚法。胶乳凝聚法是目视或光学检测分析对象物质和与胶乳颗粒结合的抗原或抗体的反应而产生的胶乳颗粒的凝聚程度，短时间内测定分析对象物质的方法。
还大多采用夹层法，该方法是：将胶乳颗粒制成磁性颗粒，由此通过与磁性颗粒结合的第一抗体捕获分析对象物质，用磁石收集，漂洗未反应物等(所谓的B/F分离)，然后添加酶或荧光剂等标记产生信号的物质的第二抗体，进行分析。
根据抗原抗体反应进行定量的分析对象物质通常大多是生物体试样中所含的微量成分，重点在于低浓度区域的定量性。但是，根据疾病的进展程度，测定对象物质浓度有时会显示异常高的值，因此在临床检查现场中，需求具有可准确地测定低值至高值的性能的试剂。
不管胶乳凝聚法或是夹层法，在使用胶乳颗粒时，必须是在胶乳颗粒的表面固定抗原或抗体，其方法是采用物理或化学担载的方法。例如通过物理吸附在胶乳颗粒上直接固定抗原或抗体，或者采用通过经由胶乳颗粒表面的官能团、例如氨基、羧基、巯基、羟基、醛基或环氧基等的共价键，在胶乳颗粒上结合抗原或抗体的方法。
但是，这些物理或化学结合方法中，可担载在胶乳表面上的抗原或抗体的量是有限的，从测定范围或检测灵敏度方面考虑，上述胶乳凝聚法或夹层法的实施也是有极限的。即，胶乳颗粒本身的特性(表面电荷、官能团的导入率、粒度分布等)在每批次之间、不同生产商之间都不固定，因此，即使结合抗原或抗体的操作是固定的，制备的结合抗体的胶乳颗粒的性能也产生不均匀。例如在与胶乳表面物理或化学结合的方法中，抗原或抗体未完全结合，而是由于结合后的漂洗而被除去，或由于离心或分散处理使结合的抗原或抗体剥落。即，结合的抗原或抗体的量不均匀，因此对于测定范围或检测灵敏度有影响。
近年来的一个新问题是如非专利文献1所公开的那样，有一种检体，在胶乳颗粒表面结合抗原或抗体时抗原或抗体发生结构性改性，试样中共存的“与改性部位结合的物质”导致非特异性反应。由此，测定结果的可靠性丧失，无法准确进行疾病诊断。该问题并不是对抗原或抗体、或者胶乳颗粒分别进行研究即可解决的，是非常高难度的课题。
非专利文献1：“临床病理”，2000年8月，第48卷，第8号，760-763页
发明的内容
本发明人对可代替目前采用的物理或化学结合方法的、抗原或抗体与与胶乳表面结合的方法进行了深入的研究，结果发现，在合成胶乳颗粒时使作为抗原或抗体的蛋白质同时共存，则在合成结束时可得到上述抗原或抗体导入到胶乳颗粒表面的胶乳颗粒。并且令人惊异的是，导入的抗原或抗体仍保持其特性，与以往的物理性吸附等的试剂相比，上述胶乳颗粒与分析对象物质显示高的反应性，并且发现：导入到胶乳颗粒表面的抗原或抗体不会发生由于结合导致的结构上的改性，可以避免与以往所见的发生非特异性反应的检体反应。本发明人发现：在胶乳颗粒的合成反应中，在使抗原或抗体共存的状态下、在特定条件下，可以使单体聚合，从而完成了本发明。
本发明的课题在于提供新型的高分子微粒的制备方法，该方法可提供检测灵敏度高、并且可以避免以往发生的非特异性反应的免疫学分析试剂。
上述课题通过本发明的向表面导入了上述抗原或抗体的高分子微粒的制备方法解决，其特征在于：在使用单体、自由基聚合引发剂、乳化剂和疏水物进行细乳液聚合时，使抗原或抗体共存，制备高分子微粒。
本发明涉及由上述制备方法得到的、向高分子微粒的表面导入了蛋白质的高分子微粒。
根据本发明的优选方案，上述细乳液聚合是在低温(优选0-40℃)下进行聚合反应的低温细乳液聚合。
根据本发明的又一优选方案，上述自由基聚合引发剂是氧化还原引发剂，更优选抗坏血酸与H2O2的组合。
根据本发明的又一优选方案，上述乳化剂是聚合性表面活性剂，更优选具有聚乙二醇链的聚合性表面活性剂。
根据本发明的又一优选方案，上述疏水物是十六碳烷或聚苯乙烯。
本发明进一步涉及以下内容：
免疫学分析试剂，该免疫学分析试剂含有胶乳颗粒的悬浮液，该胶乳颗粒是在胶乳颗粒的合成反应中，在分析对象物质的抗原或抗体共存的状态下进行单体聚合，向上述胶乳颗粒的表面导入了上述抗原或抗体而成。
免疫学分析方法，该方法是将(1)可能含有分析对象化合物的被检试样与(2)胶乳颗粒在液体中接触；所述(2)胶乳颗粒是在胶乳颗粒的合成反应中，在上述分析对象物质的抗原或抗体共存的状态下使单体聚合，向上述胶乳颗粒的表面导入上述抗原或抗体而形成。
[2]的免疫学分析方法，其中，对上述接触后抗原抗体反应产生的胶乳颗粒的凝聚程度进行光学分析。
[2]的免疫学分析方法，其中，上述接触后，将上述液体与上述胶乳颗粒分离，对与上述胶乳颗粒结合的分析对象物质、或残留在上述液体中的分析对象物质进行分析。
根据本发明，可以提供新型高分子微粒，该新型高分子微粒可提供检测灵敏度高、且可以避免以往发生的非特异性反应的免疫学分析试剂。
附图简述
图1是表示用使用导入了BSA的胶乳颗粒的本发明试剂、和使用结合有BSA的胶乳颗粒的以往试剂，测定抗BSA抗体标准溶液的2倍稀释系列的结果的曲线图。
图2是表示用使用导入了BSA的胶乳颗粒的本发明试剂、和使用结合有BSA的胶乳颗粒的以往试剂，测定抗IgG抗体标准溶液的2倍稀释系列的结果的曲线图。
具体实施方式
本发明的制备方法的特征在于：在进行细乳液聚合时，使抗原或抗体共存。根据本发明的制备方法，可以制备向高分子微粒(特别是胶乳颗粒)的表面导入了上述抗原或抗体的高分子微粒(特别是胶乳颗粒)(以下称为导入了配偶体的高分子微粒)。
本发明的制备方法除了聚合反应时使抗原或抗体共存之外，可以与以往公知的细乳液聚合(例如M.Antonietti，K.Landfester，Prog.Polym.Sci.，2002，27，689-757、J.M.Asua，Prog.Polym.Sci.，2002，27，1283-1346)同样实施。
通常的细乳液聚合例如可以包含将单体、自由基聚合引发剂、乳化剂和疏水物混合的步骤；将上述混合物剪切的步骤；以及将上述混合物加热至聚合引发温度使其聚合的步骤，但并不限于此。细乳液聚合中，将聚合用单体和乳化剂混合后，例如实施超声波照射的剪切步骤，通过上述剪切力来切碎单体，形成被乳化剂覆盖的单体微油滴。可以加热至自由基聚合引发剂的聚合起始温度，将单体微油滴直接聚合，获得高分子微粒。
本发明中使用的抗原或抗体只要是显示表面活性的抗原或抗体即可，没有特别限定，优选胶乳法(例如胶乳凝聚法、使用胶乳的B/F分离)中可利用的抗原或抗体。抗原或抗体是否显示表面活性，这可通过公知方法、例如表面张力测定、或将芘应用于荧光探针的荧光色谱测定来确认。本发明中使用的抗原或抗体优选为上述在将芘应用于荧光探针的荧光色谱测定中，芘的第一发光峰(I1)和第三发光峰(I3)的强度比(I1/I3)为0.5-1.6(更优选0.6-1.5)的抗原或抗体。例如上述抗原或抗体有各种抗体、受体、酶、脂类、糖链等，具体来说有：IgG、C反应蛋白(CRP)、铁蛋白、β-2小球蛋白、α-甲胎蛋白(AFP)、IgE、乙型肝炎病毒(HBS抗体或HBc抗体)、D二聚体、纤维蛋白/纤维蛋白原分解产物(FDP)、可溶性纤维蛋白(SF)、纤维蛋白溶酶/α2-纤维蛋白溶酶抑制剂复合物(PPI)、前列腺特异性抗原(PSA)、弹性蛋白酶1、弹性蛋白酶XDP、血栓调节蛋白、或白蛋白(优选血清白蛋白)等。
使用抗体时，可以使用单克隆抗体或多克隆抗体。抗体的种类除免疫球蛋白分子本身之外，还可以使用抗体片段例如Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv等。
可在本发明中使用的单体可以使用可在常规的细乳液聚合中使用的单体，例如有苯乙烯、苯乙烯衍生物(例如氯甲基苯乙烯、苯乙烯磺酸钠)、丙烯酸或甲基丙烯酸、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯[例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸十六烷基酯]、乙酸乙烯酯。
可在本发明中使用的自由基聚合引发剂可以使用可在常规的细乳液聚合中使用的自由基聚合引发剂，例如有：过氧化引发剂、过硫酸引发剂、偶氮系引发剂或氧化还原引发剂。本发明中，从可在低温下进行聚合反应的角度考虑，优选使用氧化还原引发剂。聚合反应时共存的抗原或抗体具有生理活性时，通过在低温下进行上述聚合反应，可以抑制生理活性的降低。
上述过氧化引发剂例如有：过氧化苯甲酰(BPO)、过氧化二叔丁基(DBPO)、过氧化铵。上述过硫酸引发剂例如有：过硫酸钾(KPS)、过硫酸铵(APS)、过硫酸钠(NPS)。上述偶氮系引发剂例如有：偶氮二异丁腈(AIBN)、2，2′-偶氮二异丁酸二甲酯(MAIB)、4，4′-偶氮二(4-氰基戊酸)、2，2′-偶氮二(2，4-二甲基戊腈)。
上述氧化还原引发剂例如有：N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TMEDA)/过硫酸钾(KPS)、FeSO4/KPS、FeSO4/H2O2、抗坏血酸(维生素C)/H2O2等。从可以实现高转化率(例如75-98％)的角度考虑，优选抗坏血酸/H2O2的组合。
可在本发明中使用的乳化剂可以使用在细乳液聚合中通常使用的各种表面活性剂，例如有：阴离子性化合物、阳离子性化合物、非离子性化合物。上述非离子性化合物例如有：具有聚乙二醇(PEG)链的聚合性表面活性剂、长链醇、聚乙烯醇、Brij 35(PIERCE公司制备)。
具有聚乙二醇(PEG)链的聚合性表面活性剂例如可以是CH2＝C(CH3)COO(CH2CH2O)nCH3(n为2或以上的整数，优选2-100，更优选5-80，进一步优选8-50，特别优选9-23)，更具体地说，例如有CH2＝C(CH3)COO(CH2CH2O)23CH3[n＝23，(商品名)NK酯M-230G(商品名)，新中村化学工业株式会社]、CH2＝C(CH3)COO(CH2CH2O)9CH3[n＝9，(商品名)NK酯M-90G，新中村化学工业株式会社]。使用上述聚合性表面活性剂作为乳化剂，可以获得由于空间排斥导致的分散稳定性。
上述长链醇例如有1-戊醇、癸醇。
可在本发明中使用的疏水物可以使用常规细乳液聚合中可使用的疏水物，例如有：十六碳烷、硅倍半氧烷或疏水性聚合物(例如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯)，优选十六碳烷或聚苯乙烯。通过使用疏水物，可以抑制由于奥氏成熟导致的粒径不均匀性的增大，可以合成单分散的胶乳颗粒。
聚合时的反应条件例如溶剂、混合比、温度、反应时间等可根据使用的单体和抗原或抗体的种类、要合成的高分子微粒的平均粒径、担载在微粒表面上的抗原或抗体的量等，例如通过实施比较试验来适当确定。
例如，相对于40mmol聚合用单体(例如苯乙烯单体)，通常是以0.01-5g、优选0.02-2g、更优选0.08-0.8g的量使用抗原或抗体[例如牛血清白蛋白，IgG，F(ab′)2]；通常以0.01-4mmol、优选0.02-2mmol的量使用自由基聚合引发剂(例如抗坏血酸、H2O2)；通常以0.1-10mmol、优选0.2-5mmol、更优选0.4-4mmol的量使用乳化剂(例如NK酯M-230G、NK酯M-90G、)。反应时间通常为1小时或以上、优选3-48小时、更优选4-24小时。反应温度通常为0-80℃，优选0-60℃，更优选0-40℃。
根据本发明的制备方法，可以制备向胶乳颗粒的表面导入了抗原或抗体的胶乳颗粒。
以往使用的胶乳颗粒中，例如通过物理性吸附在胶乳颗粒上直接固定抗原或抗体，或者通过经由胶乳颗粒表面的官能团例如氨基、羧基、巯基、羟基、醛基或环氧基等的共价键使抗原或抗体与胶乳颗粒结合。可通过本发明的制备方法制备的导入了抗原或抗体的胶乳颗粒是抗原或抗体的一部分埋入到胶乳颗粒中、使上述抗原或抗体担载在胶乳表面形成的胶乳颗粒。
在合成胶乳颗粒时导入共存的抗原或抗体的方法是，通过低温细乳液聚合制备的胶乳颗粒通过在合成结束时抗原或抗体导入到胶乳颗粒表面，由此可以制备不会发生以往的未结合而被漂洗除去、或者由于离心或分散处理而使结合的抗原或抗体剥落的胶乳颗粒，通过使用上述胶乳颗粒可以获得高反应性。合成结束时抗原或抗体被导入到胶乳颗粒表面，因此不会因结合导致空间位阻，不会发生改性，因此可以避免与以往可见的发生非特异性反应的检体反应。
本发明的制备方法中，在细乳液聚合时共存的抗原或抗体导入到高分子微粒(例如胶乳)表面的作用机理尚未明确，本发明人如下推测。即，本发明中使用的抗原或抗体由于显示表面活性，通过其亲水性部分而存在于作为与水的接合区域的高分子微粒(例如胶乳)的表面。本发明并不限于该推测。
本发明还涉及新型的免疫学分析试剂和免疫学分析方法。本发明的免疫学分析试剂和免疫学分析方法中，使用在胶乳颗粒的表面导入抗原或抗体(即免疫学配偶体)的胶乳颗粒(以下称为导入配偶体的胶乳颗粒)代替以往使用的通过物理或化学结合在胶乳表面担载抗原或抗体的胶乳颗粒。上述的导入配偶体的胶乳颗粒只要是抗原或抗体的一部分埋入到胶乳颗粒中、使上述抗原或抗体担载在胶乳表面形成的胶乳颗粒即可，没有特别限定。例如可通过本发明的制备方法制备。
本发明中，在分析中采用胶乳法(例如胶乳凝聚法、使用胶乳的B/F分离)。在将导入了分析对象物质的抗原或抗体(例如多克隆抗体或单克隆抗体、或它们的抗体片段)的胶乳颗粒与分析对象物质接触、实施胶乳上的抗原抗体反应的系统中，导入的抗原或抗体为没有空间位阻导致的改性状态，因此不与对改性部位为非特异性的检体反应，比以往的方法更高灵敏度地对分析对象物质进行分析(检测或测定，优选测定)。
可根据本发明进行分析的物质(分析对象物质)只要是通常利用抗原抗体反应、可作为抗原或抗体进行分析的物质(特别是生理活性物质)即可。分析对象物质的代表性例子有：蛋白质、脂类、糖链等，更具体的说，例如有：各种抗体、受体或酶等。具体来说有：IgG、C反应蛋白(CRP)、铁蛋白、β-2小球蛋白、α-甲胎蛋白(AFP)、IgE、乙型肝炎病毒(HBS抗体或HBc抗体)、D二聚体、纤维蛋白/纤维蛋白原分解产物(FDP)、可溶性纤维蛋白(SF)、纤维蛋白溶酶/α2-纤维蛋白溶酶抑制剂复合物(PPI)、前列腺特异性抗原(PSA)、弹性蛋白酶1、弹性蛋白酶XDP、血栓调节蛋白、或白蛋白(优选血清白蛋白)等。
可通过本发明进行分析的被检试样只要是可能含有上述分析对象物质的试样即可，没有特别限定，特别例举生物试样，例如血液、血清、血浆、尿、髓液或细胞或者组织破碎液等。
本发明中，在该分析中采用胶乳法。本发明的胶乳法中，使用导入与分析对象物质特异性反应的抗原或抗体的胶乳颗粒。
导入配偶体的胶乳颗粒的平均粒径可根据分析对象物质的检测浓度或测定仪器适当选择，通常在0.05-0.5μm的范围内适当选择。
导入到胶乳颗粒中的抗体可以使用单克隆抗体或多克隆抗体。抗体的种类除免疫球蛋白分子本身之外，还可以使用抗体片段、例如Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv等。
本发明的免疫学分析试剂例如可以是以下各种形态：含有导入了抗原或抗体的胶乳颗粒、以及缓冲液的单液系试剂；由含有作为缓冲液的第一试剂、含有导入了抗原或抗体的胶乳颗粒和单克隆抗体两者的第二试剂构成的双液系试剂；或者由含有缓冲液和导入的胶乳颗粒两者的第一试剂、含有用抗原或抗体致敏的胶乳颗粒的第二试剂构成的双液系试剂等。
本发明中，如上所述使用试剂进行凝聚反应，对产生的凝聚的程度(凝聚度)进行光学分析(特别是测定)，由此可以对被检试样中的分析对象物质的量进行分析(特别是测定)。光学检测胶乳颗粒的凝聚度的具体方法中，例如可使用测定散射光强度、吸光度或透射光强度的光学仪器进行测定。优选的测定波长是300-800nm。测定方法可按照公知的方法、根据所使用的胶乳颗粒的大小(平均粒径)或浓度的选择、或反应时间的设定来测定散射光强度、吸光度、或透射光强度的增加或减少来进行。也可以将这些方法结合使用。
或者，将上述试剂和被检试样在液体中接触，然后进行B/F分离，由此使胶乳颗粒与液体分离，对与上述胶乳颗粒结合的分析对象物质、或者残留在上述液体中的分析对象物质进行分析(特别是测定)，由此可以对被检试样中的分析对象物质的量进行分析(特别是测定)。
本发明中，除了选择要导入的抗原或抗体的种类之外，通过调节对胶乳凝聚反应产生影响的其它因素，可以更精密地放大胶乳颗粒凝聚反应，可以使低浓度区域的可定量范围进一步扩大，或进一步抑制非特异性反应。对胶乳凝聚反应产生影响的其它因素例如有：胶乳颗粒的浓度、导入到胶乳颗粒中的抗原或抗体的量、或胶乳颗粒的粒径等。
本发明中采用的抗原抗体反应的条件可以与通常的条件同样，反应介质可以根据分析对象物质的种类适当选择各种缓冲液。该缓冲液只要具有不使分析对象物质失活、且不抑制抗原抗体反应的离子浓度或pH即可。例如可以使用Good’s缓冲液、甘氨酸缓冲液或Tris缓冲液。反应的pH优选5-10，特别优选6-8。反应温度为0-50℃，优选20-40℃。反应时间可适当确定。
实施例
以下通过实施例具体说明本发明，它们并不限定本发明的范围。
《实施例1：抗牛血清白蛋白(BSA)抗体测定试剂的制备》
(1)导入了BSA的胶乳颗粒的制备
将40mmol苯乙烯、4mmol十六碳烷、200mg BSA、0.8mmolCH2＝C(CH3)COO(CH2CH2O)23CH3(NK酯M-230G，新中村化学工业株式会社)、0.4mmol抗坏血酸和20g水混合，在80％输出功率、50％脉冲下、在冰浴下实施15分钟超声处理(UH-300：株式会社ェスェムテ一)。加入到三颈烧瓶中，边以100rpm搅拌边实施15分钟的氮气鼓入，然后加入0.4mmol H2O2，边以200rpm搅拌边在30℃或60℃下聚合6小时，制备导入了BSA的胶乳颗粒。所得导入了BSA的胶乳颗粒的平均粒径为0.109μm(30℃时)和0.121μm(60℃时)。
(2)导入了BSA的胶乳颗粒悬浮液的制备
在1mL导入了BSA胶乳颗粒(1％浓度)中添加1mL免疫学测定用封闭试剂N101(日本油脂株式会社制备)，在室温下搅拌30分钟。将该混合液以35000rpm离心分离。向所得沉淀物中加入10mL Tris缓冲液(pH8.0)，使胶乳悬浮，制备导入了BSA的胶乳颗粒悬浮液。
(3)缓冲液的制备
向含有0.5重量％BSA的0.1mol/L Tris缓冲液(pH8.0)中添加氯化钠，浓度为0.9重量％，制成缓冲液。以下，将不含有BSA的含NaCl Tris缓冲液称为“缓冲液A”，将含有BSA的含NaCl Tris缓冲液称为“缓冲液B”。
(4)抗BSA抗体测定试剂
将由在实施例1(2)中制备的导入了BSA的胶乳颗粒的悬浮液(第二试剂)、和在实施例1(3)中制备的缓冲液A或B(第一试剂)构成的双液系试剂作为本发明的免疫学分析试剂的抗BSA抗体测定试剂，在以下的实施例中进行评价。
《实施例2：抗BSA抗体标准溶液的测定》
(1)抗BSA抗体标准溶液的制备
将抗BSA抗体(兔抗牛白蛋白，DAKO制备，900单位)用生理盐水2倍稀释，制备900、450、225、113、56、28、14和7单位浓度的标准抗BSA抗体稀释系列。
(2)抗BSA抗体标准溶液的测定
在15μL标准抗BSA抗体稀释系列中混合90μL实施例1(3)中制备的缓冲液A或B，在37℃下适当保持，然后添加90μL实施例1(2)中制备的导入了BSA的胶乳颗粒悬浮液并搅拌，5分钟后以波长800-570nm测定吸光度。以该期间的570nm的吸光度变化量和800nm吸光度变化量的差作为吸光度变化量(ΔAbs)。测定使用日立自动分析装置7170型进行。
为了进行比较，使用用平均粒径0.11μm的聚苯乙烯胶乳颗粒(日本合成橡胶制备：固形成分10％)，以0.3％(3mg/mL)的量对1mL上述颗粒1％浓度致敏，而制备成的结合BSA的胶乳颗粒悬浮液。
结果如表1和图1以及表2所示。表1和图1中，将使用缓冲液A或B时的实施例1(4)所述的本发明试剂(聚合温度＝30℃)的结果与以往的试剂的结果一并表示。表2中，将使用缓冲液A(即不含BSA)时的实施例1(4)中所述本发明试剂(聚合温度＝30℃或60℃)的结果与以往试剂的结果一并表示。
由表1和图1可知，使用缓冲液A(即不含BSA)时，导入了BSA的胶乳颗粒悬浮液中(本发明试剂)，抗BSA抗体浓度为900单位，吸光度的变化量(ΔAbs)为24513，而在结合BSA的胶乳颗粒悬浮液中(以往的试剂)，900单位的吸光度变化量(ΔAbs)为385，导入了BSA的胶乳颗粒悬浮液明显为高灵敏度。使用缓冲液B(即含有0.5％BSA)，则结合BSA的胶乳颗粒悬浮液、导入了BSA的胶乳颗粒悬浮液均未见与抗BSA抗体稀释系列的反应性。
[表1]
由表2可知，在导入了BSA的胶乳颗粒悬浮液(本发明试剂)中，以低温(30℃)实施聚合反应得到的导入了BSA的胶乳颗粒悬浮液中，抗BSA抗体浓度为900单位，吸光度变化量(ΔAbs)为24513，而在高温(60℃)下实施得到的导入了BSA的胶乳颗粒悬浮液在900单位下吸光度变化量(ΔAbs)为8480，在低温下导入了BSA的胶乳颗粒的悬浮液为高灵敏度。在结合BSA的胶乳颗粒悬浮液中(以往试剂)，900单位下的吸光度变化量(ΔAbs)为385，导入了BSA的胶乳颗粒悬浮液明显为高灵敏度。
[表2]
《实施例3：通过抗BSA抗体测定试剂对人血清进行测定》
本实施例中，使用5例作为正常检体的人血清(检体No.1-No.5)和3例作为非特异性检体的人血清(检体No.6-No.8)代替标准抗BSA抗体稀释系列，除此之外重复上述实施例2(2)的操作。上述非特异性检体是与在胶乳颗粒上结合了BSA的结合BSA的胶乳颗粒悬浮液发生非特异性反应、不与未结合BSA的胶乳颗粒悬浮液反应的检体。
结果如表3所示。
由表3可知，正常检体(血清No.1-No.5)、非特异性检体(血清No.6-No.8)均未见与导入了BSA的胶乳颗粒悬浮液反应，但在结合BSA的胶乳颗粒悬浮液中，无论在不含有BSA的缓冲液(缓冲液A)、还是悬浮有0.5％BSA的缓冲液(缓冲液B)中均见到与非特异性检体的强烈反应。
[表3]
《实施例4：抗IgG测定试剂的制备》
(1)导入了IgG的胶乳颗粒的制备
将40mmol苯乙烯、4mmol十六碳烷、200mg IgG、0.6mmolCH2＝C(CH3)COO(CH2CH2O)23CH3(NK酯M-230G，新中村化学工业株式会社)、0.4mmol抗坏血酸和20g水混合，在80％输出功率、50％脉冲下、在冰浴下实施15分钟超声处理(UH-300：株式会社ェスェムテ一)。加入到三颈烧瓶中，边以100rpm搅拌边实施15分钟的氮气鼓入，然后加入0.4mmol H2O2，边以200rpm搅拌边在30℃下聚合6小时，制备导入了IgG的胶乳颗粒。所得导入了IgG的胶乳颗粒的平均粒径为0.318μm。
(2)导入了IgG的胶乳颗粒悬浮液的制备
在1mL导入了IgG的胶乳颗粒(1％浓度)中添加1mL免疫学测定用封闭试剂N101(日本油脂株式会社制备)，在室温下搅拌30分钟。将该混合液以35000rpm离心分离。向所得沉淀物中加入10mL Tris缓冲液(pH8.0)，使胶乳悬浮，制备导入了IgG的胶乳颗粒悬浮液。
(3)抗IgG抗体测定试剂
将由在实施例4(2)中制备的导入了IgG的胶乳颗粒的悬浮液(第二试剂)、和在实施例1(3)中制备的缓冲液B(第一试剂)构成的双液系试剂作为本发明的免疫学分析试剂的抗IgG抗体测定试剂，在以下的实施例中进行评价。
《实施例5：抗IgG抗体标准溶液的测定》
(1)抗IgG抗体标准溶液的制备
将抗IgG抗体标准溶液(抗IgG H&L链，MILES-YEDA制备，2.8mg/mL)用生理盐水2倍稀释，制备2.8、1.4、0.7、0.35、0.175、0.088和0.044mg/mL的7种浓度的标准抗IgG抗体稀释系列。
(2)抗IgG抗体标准溶液的测定
在2μL标准抗IgG抗体稀释系列中混合90μL实施例1(3)中制备的缓冲液，在37℃下适当保持，然后添加90μL实施例4(2)中制备的导入了IgG的胶乳颗粒悬浮液并搅拌，5分钟后以波长800/570nm测定吸光度。以该期间的570nm的吸光度变化量和800nm吸光度变化量的差作为吸光度变化量(ΔAbs)。测定使用日立自动分析装置7170型进行。
为了进行比较，使用用平均粒径0.283μm的聚苯乙烯胶乳颗粒(セキスィ制备：固形成分10％)，以1％(10mg/mL)的量的IgG对1mL上述颗粒1％浓度致敏，而制备成的结合IgG的胶乳颗粒悬浮液，和未致敏IgG的胶乳颗粒悬浮液。
将实施例4(3)所述的本发明试剂的结果与以往的试剂的结果一并表示在表4和图2中。
由表4和图2可知，使用导入了IgG的胶乳颗粒悬浮液时(本发明试剂)，抗IgG抗体浓度为1.4mg/mL，吸光度的变化量(ΔAbs)为812，而使用结合IgG的胶乳颗粒悬浮液时(以往的试剂)，吸光度变化量(ΔAbs)为219，导入了IgG的胶乳颗粒悬浮液明显为高灵敏度。
[表4]
《实施例6：抗CRP抗体F(ab′)2测定试剂的制备》
(1)导入了抗CRP抗体F(ab′)2的胶乳颗粒的制备
将10mmol苯乙烯、1mmol十六碳烷、50mg抗CRP抗体F(ab′)2、0.2mmol CH2＝C(CH3)COO(CH2CH2O)23CH3(NK酯M-230G，新中村化学工业株式会社)、0.1mmol抗坏血酸和5g水混合，在50％输出功率、50％脉冲下、在冰浴下实施15分钟超声处理(UH-300：株式会社ェスェムテ一)。加入到三颈烧瓶中，边以100rpm搅拌边实施15分钟的氮气鼓入，然后加入0.1mmol H2O2，边以200rpm搅拌边在室温下聚合6小时，制备导入了抗CRP抗体F(ab′)2的胶乳颗粒。所得导入了抗CRP抗体F(ab′)2的胶乳颗粒的平均粒径为0.249μm。
(2)导入了抗CRP抗体F(ab′)2的胶乳颗粒悬浮液的制备
在1mL导入了抗CRP抗体F(ab′)2的胶乳颗粒(1％浓度)中添加1mL免疫学测定用封闭试剂N101(日本油脂株式会社制备)，在室温下搅拌30分钟。将该混合液以35000rpm离心分离。向所得沉淀物中加入10mLTris缓冲液(pH8.0)，使胶乳悬浮，制备导入了抗CRP抗体F(ab′)2的胶乳颗粒悬浮液。
(3)CRP测定试剂
将由实施例6(2)中制备的导入了抗CRP抗体F(ab′)2的胶乳颗粒悬浮液(第二试剂)、和实施例1(3)中制备的缓冲液B(第一试剂)构成的双液系试剂作为本发明的免疫学分析试剂的CRP测定试剂，在以下的实施例中进行评价。
《实施例7：CRP标准溶液的测定》
(1)CRP标准溶液的制备
将CRP(ォリェンタル酵母株式会社制备的重组CRP溶液100mg/dL)用生理盐水稀释，制备3.2、1.6、0.8、0.4、0.2和0.1mg/dL的6种浓度的标准CRP稀释系列。
(2)CRP标准溶液的测定
在2μL标准CRP稀释系列中混合90μL实施例1(3)中制备的缓冲液，在37℃下适当保持，然后添加90μL实施例6(2)中制备的导入了抗CRP抗体F(ab′)2的胶乳颗粒悬浮液并搅拌，5分钟后以波长800/570nm测定吸光度。以该期间的570nm的吸光度变化量和800nm吸光度变化量的差作为吸光度变化量(ΔAbs)。测定使用日立自动分析装置7170型进行。
将实施例6(3)所述的本发明试剂的结果表示在表5中。
由表5可知，使用抗CRP抗体F(ab′)2胶乳颗粒悬浮液时(本发明试剂)，在0.1-3.2mg/dL的范围内得到了与抗CRP标准液的浓度相关性的反应性。
[表5]
产业实用性
本发明可适用于免疫学分析(特别是胶乳凝聚法)的用途。
以上是按照特定的方案说明了本发明，本领域已知的变形或改良均包含在本发明的范围内。

Claims (4)

1.向表面导入了抗原或抗体的高分子微粒的制备方法，其特征在于：在使用单体、自由基聚合引发剂、乳化剂和疏水物进行细乳液聚合时，使抗原或抗体共存，制备高分子微粒，上述自由基聚合引发剂是氧化还原引发剂，上述氧化还原引发剂是抗坏血酸与H2O2的组合，上述乳化剂选自阴离子性化合物、阳离子性化合物或非离子性化合物，上述疏水物选自十六碳烷、硅倍半氧烷或疏水性聚合物。
2.权利要求1所述的制备方法，其中，在0-40℃下进行聚合反应。
3.权利要求1所述的制备方法，其中，上述乳化剂是具有聚乙二醇链的聚合性表面活性剂。
4.权利要求1所述的制备方法，其中，上述疏水物是十六碳烷或聚苯乙烯。
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