KR101690803B1

KR101690803B1 - 항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체, 항인지질 항체 측정 시약, 및 항인지질 항체의 측정 방법

Info

Publication number: KR101690803B1
Application number: KR1020117008604A
Authority: KR
Inventors: 다카유키 아카미네; 신이치로 기타하라; 데츠야 오타; 다카유키 아베
Original assignee: 세키스이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2008-11-12
Filing date: 2009-11-12
Publication date: 2016-12-28
Also published as: CA2741801C; CA2741801A1; JP5348724B2; US20110263048A1; CN102203612B; WO2010055883A1; HK1160680A1; EP2352029A1; CN102203612A; JP2010249846A; JPWO2010055883A1; KR20110093763A; JP4646270B2; EP2352029A4; US20140295576A1

Abstract

본 발명은 반응성이 높은 항인지질 항체 측정 시약에 사용되는 불용성 담체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 항인지질 항체 측정 시약, 및 항인지질 항체의 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체로서, 20 mmol/ℓ 의 인산나트륨 수용액 (pH 7.4) 에 있어서 고형분 농도가 0.1 ％ 가 되도록 현탁한 경우의 제타 전위가 -45 ㎷ 미만인 항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체이다.

Description

항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체, 항인지질 항체 측정 시약, 및 항인지질 항체의 측정 방법{INSOLUBLE CARRIER FOR USE IN ANTI-PHOSPHOLIPID ANTIBODY MEASUREMENT REAGENT, ANTI-PHOSPHOLIPID ANTIBODY MEASUREMENT REAGENT, AND METHOD FOR MEASURING ANTI-PHOSPHOLIPID ANTIBODY}

본 발명은 반응성이 높은 항인지질 항체 측정 시약에 사용되는 불용성 담체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항인지질 항체 측정 시약, 및 항인지질 항체의 측정 방법에 관한 것이다.

혈액, 소변 등에 함유되는 미량 물질의 측정 방법으로서 면역학적 측정 방법이 채용되고 있다. 면역학적 측정 방법은 항원 항체 반응의 특이적인 강한 결합에 기초하여, 여러가지 물질이 혼재하는 시료로부터도, 목적 물질을 특이적으로 양호한 감도로 측정할 수 있다.

그러나, 최근 혈액 중의 암마커, 바이러스 등의 항원, 세균이나 바이러스에 대한 항체 등의 극미량 성분을 측정하는 요구가 높아져 오고 있어, 면역학적 측정 방법의 추가적인 고감도화가 강하게 요구되고 있다.

면역학적 측정 방법의 고감도화를 실현하는 시도로는, 예를 들어 일정 조건하에서 면역학적 측정 방법에 사용하는 불용성 담체의 제타 전위를 측정하고, -20 ㎷ 이상 0 ㎷ 미만의 범위에 있는 담체를 선택하여 항원 또는 항체를 효율적으로 대량으로 물리 흡착시키는 방법 (특허문헌 1) 이나, 면역학적 측정 방법에 사용하는 라텍스 입자 표면의 술폰산기량을 0.005 ∼ 0.7 μmol/㎡ 의 범위로 컨트롤된 담체를 사용하는 방법 (특허문헌 2) 등이 제안되어 있다.

일본 공개특허공보 평7-270423호 국제 공개 제03/005031호 팜플렛

본 발명은 반응성이 높은 항인지질 항체 측정 시약에 사용되는 불용성 담체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 항인지질 항체 측정 시약, 및 항인지질 항체의 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 통상적인 단백질로 이루어지는 항원이나 항체를 불용성 담체에 흡착시키는 경우와 달리, 제타 전위가 -20 ㎷ 이상 0 ㎷ 미만의 범위에 있는 불용성 담체에 인지질을 불용성 담체에 흡착시키는 방법에서는, 항인지질 항체를 충분히 고감도로 측정할 수 없다는 문제가 있는 것을 알아내었다.

본 발명자들은 예의 검토한 결과, 친수성 부분이 적은 인지질을 불용성 담체에 흡착시키는 경우, 동일한 입자직경이고 제타 전위가 상이한 불용성 담체를 비교하면, 제타 전위가 낮은 불용성 담체를 사용한 편이, 보다 반응성이 높은, 즉 고감도의 항인지질 항체 측정 시약이 얻어지는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

구체적으로는, 본 발명은 항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체로서, 20 mmol/ℓ 의 인산나트륨 수용액 (pH 7.4) 에 있어서 고형분 농도가 0.1 ％ 가 되도록 현탁한 경우의 제타 전위가 -45 ㎷ 미만인 항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체이다.

또한, 본 발명은 상기 불용성 담체를 사용한 항인지질 항체 측정 시약, 및 상기 불용성 담체를 사용한 항인지질 항체의 측정 방법이다.

제타 전위가 낮은 불용성 담체를 사용함으로써 반응성이 높은 항인지질 항체 측정 시약이 얻어지는 이유에 대해서는 분명하지 않다. 일반적으로 제타 전위가 0 에 가까워질수록, 불용성 담체의 반발성이 저하되어 응집되기 쉬워지기 때문에, 제타 전위가 0 에 가까운 불용성 담체일수록 반응성이 높다고 말해지고 있다. 그러나, 완전히 전위가 없어지는, 즉 0 이 되면, 자기 응집이 일어나기 때문에, 어느 정도의 전위는 필요하다. 또한, 불용성 담체에 흡착시키는 항원 (또는 항체) 과 반응하는 항체 (또는 항원) 사이의 거리가 지나치게 가까워도, 항원 항체 반응이 잘 일어나지 않기 때문에, 어느 정도의 거리를 유지한 편이 안정적인 반응이 일어난다고 생각된다.

불용성 담체에 단백질 유래의 항원 또는 항체를 흡착시키는 경우에는, 단백질 중의 친수성 아미노산 유래의 전위가 불용성 담체 표면의 전위에 추가되기 때문에, 제타 전위가 0 에 가까운 불용성 담체를 사용해도, 단백질 유래의 항원 또는 항체를 흡착시킨 후에는, 어느 정도의 전위는 존재한다고 생각된다. 그러나, 인지질을 불용성 담체에 흡착시키는 경우에는, 인지질 자체에 친수성 부분이 적기 때문에, 전위가 거의 없고, 제타 전위가 0 에 가까운 불용성 담체를 사용하면, 안정적인 반응이 얻어지지 않는다고 생각된다. 또한, 제타 전위의 절대값이 커지기 때문에, 담지되는 인지질 분자의 방향이 항인지질 항체와의 반응에 적합한 방향으로 되어 있을 가능성도 생각된다.

이하에 본 발명을 상세히 서술한다.

본 발명의 항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체는 20 mmol/ℓ 의 인산나트륨 수용액 (pH 7.4) 에 있어서 고형분 농도가 0.1 ％ 가 되도록 현탁한 경우의 제타 전위가 -45 ㎷ 미만인 불용성 담체이다. 상기 제타 전위가 -45 ㎷ 미만임으로써, 본 발명의 항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체를 사용하여 이루어지는 항인지질 항체 측정 시약은 높은 반응성을 갖는다. 상기 제타 전위의 하한은 특별히 한정되지 않지만, 실질적으로는 -100 ㎷ 정도가 하한이다. 상기 제타 전위는 -74 ㎷ 이하인 것이 바람직하다.

본 발명의 항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 유기 고분자 분말, 미생물, 혈구, 세포막편 등을 들 수 있다. 그 중에서도 유기 고분자 분말이 바람직하다.

상기 유기 고분자 분말은 천연 고분자 분말, 합성 고분자 분말을 들 수 있다.

상기 천연 고분자 분말은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 불용성 아가로오스, 셀룰로오스, 불용성 덱스트란 등을 들 수 있다.

상기 합성 고분자 분말은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 폴리스티렌, 스티렌-술폰산(염) 공중합체, 스티렌-(메트)아크릴산 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 염화비닐-(메트)아크릴산에스테르 공중합체, 아세트산비닐-(메트)아크릴산에스테르 공중합체 등을 들 수 있다.

본 발명의 항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체는 표면에 술폰산기나 카르복실기 등을 도입한 불용성 담체이어도 된다.

그 중에서도, 합성 고분자 미립자가 수(水) 매체 중에 균일하게 분산된 라텍스 입자인 것이 바람직하다.

상기 라텍스 입자는 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산기를 갖는 중합성 단량체의 공중합체로 이루어진다. 상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 스티렌, 디비닐벤젠, 에틸스티렌, α-메틸스티렌, p-메틸스티렌, p-클로로스티렌, 클로로메틸스티렌 등을 들 수 있다. 이들 페닐기를 갖는 중합성 단량체는 단독으로 사용되어도 되고, 2 종 이상이 병용되어도 된다. 그 중에서도, 스티렌이 바람직하다.

상기 페닐기 및 술폰산기를 갖는 중합성 단량체는 중합 후의 담체 입자 표면에 술폰산기를 함유시킬 수 있는 단량체이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 스티렌술폰산염, 디비닐벤젠술폰산염, 에틸스티렌술폰산염, α-메틸술폰산염 등을 들 수 있다. 또한, 이 경우의 염은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 암모늄염 등을 들 수 있다. 이들 페닐기 및 술폰산기를 갖는 중합성 단량체는 단독으로 사용되어도 되고, 2 종 이상이 병용되어도 된다. 그 중에서도, 스티렌술폰산염이 바람직하고, 스티렌술폰산나트륨이 보다 바람직하다.

상기 라텍스 입자는 상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체와 상기 페닐기 및 술폰산기를 갖는 중합성 단량체를 공중합시킴으로써 얻어진다.

상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체와 상기 페닐기 및 술폰산기를 갖는 중합성 단량체를 공중합시키는 방법으로는 종래 공지된 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어 용매로서 물이 주입된 반응 용기 내에 상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체, 상기 페닐기와 술폰산기를 갖는 중합성 단량체, 중합 개시제, 및 필요에 따라 유화제를 첨가하여, 질소 분위기하에서 교반하는 방법 등을 들 수 있다.

상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체와 상기 페닐기 및 술폰산기를 갖는 중합성 단량체를 공중합시킬 때의 중합 온도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 50 ℃, 바람직한 상한은 100 ℃ 이다. 상기 중합 온도가 50 ℃ 미만이면, 중합 반응이 충분히 진행되지 않는 경우가 있다. 상기 중합 온도가 100 ℃ 를 초과하면, 중합 속도가 지나치게 빨라져, 입자직경을 제어하는 것이 곤란해지는 경우가 있다. 상기 중합 온도의 보다 바람직한 하한은 60 ℃, 보다 바람직한 상한은 85 ℃ 이다. 또한, 중합 시간은 중합성 단량체의 조성, 농도, 및 중합 개시제 등의 조건에 따라 다르기도 하지만, 통상 5 ∼ 50 시간이다.

상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체에 대한 상기 페닐기와 술폰산기를 갖는 중합성 단량체의 배합량은 공중합에 의해 얻어지는 입자 표면의 술폰산기량, 및 입자직경을 고려하여 설정할 필요가 있다. 본 발명의 항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체에는, 통상적인 단백질 유래의 항원 또는 항체를 흡착시키는 것이 아니라, 전하가 적은 인지질을 흡착시킨다. 그 때문에, 술폰산기량이 적으면, 인지질을 흡착시킨 후의 입자끼리의 전하의 반발이 약하여, 자연 응집될 우려가 있고, 안정적인 시약이 얻어지지 않는다. 따라서, 라텍스 입자 표면의 술폰산기량은 0.1 μmol/㎡ 이상인 것이 바람직하다. 따라서, 페닐기를 갖는 중합성 단량체에 대한 상기 페닐기와 술폰산기를 갖는 중합성 단량체의 배합량은, 공중합 후의 입자 표면의 술폰산기량이 0.1 ∼ 0.7 μmol/㎡ 가 되도록, 0.02 ∼ 0.2 중량％ 로 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 라텍스 입자 표면의 술폰산기량은 전기 전도도 적정법 (Journal of Colloid and Interface Sciences. 49(3) 425, 1974) 에 의해 구할 수 있고, 이 값을, 얻어진 입자직경으로부터 산출되는 입자의 총 표면적으로 나눔으로써, 단위면적당 술폰산기량을 산출할 수 있다.

상기 중합 개시제는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 과황산염류 등을 들 수 있다.

상기 과황산염류는 특별히 한정되지 않지만, 과황산칼륨, 과황산나트륨, 과황산암모늄 등이 바람직하다.

상기 중합 개시제의 배합량은 특별히 한정되지 않지만, 통상은 중합성 단량체량에 대하여 0.01 ∼ 1 중량％ 의 범위이다.

상기 유화제는 상기 라텍스 입자에 유화제가 함유되면 측정 정밀도를 저해시키는 등의 문제가 있기 때문에, 통상은 사용하지 않는 것이 바람직하지만, 상기 라텍스 입자 표면의 술폰산기량의 조정에 필요한 경우 등, 필요에 따라 사용할 수 있다.

상기 유화제의 배합량은 특별히 한정되지 않지만, 중합 후의 후처리 공정에 의해 제거하는 것을 고려하면, 페닐기를 갖는 중합성 단량체에 대하여, 바람직한 상한은 1 중량％, 보다 바람직한 상한은 0.5 중량％, 더욱 바람직한 상한은 0.02 중량％ 이다. 상기 유화제의 배합량의 바람직한 하한은 0.01 중량％ 이다.

또한, 상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체와 상기 페닐기 및 술폰산기를 갖는 중합성 단량체를 공중합시킬 때에, 추가로 중합성 불포화 단량체를 첨가해도 된다. 상기 중합성 불포화 단량체는 통상적인 라디칼 중합에 사용할 수 있으면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 (메트)아크릴산, (메트)아크릴산에스테르, 스티렌 유도체, (메트)아크릴로니트릴, (메트)아크릴산아미드, 할로겐화비닐, 비닐에스테르, (메트)아크롤레인, 말레산 유도체, 푸마르산 유도체 등을 들 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 (메트)아크릴산이란, 아크릴산 또는 메타크릴산을 의미한다.

또한, 상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체와 상기 페닐기 및 술폰산기를 갖는 중합성 단량체를 공중합시킬 때에, 중합 안정성을 향상시키기 위하여, 필요에 따라 여러 가지의 염류를 첨가해도 된다. 상기 염류는 통상적인 라디칼 중합에 사용할 수 있으면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 황산마그네슘, 황산칼슘, 황산2나트륨, 황산2칼륨, 인산2수소나트륨, 인산수소2나트륨, 인산2수소칼륨, 인산수소2칼륨, 염화나트륨, 염화칼륨 등을 들 수 있다.

측정에 사용하는 라텍스 입자의 평균 입자직경은 측정 방법이나, 사용하는 측정 기기에 따라 적절히 선택하면 되는데, 일반적으로 바람직한 하한은 0.01 ㎛, 바람직한 상한은 1.5 ㎛ 이다. 상기 라텍스 입자의 평균 입자직경이 0.01 ㎛ 미만이면, 응집에 의한 광학적 변화량이 지나치게 작아 측정에 필요한 감도가 얻어지지 않고, 또한 시약 조제시의 원심분리시에 많은 시간이 걸려 시약 비용이 높아지는 경우가 있다. 상기 라텍스 입자의 평균 입자직경이 1.5 ㎛ 를 초과하면, 피측정물질이 고농도일 때 라텍스 입자의 응집에 의한 광학적 변화량이 측정 가능 영역을 초과해 버려, 피측정물질의 양에 따른 광학적 변화량이 얻어지지 않는 경우가 있다. 범용의 자동 분석 장치를 사용한 경우의 항인지질 항체 측정의 감도를 고려하면, 본 발명에 사용하는 라텍스 입자의 평균 입자직경의 바람직한 하한은 0.2 ㎛, 바람직한 상한은 0.5 ㎛ 이고, 보다 바람직한 하한은 0.3 ㎛, 보다 바람직한 상한은 0.4 ㎛ 이다. 또한, 이 평균 입자직경은 투과형 전자 현미경 장치를 사용한 화상 해석에 의해 구할 수 있다.

상기 라텍스 입자의 입자직경의 변동 계수 (이하, CV 값 (％) 이라고도 한다) 는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 상한은 10 ％ 이다. 상기 라텍스 입자의 입자직경의 CV 값 (％) 이 10 ％ 를 초과하면, 시약 조제시의 로트 재현성이 나쁘고, 측정 시약의 재현성이 저하되는 경우가 있다. 상기 라텍스 입자의 입자직경의 CV 값 (％) 의 보다 바람직한 상한은 5 ％ 이고, 더욱 바람직한 상한은 3 ％ 이다.

또한, 상기 입자직경의 CV 값 (％) 은 하기 식에 의해 산출할 수 있다.

입자직경의 CV 값 (％) ＝ 입자직경의 표준 편차/평균 입자직경×100

상기 라텍스 입자는 1 종류의 입자뿐만 아니라, 20 mmol/ℓ 의 인산나트륨 수용액 (pH 7.4) 에 있어서 고형분 농도가 0.1 ％ 가 되도록 현탁한 경우의 제타 전위가 -45 ㎷ 미만이면, 제타 전위가 상이한 2 종류 이상의 라텍스 입자를 사용해도 된다. 2 종류 이상의 라텍스 입자를 사용함으로써, 저농도부터 고농도까지의 넓은 농도 범위에 걸쳐 고감도 또한 고정밀도로 항원 항체 반응을 측정할 수 있고, 특히 분광 광도계, 탁도계, 광 산란 측정 장치 등의 광학적 측정 장치용으로서 바람직한 측정 시약을 얻을 수 있다.

항인지질 항체 측정에 사용하는 항인지질 항체 측정 시약으로서, 인지질 항원을 담지한 불용성 담체와 완충액을 함유하고, 상기 인지질 항원을 담지하기 전의 불용성 담체는, 20 mmol/ℓ 의 인산나트륨 수용액 (pH 7.4) 에 있어서 고형분 농도가 0.1 ％ 가 되도록 현탁한 경우의 제타 전위가 -45 ㎷ 미만인 항인지질 항체 측정 시약도 또한, 본 발명의 하나이다.

본 발명의 항인지질 항체 측정 시약은 인지질 항원을 담지한 불용성 담체를 함유한다.

상기 인지질 항원은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 카르디올리핀, 포스파티딜콜린, 및 콜레스테롤로 이루어지는 인지질 항원이 바람직하다.

상기 카르디올리핀은 소의 심장으로부터 정제한 것을 사용하는 것이 바람직하지만, 화학적으로 합성되어 있어도 된다.

상기 포스파티딜콜린은 닭의 난황으로부터 정제된 것을 사용하는 것이 바람직하지만, 포스파티딜콜린의 함유량이 60 ∼ 80 ％ 인 레시틴을 사용해도 된다. 또한, 소 심장이나 대두 등으로부터 추출된 것이나, 화학적으로 합성된 것이어도 된다.

상기 콜레스테롤은 동물 유래이어도 되고, 화학적으로 합성되어 있어도 된다.

상기 카르디올리핀, 포스파티딜콜린, 및 콜레스테롤의 혼합비는 특별히 한정되지 않지만, 카르디올리핀 1 ㎎ 에 대하여, 포스파티딜콜린 8 ∼ 12 ㎎, 콜레스테롤 1 ∼ 5 ㎎ 인 것이 바람직하다.

상기 불용성 담체에 상기 인지질 항원을 담지하는 방법으로는 특별히 한정되지 않고, 종래 공지된 방법에 의해, 물리적 및/또는 화학적 결합에 의해 담지시키는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명의 항인지질 항체 측정 시약은 완충액을 함유한다.

상기 완충액은 상기 인지질 항원을 담지한 라텍스 입자를 분산 또는 현탁 시키는 역할을 갖는다.

상기 완충액은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 인산 완충액, 글리신 완충액, 트리스염 완충액, 굿 완충액 등을 들 수 있다.

상기 완충액의 pH 는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 5.5, 바람직한 상한은 8.5 이고, 보다 바람직한 하한은 6.5 이다.

본 발명의 항인지질 항체 측정 시약은 측정 감도의 향상 및 항원 항체 반응의 촉진을 목적으로 하여, 수용성 고분자를 함유해도 된다.

상기 수용성 고분자는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 풀루란, 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다.

인지질 항원을 담지한 불용성 담체와 완충액을 함유하는 항인지질 항체 측정 시약과 검체를 혼합하여 항원 항체 반응에 의해 응집을 발생시키는 공정과, 상기 응집의 정도를 광학적으로 측정 또는 육안으로 관찰함으로써 검체 중의 지질 항체를 측정하는 공정을 갖는 항인지질 항체 측정 시약을 사용하는 항인지질 항체의 측정 방법으로서, 상기 인지질 항원을 담지시키기 전의 불용성 담체는, 20 mmol/ℓ 의 인산나트륨 수용액 (pH 7.4) 에 있어서 고형분 농도가 0.1 ％ 가 되도록 현탁한 경우의 제타 전위가 -45 ㎷ 미만인 항인지질 항체의 측정 방법도 또한, 본 발명의 하나이다.

상기 응집의 정도를 광학적으로 측정하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 종래 공지된 방법이 사용되며, 예를 들어 사용하는 불용성 담체의 입자의 크기, 농도의 선택, 반응 시간의 설정에 의해, 산란광 강도, 흡광도, 투과광 강도의 증감을 측정하는 방법을 들 수 있다. 또한, 이들 방법을 병용할 수도 있다.

또한, 상기 측정을 실시할 때의 광의 파장은 300 ∼ 900 ㎚ 가 바람직하다.

상기 흡광도의 증감을 측정하는 방법을 사용하는 경우, 정확한 측정을 실시하기 위해서는, 표준 혈청 중의 최고 농도인 8.0 R.U. (매독 양성 항체값의 단위, 1.0 R.U. 이상으로 매독 양성이라고 진단한다) 에 있어서의 흡광도 변화량이 적어도 250 mAbs 가 되는 반응성이 필요하다. 8.0 R.U. 의 흡광도 변화량이 250 mAbs 인 경우, 항인지질 항체 측정 시약이 음성인지 양성인지를 판정하는 경계가 되는 1.0 R.U. 의 흡광도 변화량은 약 30 mAbs 가 된다. 1.0 R.U. 의 흡광도 변화량이 30 mAbs 이하가 된 경우, 데이터의 재현성이 현저하게 저하되어, 음성인지 양성인지의 판정을 정확하게 실시할 수 없다.

상기 응집의 정도를 광학적으로 측정하는 방법에 사용하는 장치는 특별히 한정되지 않고, 산란광 강도, 투과광 강도, 흡광도 등을 검출할 수 있는 광학 기기를 들 수 있고, 일반적으로 사용되고 있는 생화학 자동 분석기이면 어느 것이든 사용할 수 있다.

상기 응집의 정도를 육안으로 관찰하는 방법은, 통상, 검체와 본 발명의 항인지질 항체 측정 시약을 판정판 상에서 혼합하고, 혼합액을 요동시킨 후, 응집의 유무를 판정하는 방법 등을 사용할 수 있다.

또한, 응집의 정도 관찰에는, 육안에 의한 방법 이외에, 응집 상태를 비디오 카메라 등으로 촬영하여, 화상 처리를 실시하는 방법을 사용할 수도 있다.

본 발명에 의하면, 반응성이 높은 항인지질 항체 측정 시약에 사용되는 불용성 담체를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 항인지질 항체 측정 시약, 및 항인지질 항체의 측정 방법을 제공할 수 있다.

도 1 은 실시예 1, 실시예 4, 및 비교예 1 에 있어서의 RPR 표준 혈청 8.0 R.U. 를 사용한 경우의 흡광도 변화량의 추이를 나타내는 그래프이다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에만 한정되지 않는다.

(1) 라텍스 LotA

(라텍스 입자의 제작)

교반기, 환류용 냉각기, 온도 검출기, 질소 도입관 및 재킷을 구비한 유리제 반응 용기 (용량 2 ℓ) 에, 증류수 1100 g, 스티렌 180 g, 스티렌술폰산나트륨 0.04 g, 및 증류수 26 g 에 과황산칼륨 0.8 g 을 용해시킨 수용액을 주입하고, 용기 내를 질소 가스로 치환한 후, 70 ℃ 에서 교반하면서 48 시간 중합하였다.

중합 종료 후, 상기 용액을 여과지로 여과 처리하여, 라텍스 입자를 취출하였다. 얻어진 라텍스 입자의 입자직경, 표면의 술폰산기량 및 제타 전위를 하기의 방법에 의해 측정하였다.

(라텍스 입자의 평균 입자직경)

투과형 전자 현미경 장치 (니혼 덴시사 제조, 「JEM-1010 형」) 를 사용하여 10000 배의 배율로 라텍스 입자를 촬영하고, 최저 100 개 이상의 입자에 대하여 화상 해석함으로써 입자직경을 측정하였다. 얻어진 평균 입자직경은 0.4 ㎛ 였다.

(라텍스 입자 표면의 술폰산기량)

라텍스 입자를 셀로판 튜브 투석막에서 48 시간, 정제수로 투석하여 잔존 단량체를 제거하였다. 이 입자를 건조 중량으로 10 g 이 되도록 4 구 유리 용기에 채취 후, 증류수로 150 ㎖ 가 되도록 희석하고 스터러 칩을 사용하여 교반하였다. 이것을 용액 A 로 하였다.

다음으로, 전위차 전기 전도도 적정 처리 장치 (쿄토 전자 공업사 제조, 「AT-310」) 의 부속 장치 ATB-310 전동 뷰렛에, 0.01 N 수산화나트륨 (와코 순약 공업사 제조) 을 세트하고, 또한 도전율 전극을 용액 A 에 담가, 질소 도입관, 탈기관 및 pH 전극을 설정하였다. 그리고, 0.01 N 수산화나트륨을 적하 (0.05 ㎖ 를 150 초 ∼ 500 초의 범위에서 측정하는 술폰산기량에 의해 조정) 하고, 전위차 전기 전도도 적정 처리 장치 (쿄토 전자 공업사 제조, 「AT-310」) 를 사용한 전도도의 변화량으로부터 당량점을 측정하여, 목적으로 하는 술폰산기량을 산출하였다. 얻어진 술폰산기량은 0.28 μmol/㎡ 였다.

(라텍스 입자의 제타 전위)

라텍스 입자를 20 mmol/ℓ 의 인산나트륨 수용액 (pH 7.4) 에 있어서 고형분 농도가 0.1 ％ 가 되도록 조정하고, 이것을 제타 전위 측정용 샘플로 하였다.

다음으로, 제타 전위 측정 장치 (Malvern Instruments Ltd. 사 제조, 「Zetasizer Nano ZEN3600」) 로, 제타 전위 측정용 캐필러리 셀에 측정 샘플 750 ㎕ 를 분리 주입하고, 측정 온도 37 ℃ 에서 제타 전위를 측정하였다. 얻어진 제타 전위는 -74 ㎷ 였다.

(2) 라텍스 LotB

스티렌술폰산나트륨의 배합량을 0.08 g 으로 한 것 이외에는 LotA 와 동일하게 하여 라텍스 입자를 제작하였다. LotA 와 동일한 방법으로 평가를 실시하여, 얻어진 라텍스 입자의 평균 입자직경은 0.3 ㎛, 술폰산기량은 0.23 μmol/㎡, 제타 전위는 -77 ㎷ 였다.

(3) 라텍스 LotC

증류수의 배합량을 1020 g, 스티렌술폰산나트륨의 배합량을 0.25 g 으로 하고, 증류수 26 g 에 과황산칼륨 0.8 g 을 용해시킨 수용액 대신에 증류수 13 g 에 과황산칼륨 0.4 g 을 용해시킨 수용액을 사용하고, 또한 0.1 ㏖/ℓ 인산수소2칼륨 80 g 을 첨가한 것 이외에는 LotA 와 동일하게 하여 라텍스 입자를 제작하였다. LotA 와 동일한 방법으로 평가를 실시하여, 얻어진 라텍스 입자의 평균 입자직경은 0.3 ㎛, 술폰산기량은 0.16 μmol/㎡, 제타 전위는 -88 ㎷ 였다.

(4) 라텍스 LotD

증류수의 배합량을 1020 g, 스티렌술폰산나트륨의 배합량을 0.20 g 으로 하고, 증류수 26 g 에 과황산칼륨 0.8 g 을 용해시킨 수용액 대신에 증류수 16 g 에 과황산칼륨 0.6 g 을 용해시킨 수용액을 사용하고, 또한 0.1 ㏖/ℓ 인산수소2칼륨 80 g 을 첨가한 것 이외에는 LotA 와 동일하게 하여 라텍스 입자를 제작하였다. LotA 와 동일한 방법으로 평가를 실시하여, 얻어진 라텍스 입자의 평균 입자직경은 0.4 ㎛, 술폰산기량은 0.18 μmol/㎡, 제타 전위는 -86 ㎷ 였다.

(5) 라텍스 LotE

스티렌술폰산나트륨의 배합량을 0.01 g 으로 하고, 증류수 26 g 에 과황산칼륨 0.8 g 을 용해시킨 수용액 대신에 증류수 4 g 에 과황산칼륨 0.1 g 을 용해시킨 수용액을 사용한 것 이외에는 LotA 와 동일하게 하여 라텍스 입자를 제작하였다. LotA 와 동일한 방법으로 평가를 실시하여, 얻어진 라텍스 입자의 평균 입자직경은 0.4 ㎛, 술폰산기량은 0.06 μmol/㎡, 제타 전위는 -29 ㎷ 였다.

(실시예 1)

(1) 완충액 (제 1 시약) 의 조제

1.2 (W/V) ％ 의 풀루란 (하야시바라사 제조), 1.0 (W/V) ％ 의 소 혈청 알부민 (BSA) 을 함유하는 25 mmol/ℓ 의 인산 완충액 (pH 6.5) 100 ㎖ 에, 염화나트륨 0.9 g 과 아지화나트륨 0.1 g 을 첨가하여, 완충액 (제 1 시약) 으로 하였다.

(2) 인지질 항원 감작 라텍스 시약 (제 2 시약) 의 조제

카르디올리핀의 에탄올 용액 (5 ㎎/㎖, 시그마사 제조) 2 ㎖, 정제 레시틴 (나카라이테스크사 제조) 의 에탄올 용액 (10 ㎎/㎖) 10 ㎖ 및 콜레스테롤 (나카라이테스크사 제조) 의 에탄올 용액 (10 ㎎/㎖) 3 ㎖ 를 혼합하여, 인지질 항원액을 얻었다.

라텍스 입자 (LotA) 100 ㎕ 에, 얻어진 인지질 항원액 250 ㎕ 를 첨가하고, 그대로 37 ℃ 에서 차분히 2 시간 교반하였다. 다음으로 5 (W/V) ％ 농도로 BSA 를 함유하는 100 mmol/ℓ 의 인산 완충액 (pH 6.5) 3 ㎖ 를 첨가하고, 다시 37 ℃ 에서 1 시간 교반하였다. 15000 rpm, 4 ℃ 에서 30 분간 원심분리하여, 상청을 제거하고, 침전된 라텍스 입자를 1 (W/V) ％ 농도로 BSA 를 함유하는 100 mmol/ℓ 의 인산 완충액 (pH 6.5) 2 ㎖ 에 다시 현탁하였다. 이 조작을 2 회 반복하고, 라텍스 입자를 세정하며, 마지막으로 EDTA·4 Na 를 10 mmol/ℓ, 및 염화콜린을 500 mmol/ℓ 함유하는 100 mmol/ℓ 의 인산 완충액 (pH 6.5) 10 ㎖ 에 현탁 시켜 인지질 항원 감작 라텍스 시약 (제 2 시약) 으로 하였다.

(실시예 2)

라텍스 입자를 LotB 로 변경한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여, 완충액 (제 1 시약), 인지질 항원 감작 라텍스 시약 (제 2 시약) 을 조제하였다.

(실시예 3)

라텍스 입자를 LotC 로 변경한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여, 완충액 (제 1 시약), 인지질 항원 감작 라텍스 시약 (제 2 시약) 을 조제하였다.

(실시예 4)

라텍스 입자를 LotD 로 변경한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여, 완충액 (제 1 시약), 인지질 항원 감작 라텍스 시약 (제 2 시약) 을 조제하였다.

(비교예 1)

라텍스 입자를 LotE 로 변경한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여, 완충액 (제 1 시약), 인지질 항원 감작 라텍스 시약 (제 2 시약) 을 조제하였다.

<평가>

실시예 및 비교예에서 얻어진 완충액 (제 1 시약), 인지질 항원 감작 라텍스 시약 (제 2 시약) 에 대하여, 이하의 방법으로 평가하였다.

시판되는 RPR 표준 혈청 8.0 R.U. (세키스이 메디컬사 제조) 20 ㎕ 에, 완충액 (제 1 시약) 180 ㎕ 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 5 분간 유지시킨 후, 인지질 항원 감작 라텍스 시약 (제 2 시약) 60 ㎕ 를 첨가 교반하고, 측정 파장 700 ㎚ 에서 첨가 후 1 분간 및 5 분간의 흡광도 변화를, 히타치 7170 형 생화학 자동 분석기를 사용하여 측정하였다. 결과를 표 1 및 도 1 에 나타낸다.

도 1 로부터, -45 ㎷ 이상의 제타 전위에서는, 필요한 흡광도 변화량을 만족시키지 않고, 또한 제타 전위가 낮아지면 낮아질수록 흡광도 변화량이 커지는 것을 알 수 있다.

	평균 입자직경 (㎛)	제타 전위 (㎷)	흡광도 변화량 (mAbs)
실시예 1	0.4	-74	323
실시예 2	0.3	-77	427
실시예 3	0.3	-88	496
실시예 4	0.4	-86	509
비교예 1	0.4	-29	214

산업상 이용가능성

Claims

항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체로서,
평균 입자직경이 0.2 ㎛ ∼ 0.5 ㎛ 이고,
20 mmol/ℓ 의 인산나트륨 수용액 (pH 7.4) 에 있어서 고형분 농도가 0.1 ％ 가 되도록 현탁한 경우의 제타 전위가 -74 ㎷ 이하인 것을 특징으로 하는 항인지질 항체 측정 시약에 사용하는 불용성 담체.
제 1 항에 있어서,
페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산기를 갖는 중합성 단량체의 공중합체로 이루어지고, 표면의 술폰산기량이 0.1 ∼ 0.7 μmol/㎡ 인 것을 특징으로 하는 불용성 담체.
항인지질 항체 측정에 사용하는 항인지질 항체 측정 시약으로서,
인지질 항원을 담지한 불용성 담체와 완충액을 함유하고,
상기 인지질 항원을 담지하기 전의 불용성 담체는 평균 입자직경이 0.2 ㎛ ∼ 0.5 ㎛ 이고, 20 mmol/ℓ 의 인산나트륨 수용액 (pH 7.4) 에 있어서 고형분 농도가 0.1 ％ 가 되도록 현탁한 경우의 제타 전위가 -74 ㎷ 이하인 것을 특징으로 하는 항인지질 항체 측정 시약.
제 3 항에 있어서,
인지질 항원을 담지하기 전의 불용성 담체는 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산기를 갖는 중합성 단량체의 공중합체로 이루어지고, 표면의 술폰산기량이 0.1 ∼ 0.7 μmol/㎡ 인 것을 특징으로 하는 항인지질 항체 측정 시약.
인지질 항원을 담지한 불용성 담체와 완충액을 함유하는 항인지질 항체 측정 시약과 검체를 혼합하여 항원 항체 반응에 의해 응집을 발생시키는 공정과, 상기 응집의 정도를 광학적으로 측정 또는 육안으로 관찰함으로써 검체 중의 지질 항체를 측정하는 공정을 갖는 항인지질 항체의 측정 방법으로서,
인지질 항원을 담지시키기 전의 불용성 담체는 평균 입자직경이 0.2 ㎛ ∼ 0.5 ㎛ 이고, 20 mmol/ℓ 의 인산나트륨 수용액 (pH 7.4) 에 있어서 고형분 농도가 0.1 ％ 가 되도록 현탁한 경우의 제타 전위가 -74 ㎷ 이하인 것을 특징으로 하는 항인지질 항체의 측정 방법.
제 5 항에 있어서,
인지질 항원을 담지시키기 전의 불용성 담체는 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산기를 갖는 중합성 단량체의 공중합체로 이루어지고, 표면의 술폰산기량이 0.1 ∼ 0.7 μmol/㎡ 인 것을 특징으로 하는 항인지질 항체의 측정 방법.
제 1 항에 있어서,
유화제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 불용성 담체.
삭제