CN107076741B - 生理活性物质负载用高分子微颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的提供一种新型生理活性物质负载用高分子微颗粒及其制备方法，其可提供一种分析精度及灵敏度高、且能够稳定制备的分析试剂，能够简便且精密地控制负载生理活性物质的官能团的量，且能够向乳胶颗粒表面导入抑制非特异反应的亲水性化合物，且可使粒径分布较窄而均匀地进行制备；所述生理活性物质负载用高分子微颗粒为对单体、自由基聚合引发剂、乳化剂进行聚合而得到的生理活性物质负载用高分子微颗粒，该乳化剂为下述通式(1)所表示的双亲嵌段共聚物。

Description

生理活性物质负载用高分子微颗粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种生理活性物质负载用高分子微颗粒及其制备方法。
此外，本说明书中的“分析”包括以下两者：以定量的或半定量对分析对象物质的量进行确定的“测定”，及判定有无分析对象物质存在的“检测”。
背景技术
如今，在临床诊断检查的现场，对于多数的受检体，要求短时间且高精度地测定成为疾病诊断指标的涉及多方面的物质，并迅速准确地将其结果反馈于治疗现场。例如，使生理活性物质(抗体、酶、接受体等蛋白质，抗原、DNA或RNA等核酸物质、或糖链等)结合在颗粒表面的分析类，例如，通过利用抗原抗体反应的免疫学检测，大量实施微量分析对象物的准确的定量。尤其，作为用于提高检测灵敏度及准确性的方法，公知一种利用颗粒的乳胶凝集法，所述颗粒将针对分析对象物质的抗原或抗体负载于聚苯乙烯等合成高分子(即所谓的乳胶)颗粒的表面。乳胶凝集法是指，对通过分析对象物质与结合在乳胶颗粒上的抗原或抗体的反应所生成的乳胶颗粒的凝集程度进行目视或光学检测，由此在短时间测定分析对象物质的方法。
此外，多使用如下的三明治法(sandwich method)：通过将乳胶颗粒制成磁性颗粒，利用结合于磁性颗粒的第一抗体对分析对象物进行捕捉，在清洗通过磁石集聚的未反应物等后(即所谓的B/F分离)，添加对产生酶或荧光剂等信号的物质进行标记的第二抗体，以此进行分析。
通过抗原抗体反应进行定量的分析对象物质大多为通常在生物体样品中所含有的微量成分，重视低浓度区域中的定量性。然而，由于存在因疾病的蔓延程度而导致的测定对象物质浓度异常地显示出高值的情况，在临床检查的现场中，要求一种具有能够对低值至高值进行准确测定的性能的试剂。
无论是乳胶凝集法还是三明治法，在使用乳胶颗粒时，需要将抗原或抗体固定在乳胶颗粒的表面。作为其方法，使用有物理性负载或化学性负载的方法。例如，使用有如下方法：通过物理性吸附将抗原或抗体在乳胶颗粒上进行直接固定化，或通过经由乳胶颗粒的表面的官能团，例如羧基、马来酰亚胺基、氨基、巯基、羟基、醛基、或环氧基等的共价键，使抗原或抗体结合在乳胶颗粒上。
相较于物理性结合方法，化学性结合方法的优势在于，抗体经由共价键结合于乳胶颗粒表面，因此能够将抗体稳定地负载于表面。对于对乳胶颗粒表面结合官能团的方法有各种报告，但存在难以控制生产批间差异(difference of production lot)与结合的官能团的量、无法制作稳定且精度良好地负载有生理活性物质的颗粒的问题(专利文献1、专利文献2)。
此外，对于乳胶颗粒表面的官能团的量的定量方法有各种报告，然而，在例如进行用于羧基的定量的酸碱滴定，在根据电导率的变化进行定量的手法中，在官能团的量为非常微量的情况下，难以进行准确的定量。由于用于临床诊断的乳胶颗粒为微小颗粒，官能团的量为微量，因此难以进行准确的定量，无法对临床诊断药物的制备进行稳定的供给，而成为问题。
此外，控制为了使乳胶颗粒表面与生物体样品结合的生理活性物质负载用的官能团间的距离，这在考虑对临床诊断药物等生物材料的应用时是重要的。迄今为止，具有以下技术：将具有双键且进一步经由聚乙二醇等亲水性高分子而具有官能团的化合物作为大分子单体(Macro monomer)，与苯乙烯等单体共聚使其结合于乳胶表面。但该技术难以控制所结合的官能团的量、难以得到生产批间差异小的乳胶颗粒，而成为问题。
进一步，作为乳胶凝集法的问题，可列举非特异反应，其为：由于测定对象物质以外的异物吸附于乳胶颗粒表面(非特异吸附)而引起非特异性凝集，将该非特异性凝集作为测定对象物质而进行定量。
通常，作为抑制非特异反应的方法，有预先使牛血清白蛋白(BSA)或糖吸附在乳胶颗粒上的方法，但难以使BSA或糖的吸附量、作为来自生物的蛋白质的BSA的批间差异等为一定，难以提供稳定的基于乳胶凝集法的分析试剂(专利文献3)。
进一步，报告有如下方法：通过先在高分子颗粒的合成时，使针对分析对象物质的抗原及抗体存在，在高分子微颗粒上修饰抗原抗体，抑制通常产生的非特异吸附，但该方法并不充分(专利文献4)。
此外，作为非特异吸附的抑制方法，已知有如下方法：将对非特异反应的抑制有效的聚乙二醇的末端上具有可聚合双键的化合物用作单体，合成高分子微颗粒(专利文献5)，但该方法并不充分。
进一步，开发了一种通过先在聚合时使具有非特异吸附的抑制效果的单体存在，从而抑制非特异吸附的技术，但该技术并不充分(专利文献6)。
在最近，开发出一种抑制非特异反应的方法，其使在聚乙二醇中导入了疏水性单元的封闭剂(Block master)(JSR社)吸附于乳胶颗粒表面。然而，存在以下问题：因免疫学分析试剂的配制工序的繁琐而导致的批间差异的增大、或是难以对封闭剂的修饰量进行定量。
因此，虽然用于临床诊断药物的乳胶颗粒谋求临床诊断药物的制备的稳定性、临床诊断药物的精度的提高，但仍旧未能实现。
现有技术文献
专利文献
特许文献1：日本特开2004-59696号公报
特许文献2：日本特开2004-61301号公报
特许文献3：日本特开2007-145985号公报
特许文献4：WO2008/047799号公报
特许文献5：日本特开2003-231648号公报
特许文献6：日本特开2007-100035号公报
发明内容
本发明要解决的技术问题
为了克服乳胶颗粒的合成所涉及的上述问题，本申请的发明人们进行了仔细研究，其结果发现一种新型生理活性物质负载用高分子微颗粒及其制备方法，其可简便且精密地控制负载生理活性物质的官能团的量，且可向乳胶颗粒表面导入抑制非特异反应的亲水性化合物，且可使粒径分布较窄而均匀地进行制备。
本发明的技术问题在于，提供一种新型生理活性物质负载用高分子微颗粒及其制备方法，其可提供一种分析精度及灵敏度高、且能够稳定制备的分析试剂，能够简便且精密地控制负载生理活性物质的官能团的量，且能够向乳胶颗粒表面导入抑制非特异反应的亲水性化合物，且可使粒径分布较窄而均匀地进行制备。
解决技术问题的技术手段
在以往仅知只能解决一个问题且无法充分解决，且非常繁琐、困难的方法，但出人意料的是，对于上述技术问题，使用单体、自由基聚合引发剂、乳化剂进行细乳液聚合时，将如下述通式(1)所示的、在一分子内具有生理活性物质负载用官能团，且为由亲水性链段及疏水性链段构成的双亲嵌段共聚物作为乳化剂，通过使用所述亲水性链段抑制非特异反应的高分子乳化剂，尤其能够以更简便的方法同时解决三个问题。
本发明涉及以下内容。
[1]一种生理活性物质负载用高分子微颗粒，其由对单体、自由基聚合引发剂、乳化剂进行聚合而得到，其中，该乳化剂为下述通式(1)所表示的双亲嵌段共聚物，
[化学式1]
Figure GDA0002161483210000051
式中，n为5以上的整数，m为5以上的整数，R1及R4各自独立且至少任意一个为生理活性物质负载用官能团，R2-1及R2-2各自独立地为氢原子、甲基、乙基、或丙基，R3为来自亲水性化合物的官能团，R5为赋予疏水性的官能团，R6为卤原子或来自乳化剂合成时的引发剂的官能团。
[2]根据[1]所述的生理活性物质负载用高分子微颗粒，其中，所述R1或R4为选自由羧基、马来酰亚胺基、氨基、巯基、羟基、醛基、及环氧基所构成的组中的基团。
[3]根据[1]或[2]所述的生理活性物质负载用高分子微颗粒，其中，所述R3中的所述亲水性化合物为选自由寡(聚)乙二醇、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱聚合物，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、多肽、单糖类、及多糖类所构成的组中的化合物。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的生理活性物质负载用高分子微颗粒，其中，所述R5为选自由氢原子、卤原子、甲基、乙基、丙基、取代或非取代的芳香族化合物基团、羰基、酰胺基、氨基、醛基及酮基、以及来自胺、醛、酮、及醚的各化合物的官能团所构成的组中的一种或一种以上的官能团。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的生理活性物质负载用高分子微颗粒，其中，所述乳化剂的分子量为1000～100万。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的生理活性物质负载用高分子微颗粒，其中，亲水性链段的分子量为500～50万。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的生理活性物质负载用高分子微颗粒，其中，疏水性链段的分子量为500～50万。
[8]一种生理活性物质负载用高分子微颗粒的制备方法，其特征在于，在使用单体、自由基聚合引发剂、乳化剂进行细乳液聚合时，该乳化剂为下述通式(1)所表示的化合物，
[化学式2]
Figure GDA0002161483210000061
式中，n为5以上的整数，m为5以上的整数，R1及R4各自独立且至少任意一个为生理活性物质负载用官能团，R2-1及R2-2各自独立地为氢原子、甲基、乙基、或丙基，R3为来自亲水性化合物的官能团，R5为赋予疏水性的官能团，R6为卤原子或来自乳化剂合成时的引发剂的官能团。
[9]根据[8]所述的制备方法，其中，所述乳化剂的合成为控制/活性自由基聚合或离子聚合。
[10]根据[8]或[9]所述的制备方法，其中，所述细乳液聚合为转相乳化法。
发明效果
根据本发明，能够提供一种新型生理活性物质负载用高分子微颗粒及其制备方法，其能够简便且精密地控制负载生理活性物质的官能团的量，且能够向乳胶颗粒表面导入抑制非特异反应的亲水性化合物，且可使粒径分布较窄而均匀地进行制备。
附图说明
图1表示乳胶颗粒的粒径分布，横轴为粒径，纵轴为颗粒的比例。
具体实施方式
本发明的生理活性物质负载用高分子微颗粒含有单体、自由基聚合引发剂、乳化剂，该乳化剂具有下述记载的特征。
可在本发明中使用的乳化剂至少具有以下特征：
[1]为由亲水性链段与疏水性链段构成的双亲嵌段共聚物，
[2]在所述亲水性链段末端(R1、R4的任一处以上)上具有生理活性物质负载用官能团。
所述乳化剂与所述单体可通过细乳液聚合反应进行共价键合，也可以不进行共价键合。例如，所述乳化剂在疏水性链段内或末端上具有可进行聚合的双键时，可与高分子微颗粒进行共价键合。另一方面，由于所述乳化剂的疏水性链段与高分子微颗粒进行强力的相互作用，因此，在聚合反应时添加的乳化剂强力地结合于高分子微颗粒上，即使不进行共价键合也可保持稳定状态，聚合反应容易，故而优选。
即，可在本发明中使用的乳化剂以以下的通式(1)所示。
[化学式3]
Figure GDA0002161483210000071
式中，n为5以上的整数，m为5以上的整数，R1及R4至少任意一个为生理活性物质负载用官能团，R2-1及R2-2各自独立地为氢原子、甲基、乙基、或丙基，R3为来自亲水性化合物的官能团，R5为赋予疏水性的官能团，R6为卤原子或来自乳化剂合成时的引发剂的官能团。
可在本发明中使用的乳化剂的主链由烷基链构成。
此外，可在本发明中使用的乳化剂的分子量(数均分子量)为1000以上100万以下，优选为1500以上50万以下，进一步优选为2000以上25万以下，特别优选为3000以上20万以下。
此外，作为可在本发明中使用的乳化剂的分子量分布，多分散度Mw(重均分子量)/Mn(数均分子量)可以是1以上2以下，优选为1.8以下，进一步优选为1.5以下。通过控制/活性自由基聚合或离子聚合，可容易地合成。
可在本发明中使用的乳化剂的亲水性链段整体为亲水性即可。此外，亲水性链段的主链及接枝链(R3-R4)的长度可从公知的长度中进行适当地选择，或任意合成。
作为亲水性链段，分子量为500以上50万以下，优选为1000以上40万以下，进一步优选为2000以上30万以下，特别优选为3000以上25万以下。m为5以上，优选为5以上500以下，进一步优选为10以上300以下。
所述亲水性链段的接枝链含有亲水性化合物部分，作为R3基，具有来自该亲水性化合物的官能团。
作为可在本发明中使用的上述亲水性化合物，例如可列举寡(聚)乙二醇、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)聚合物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、多肽、单糖类、多糖类等。作为可在本发明中使用的乳化剂，只要是可进行合成的亲水性化合物，则可以从公知的物质中适当地选择使用。
R3的分子量优选为20～1万，进一步优选为50～5000。
可在本发明中使用的乳化剂的疏水性链段整体为疏水性即可。
作为疏水性链段，分子量为500以上50万以下，优选为1000以上40万以下，进一步优选为2000以上30万以下，特别优选为3000以上25万以下。n为5以上，优选为5以上500以下，进一步优选为10以上300以下。
通过选择所述疏水性链段的分子量，能够控制本发明的生理活性物质负载用高分子微颗粒的粒径。
作为通式(1)中的R1或R4基团，即作为可在本发明中使用的生理活性物质负载用官能团，可从公知的生理活性物质负载用官能团中适当地选择使用，例如可列举羧基、马来酰亚胺基、氨基、巯基、羟基、醛基、或环氧基等。可根据目的适当地选择种类或数量。通过使用导入有生理活性物质负载用官能团的乳化剂，可容易地控制向一个微颗粒中导入的生理活性物质负载用官能团的量。
该R1或该R4不为生理活性物质负载用官能团时，可从公知的原子或官能团中适当地选择使用，例如可列举氢原子、卤原子、甲基、乙基、或丙基。
R2-1及R2-2基团只要不阻碍乳化剂的双亲性、或生理活性物质负载用官能团的功能，则没有特别限定。例如优选氢原子、甲基、乙基、丙基等。R2-1及R2-2可以相同，也可以不同。可根据各自的化合物或合成方法适当地选择使用。
更进一步，所述疏水性链段的接枝链，作为R5基团，具有赋予疏水性的官能团。作为该赋予疏水性的官能团，例如可列举氢原子、卤原子、甲基、乙基、丙基、取代或非取代的芳香族化合物基团、羰基、酰胺基、氨基、醛基、酮基、或是来自胺、醛、酮、或醚的各化合物的官能团(例如，从上述各化合物中去除了一个或一个以上原子的基团)等。R5可以全为相同的基团，也可以为两个以上不同的基团。
如上所述的疏水性链段的主链及R2-1及R5，例如能够对具有碳碳双键的单体进行聚合而得到。作为所述单体，例如可列举乙烯、丙烯、苯乙烯磺酸、苯乙烯、甲基丙烯酸酯，丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺等，可单独使用其中的一种，或可多种组合使用。
可在本发明中使用的乳化剂的疏水性链段的末端R6可以根据乳化剂的聚合法，从公知物质中适当地选择使用。例如可列举来自在乳化剂聚合中使用的引发基团的官能团或卤原子。此外，还可根据合成高分子微颗粒时的聚合法，从公知物质中适当地选择使用。例如，在合成高分子微颗粒时与单体进行共价键合的情况下，可导入双键。
可在本发明中使用的乳化剂的合成可使用例如控制/活性自由基聚合、离子聚合。作为控制/活性自由基聚合，例如可列举可逆加成-断裂链转移聚合(Reversible AdditionFragmentation Chain Transfer Polymerization)、氮氧调控聚合(Nitroxide MediatedPolymerization)、原子转移自由基聚合(Atom Transfer Radical Polymerization)等。通过使用以控制/活性自由基聚合、离子聚合合成的乳化剂，能够使本发明的生理活性物质负载用高分子微颗粒的粒径分布狭窄而均匀地制备。
这些合成方法，可根据向亲水性链段导入的生理活性物质负载用官能团等，选择适当的方法。
可在本发明中使用的乳化剂的合成可从公知的方法中适当地选择使用，例如从疏水性链段开始合成，然后合成亲水性链段的方法，或是从亲水链段合成，然后合成疏水性链段的方法等。可根据目的来选择适当的方法。
作为可在本发明中使用的自由基聚合引发剂，可使用能够在通常的细乳液聚合中使用的自由基聚合引发剂，例如可列举过氧化引发剂、过硫酸引发剂、偶氮类引发剂、偶氮类低温型引发剂、或氧化还原引发剂。在本发明中，在能够以低于转相乳化温度的低温进行聚合方面来看，优选使用氧化还原引发剂或偶氮类低温型引发剂，但不特别设置设限。
作为所述过氧化引发剂，例如可列举过氧化苯甲酰(BPO)、二叔丁基过氧化物(DBPO)、过氧化铵。作为所述过硫酸引发剂，例如可列举过硫酸钾(KPS)、过硫酸铵(APS)、过硫酸钠(NPS)。
作为所述偶氮类引发剂，例如可列举偶氮二异丁腈(AIBN)、2,2’-偶氮二异丁酸二甲酯(MAIB)、4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)、2,2’-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)。在偶氮类引发剂中，作为可在低温下实施的上述偶氮类低温型引发剂，例如可列举作为水溶性偶氮聚合引发剂的VA-044(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)或作为油溶性偶氮聚合引发剂的V-70(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)等。
作为所述氧化还原引发剂，例如可列举N,N,N’,N’-四甲基乙二胺[N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine(TMEDA)]/过硫酸钾[potassium persulfate(KPS)]、FeSO4/KPS、FeSO4/H2O2、抗坏血酸(维生素C)/H2O2等。
可在本发明中使用的单体可以使用在通常的细乳液聚合中可使用的单体。例如可列举苯乙烯、苯乙烯衍生物(例如，氯甲基苯乙烯、苯乙烯磺酸钠)、二乙苯、丙烯酸或甲基丙烯酸、衣康酸、马来酸酐、马来酸、邻苯二甲酸、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯[例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸十六烷酯]、乙酸乙烯酯。更进一步，这些单体可以混合两种以上使用。
只要是能够制备上述本发明的生理活性物质负载用高分子微颗粒，则本发明的生理活性物质负载用高分子微颗粒的制备方法没有特别限定，除了在聚合反应时使用上述可在本发明中使用的乳化剂以外，也可以与现有公知的细乳液聚合(例如，M.Antonietti,K.Landfester,Prog.Polym.Sci.,2002,27,689-757，J.M.Asua,Prog.Polym.Sci.,2002,27,1283-1346)相同的方式而实施。尤其是，由于不需要使用有强力乳化装置的高剪切力，能够以低能量过程制作微颗粒，因此优选转相乳化法或转相温度乳化法，特别优选使用转相温度乳化法(例如，L.Spernath,S.Magdassi,Polym.Adv.Technol.,2007,18,705-711)。
通常的细乳液聚合不限于此，例如可含有以下工序：混合单体、自由基聚合引发剂、乳化剂的工序；切断所述混合物的工序；以及将所述混合物加热至聚合引发温度使其聚合的工序。在细乳液聚合中，在混合聚合用单体与乳化剂后，例如，通过以超声波照射实施切断工序，通过所述切断力撕碎单体，形成被乳化剂覆盖的单体微小油滴。然后，通过加热至自由基聚合引发剂的聚合引发温度，直接聚合单体微小油滴，得到高分子微颗粒。
在转相温度乳化法中，例如，利用由外部环境(水/油的组成、温度、压力、电解质浓度及化学反应)引起的表面活性剂的曲率的变化，通过使连续相由油相变化为水相，制作O/W型乳浊液，加入引发剂进行聚合，得到高分子微颗粒。
关于高分子微颗粒的聚合时的反应条件，例如溶剂、混合比、温度、反应时间等，可根据使用的单体及生理活性物质负载用官能团的种类、引发剂、乳化剂、合成的高分子微颗粒的平均粒径、负载于微颗粒表面的生理活性物质的量等，通过例如实施中试试验而适当地决定。
除了使用本发明的生理活性物质负载用高分子微颗粒以外，可根据公知的方法制作分析试剂。
本发明所示的分析试剂，是指使可与生物体样品中的分析对象物质进行反应的生理活性物质负载于生理活性物质负载用高分子微颗粒上的、用于分析该分析对象物质的试剂。
此外，生理活性物质与分析对象物质的组合，以及生理活性物质与生理活性物质负载用官能团的反应可从公知的方法中适当地选择使用。
作为可在本发明的实施方式中使用的生理活性物质，为可与生物体样品中的分析对象物质进行反应的物质，例如可列举抗原、抗体、酶、接受体、DNA、RNA、糖链等。
作为可在本发明的实施方式中使用的生物体样品中的分析对象物质，可列举IgG、C反应性蛋白质(CRP)、铁蛋白、β-2微球蛋白、α-甲胎蛋白(AFP)、IgE、B型肝炎病毒(HBS抗体或HBc抗体)、D二聚体、纤维蛋白·纤维蛋白原分解产物(FDP)、可溶性纤维蛋白(Solublefibrin:SF)，纤溶酶·α2-纤溶酶抑制剂复合物(PPI)、前列腺特异抗原(PSA)、弹性蛋白酶1、弹性蛋白酶XDP、血栓调节蛋白、或白蛋白(优选为血清白蛋白)等。
例如，在使用作为所述生理活性物质的抗体时，可使用单克隆抗体或多克隆抗体。此外，作为抗体的种类，除了免疫球蛋白分子本身之外，还可使用抗体片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv等。
例如，在使用作为所述生理活性物质的DNA时，可使用与分析对象物质互补的约5～100碱基的DNA探针。
可在本发明的实施方式中使用的可分析的被检样品，只要是具有含有所述分析对象物质可能性的样品，则没有特别限定，特别可列举生物体样品，例如血液、血清、血浆、尿、髓液、或细胞或组织破碎液等。
可在本发明的实施方式中使用的分析试剂能够以公知的乳胶法(例如，乳胶凝集法、使用有乳胶的B/F分离)进行使用。
在乳胶凝集法中，通过对使所述分析试剂与被检样品在液中接触时产生的凝集程度(凝集度)进行光学分析(特别是测定)，能够分析(特别是测定)被检样品中的分析对象物质的量。在对乳胶颗粒的凝集度进行光学检测的具体的方法中，例如，可使用测定散射光强度、吸光度或透射光强度的光学仪器进行测定。优选的测定波长为300～800nm。测定方法可按照公知的方法，根据选择使用的乳胶颗粒大小(平均粒径)或浓度、或设定反应时间，通过测定散射光强度、吸光度或透射光强度的增加或减少而进行。此外，也可同时使用这些方法。
在使用有乳胶的B/F分离中，使所述分析试剂与被检样品在液中接触后，通过进行B/F分离，分离乳胶颗粒与液体，通过分析(特别是测定)结合于所述乳胶颗粒的分析对象物质或所述液体中残留的分析对象物质，能够分析(特别是测定)被检样品中的分析对象物质的量。
实施例
以下，根据实施例对本发明进行具体说明，但并不限定本发明的范围。
《实施例1：乳化剂(双亲嵌段共聚物)的合成》
在本实施例中，在按照以下所示的反应工序式，合成乳化剂(双亲嵌段聚合物：PSt21-b-POEGMA41-Cl)后，通过盖布瑞尔伯胺(Gabriel)合成，合成ω末端氨基化双亲嵌段共聚物PSt21-b-POEGMA41-NH2。
[化学式4]
Figure GDA0002161483210000141
在氮气气氛下，向10g的苯乙烯(Kanto Chemical Co.,Inc.)与作为引发剂的1g的溴代异丁酸羟乙醇酯(HEBiB)(2-hydroxyethyl-2-bromoisobutyrate)中加入2g的2,2’-联吡啶(bipyridine；bpy)与0.6g的CuBr，在110℃下进行聚合。此外，使用通过2-溴异丁酰溴(BiB)(2-bromoisobutyryl bromide)与乙二醇合成的HEBiB。聚合完成后，使用四氢呋喃(THF)进行稀释，通过在甲醇中进行再沉淀，从而得到PSt21-Br。
将7.0g的寡聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯(OEGMA)(oligo(ethylene glycol)methyl ether methacrylate(聚合度：9)：SHIN-NAKAMURACHEMICAL CO.LTD.)与0.14g的三(2-N,N-二甲基氨基)乙基)胺(Me6TREN)(tris(2-N,N-dimethylamino)ethyl)amine：千叶大学)、0.03g的CuCl在12mL的甲苯(Kanto Chemical Co.,Inc.)中混合，与0.66g的PSt21-Br在80℃下进行24小时聚合。
聚合完成后，在THF中使其溶解，通过氧化铝柱，除去铜络合物。然后，在己烷中进行再沉淀，使其溶解于甲苯，在甲苯/甲醇为1:1的溶剂中实施透析，用蒸发器浓缩得到的溶液，由此得到双亲嵌段聚合物PSt21-b-POEGMA41-Cl。
在0.80g的PSt21-b-POEGMA41-Cl中，加入0.07g的酞酰亚胺钾(KPHI)(Potassiumphthalimide)与5mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，在50℃下搅拌16小时。然后，加入15mL的甲苯除去未反应的KPHI。进一步，在甲苯/甲醇为1:1的溶剂中进行透析。使用蒸发器浓缩得到的溶液。
向其加入0.02g的H2N-NH2·H2O及6mL的DMF，在50℃下搅拌16小时。然后，加入甲苯，在甲苯/甲醇为1:1的溶剂中进行透析。使用蒸发器浓缩得到的溶液，得到在ω末端具有氨基的双亲嵌段共聚物PSt21-b-POEGMA41-NH2。
《实施例2：使用有乳化剂的乳胶颗粒的合成》
将实施例1中得到的0.05g的PSt21-b-POEGMA41-NH2溶解于0.1g的苯乙烯中，进一步，加入1.2g超纯水。将该混合物升温至90℃，搅拌10分钟，得到W/O型乳浊液。
然后，通过冰浴的同时进行搅拌，进行转相乳化操作，得到O/W型乳浊液。加入0.03g的水溶性引发剂(VA-044：Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)，在40℃下进行6小时聚合。
使用动态光散射装置(DLS:ELSZ-1000ZSCK light scattering apparatusOtsuka)对得到的乳胶颗粒的粒径进行测定，为52±20nm。
《实施例3：乳化剂的疏水性链段的链长对粒径产生的影响》
按照实施例1，合成在疏水性链段上具有聚苯乙烯的13、21、46、95的重复单元(相当于通式(1)的n)及在亲水性链段的主链具有42、41、45、36的重复单元(相当于通式(1)的m)的表1所示的双亲嵌段聚合物。此外，接枝部使用OEGMA(聚合度：9)。通过使单体(苯乙烯)/引发剂(HEBiB)的摩尔比(M/I比)为表1所示的值，实施疏水性链段的重复单元的控制。通过使单体(OEGMA)/引发剂(PSt-Br)的摩尔比统一为50，实施亲水性链段的重复单元的控制。
然后，按照实施例2，合成表1所述的组合的乳胶颗粒，即合成PSt13与OEGMA42的组合的乳胶颗粒、PSt21与OEGMA41的组合的乳胶颗粒、PSt46与OEGMA45的组合的乳胶颗粒、PSt95与OEGMA36的组合的乳胶颗粒。
用动态光散射装置(DLS)测定粒径。图1表示乳胶颗粒的粒径分布，粒径表示于表1。图1中表示的4个峰左起分别为PSt13-b-POEGMA42-Cl、PSt21-b-POEGMA41-Cl、PSt46-b-POEGMA45-Cl、PSt95-b-POEGMA36-Cl的结果。可知能够合成平均粒径为32nm～120nm的乳胶颗粒，Mw/Mn约为1.4，能够使粒径分布较窄地进行合成。此外，可知乳胶颗粒的粒径随疏水性链段的链长而增大。Mn表示数均分子量，Mw表示重均分子量，Mw/Mn表示多分散度。
[表1]
样本 M/I比 Mw/Mn 粒径(nm)
PSt<sub>13</sub>-b-POEGMA<sub>42</sub>-Cl 10 1.48 32±11
PSt<sub>21</sub>-b-POEGMA<sub>41</sub>-Cl 20 1.45 52±19
PSt<sub>46</sub>-b-POEGMA<sub>45</sub>-Cl 50 1.37 83±36
PSt<sub>95</sub>-b-POEGMA<sub>36</sub>-Cl 100 1.43 120±54
《实施例4：向乳胶颗粒导入HRP》
按照实施例1，对引发剂(PSt20-Br)添加24等量的单体(OEGMA)，制作PSt20-b-POEGMA24-NH2。然后，以与实施例2相同的方式合成乳胶颗粒(粒径＝22±6nm)。将0.5mg该乳胶颗粒分散于磷酸钠缓冲液(pH＝7.00)中。
然后以颗粒数的10倍量加入具有醛基的活性化辣根过氧化物酶(activatedhorseradish peroxidase(HRP：EZ-Link Plus Activated Peroxidase(Thermoscientific社制造)))。将其在室温静置1小时后，加入过量的硼氢化钠水溶液。在5℃下静置1小时后，通过中空纤维过滤器(20mmol/L磷酸钠缓冲液，0.1％Tween20)进行提纯，得到HRP固定化高分子微颗粒。
在100μL所得到的高分子微颗粒分散液(8×108粒子/mL)中加入200μL四甲基联苯胺(TMB)。30分钟后，通过加入200μL的200mmol/L硫酸水溶液，使反应停止。溶液的450nm的吸光度上升OD＝0.8)。由此，可确认到HRP被化学性导入于乳胶颗粒表面。
以上，按照特定的形态对本发明进行了说明，对于本领域技术人员显而易见的变形或改良也包含在本发明的范围。

Claims (7)

1.一种生理活性物质负载用高分子微颗粒，其由对单体、自由基聚合引发剂、乳化剂进行细乳液聚合而得到，其中，该乳化剂为下述通式(1)所表示的双亲嵌段共聚物，
[化学式1]
Figure FDA0002605244350000011
式中，n为5以上的整数，m为5以上的整数，R1及R4各自独立且至少任意一个为生理活性物质负载用官能团，其中，所述生理活性物质负载用官能团为选自由羧基、马来酰亚胺基、氨基、巯基、羟基、醛基、及环氧基所构成的组中的基团，当R1或R4不为生理活性物质负载用官能团时，其为氢原子、卤原子、甲基、乙基、或丙基，R2-1及R2-2各自独立地为氢原子、甲基、乙基、或丙基，R3为来自亲水性化合物的官能团，R5为赋予疏水性的官能团，R6为卤原子或来自乳化剂合成时的引发剂的官能团，其中，所述R3中的所述亲水性化合物为选自由寡(聚)乙二醇、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱聚合物，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、多肽、单糖类、及多糖类所构成的组中的化合物，所述R5为选自由氢原子、卤原子、甲基、乙基、丙基、取代或非取代的芳香族化合物基团、羰基、酰胺基、氨基、醛基及酮基、以及来自胺、醛、酮、及醚的各化合物的官能团所构成的组中的一种以上的官能团。
2.根据权利要求1所述的生理活性物质负载用高分子微颗粒，其中，所述乳化剂的分子量为1000～100万。
3.根据权利要求1～2中任一项所述的生理活性物质负载用高分子微颗粒，其中，亲水性链段的分子量为500～50万。
4.根据权利要求1所述的生理活性物质负载用高分子微颗粒，其中，疏水性链段的分子量为500～50万。
5.一种生理活性物质负载用高分子微颗粒的制备方法，其特征在于，在使用单体、自由基聚合引发剂、乳化剂进行细乳液聚合时，该乳化剂为下述通式(1)所表示的化合物，
[化学式2]
Figure FDA0002605244350000021
式中，n为5以上的整数，m为5以上的整数，R1及R4各自独立且至少任意一个为生理活性物质负载用官能团，其中，所述生理活性物质负载用官能团为选自由羧基、马来酰亚胺基、氨基、巯基、羟基、醛基、及环氧基所构成的组中的基团，当R1或R4不为生理活性物质负载用官能团时，其为氢原子、卤原子、甲基、乙基、或丙基，R2-1及R2-2各自独立地为氢原子、甲基、乙基、或丙基，R3为来自亲水性化合物的官能团，R5为赋予疏水性的官能团，R6为卤原子或来自乳化剂合成时的引发剂的官能团，其中，所述R3中的所述亲水性化合物为选自由寡(聚)乙二醇、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱聚合物，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、多肽、单糖类、及多糖类所构成的组中的化合物，所述R5为选自由氢原子、卤原子、甲基、乙基、丙基、取代或非取代的芳香族化合物基团、羰基、酰胺基、氨基、醛基及酮基、以及来自胺、醛、酮、及醚的各化合物的官能团所构成的组中的一种以上的官能团。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述乳化剂的合成为控制/活性自由基聚合或离子聚合。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其中，所述细乳液聚合为转相乳化法。
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