JP4213543B2

JP4213543B2 - カルジオリピン感作ラテックス試薬及びその製造方法

Info

Publication number: JP4213543B2
Application number: JP2003309240A
Authority: JP
Inventors: 友絵小森谷; 周作中島; 英毅神野
Original assignee: 株式会社三菱化学ヤトロン
Priority date: 2003-09-01
Filing date: 2003-09-01
Publication date: 2009-01-21
Anticipated expiration: 2023-09-01
Also published as: JP2005077283A

Description

本発明は、カルジオリピン感作ラテックス試薬及びその製造方法に関する。

カルジオリピンは、動物、植物、及び細菌界に広く分布するリン脂質の１種である。カルジオリピンを始めとするリン脂質に対する抗リン脂質抗体は、感染症にしばしば見られるが、その検査方法は未だ充分でない。例えば、抗リン脂質抗体症候群の診断において、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法又はＥＬＩＳＡ法が確立され、広く用いられているが、これらの方法は操作が煩雑であり、迅速性や簡便性に問題点が残されている。

迅速性や簡便性に優れた方法としてラテックス凝集法があり、抗リン脂質抗体を分析するためのカルジオリピン等を感作したラテックス試薬（特許文献１）が公知である。前記特許文献１に記載の公知のカルジオリピン感作ラテックス試薬では、例えば、カルジオリピン等（レシチン及びコレステロールも含む）と不溶性担体とを特定の割合で配合し、当該工程における反応温度を３０〜５５℃で行うものである。この時使用される不溶性担体は、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、又は酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等で、特に、ポリスチレン又はスチレン−スチレンスルホン酸共重合体が推奨されている。
しかし、カルジオリピンは、複合リン脂質であり、単純な抗原ではなく、しかも、負の電荷をもつため、表面が陰性荷電のラテックス粒子に吸着しにくい欠点がある。また、測定感度も不充分であった。

特開平１０−２３９３１５号公報

従って、本発明の課題は、従来技術のこれらの欠点を解消し、調製が簡易であり、しかも、大量生産に適している、カルジオリピン感作ラテックス試薬及びその製造方法を提供することにある。

前記課題は、本発明による、平均粒径が２００〜５００ｎｍで且つζ電位が−２０〜−４５ｍＶであるスチレン−アクリルアミドコポリマーラテックス粒子に、感作抗原としてカルジオリピンのみを吸着させた、カルジオリピン感作ラテックス試薬により解決することができる。
また、本発明は、平均粒径が２００〜５００ｎｍで且つζ電位が−２０〜−４５ｍＶであるスチレン−アクリルアミドコポリマーラテックス粒子に、２７℃〜５７℃でカルジオリピンを吸着させることを特徴とする、前記カルジオリピン感作ラテックス試薬の製造方法に関する。

本発明の製造方法は、調製が簡易であり、しかも、大量生産に適している。また、本発明の製造方法により得られるカルジオリピン感作ラテックス試薬によれば、高感度且つ迅速に、定量的な陽性又は陰性の判定が行えるので、感染の有無及び治療状況の確認が可能である。

本発明の製造方法では、ラテックス粒子として、平均粒径が２００〜５００ｎｍであり、しかも、ζ（ゼータ）電位が−２０〜−４５ｍＶであるスチレン−アクリルアミドコポリマーラテックス粒子を使用する。
本発明の製造方法で用いるスチレン−アクリルアミドコポリマーラテックス粒子は、スチレン及びアクリルアミドの重合体であって、しかも、ポリアクリルアミド層が表面に露出しているラテックス粒子である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレンからなる核の表面に、ポリアクリルアミドの層が形成されたラテックス粒子、あるいは、ポリスチレンホモポリマーからなるコア部、ポリアクリルアミドホモポリマーからなる表層部、及びポリスチレン／ポリアクリルアミドコポリマーからなる中間部とからなるラテックス粒子などを挙げることができる。ポリスチレンからなる核の表面に、ポリアクリルアミドの層が形成されたラテックス粒子は、例えば、実施例１に記載の製造方法、より具体的には、スチレンモノマーを重合することによりポリスチレンの核を形成し、アクリルアミドモノマーを後添加して、表面にポリアクリルアミドの層を形成させるシード重合法により調製することができる。

スチレン−アクリルアミドコポリマーラテックス粒子の特徴は、粒子表面が高い親水性を有することである。スチレン−アクリルアミドコポリマーラテックス粒子のζ電位は、粒径サイズとの関係上、−３０〜−４５ｍＶであることが好ましく、−３０〜−４０ｍＶであることがより好ましい。ζ電位が−２０ｍＶ未満だと、電荷的反発によりラテックス粒子へのカルジオリピンの吸着が充分に達成されないことがある。−４５ｍＶを超えると、ラテックス粒子自体が引き付け合い、ラテックス試薬に適用しにくくなる、という問題がある。なお、本明細書におけるζ電位とは、粒子表面の荷電を表す数値であり、詳細には、粒子表面には密着層と呼ばれる帯電層（通常、粒子の持つ負イオン）があり、その周囲を拡散層（最外層は中性）が取り巻く拡散二重層が形成されている。ζ電位はこの二重層の間に発生する電位のことであり、微粒子の安定性に関係するものである。

本発明の製造方法で用いるスチレン−アクリルアミドコポリマーラテックス粒子の平均粒径は２００〜５００ｎｍであり、２５０〜５００ｎｍであることが好ましい。ラテックス粒子の平均粒径が２００ｎｍ未満であるか、あるいは、５００ｎｍを超えると、ラテックス粒子へのカルジオリピンの吸着が充分に達成されないことがある。

本発明の製造方法では、ラテックス粒子へのカルジオリピンの吸着を２７〜５７℃で実施する。吸着反応時の温度は、３０〜５０℃であることが好ましく、３０℃〜４５℃であることがより好ましい。吸着反応時の温度が２７℃未満だと、ラテックス粒子へのカルジオリピンの吸着が充分に達成されず、あるいは、５７℃を超えると、リポソームの破壊が生じることがある。

本発明の製造方法は、前記の特定ラテックス粒子を使用し、しかも、前記の特定温度で前記ラテックス粒子へのカルジオリピンの感作反応を実施すること以外は、通常のラテックス製造方法と同様に実施することができる。例えば、カルジオリピン溶液とラテックス懸濁液とを混合し、前記特定温度で所定時間（例えば、１０分間〜１０時間、好ましくは３０分間〜２時間）インキュベートすることにより、ラテックス粒子表面にカルジオリピンを結合させ、感作することができる。所望により、前記混合液を遠心分離してラテックス粒子を回収し、未結合のカルジオリピンを洗浄除去した後、再度、懸濁することにより、カルジオリピン感作ラテックス粒子懸濁液を得ることができる。

本発明の製造方法では、カルジオリピン溶液として、低級アルコール（好ましくは炭素数１〜４の低級アルコール、特にはエタノール）／水混合溶液にカルジオリピンを溶解して調製したカルジオリピン溶液を用いることが好ましい。カルジオリピンは、エタノール溶液中で安定化するリン脂質であるためである。

感作反応系（例えば、カルジオリピン溶液とラテックス懸濁液との混合液系）におけるカルジオリピン濃度は、感作反応が充分に達成される濃度である限り、特に限定されるものではないが、０．１〜２ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．２５〜１ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬであることが特に好ましい。
また、感作反応系におけるエタノール濃度は、感作反応が充分に達成される濃度である限り、特に限定されるものではないが、３０〜７０％であることが好ましく、４０〜６０％であることがより好ましい。
更に、感作反応系におけるラテックス濃度は、感作反応が充分に達成される濃度である限り、特に限定されるものではないが、０.１〜２.０％であることが好ましく、０.５〜１.０％であることがより好ましい。
その他、公知技術に用いられている安定化剤及び／又は反応促進剤等を適宜使用することができる。

本発明の製造方法により得られるカルジオリピン感作ラテックス試薬は、通常のラテックス試薬と同様にして使用することができる。例えば、抗カルジオリピン抗体を含有する可能性のある被検試料（例えば、ヒト血清や動物血清）と前記ラテックス試薬とを混合することにより、前記ラテックスは、抗原抗体反応により凝集反応を起こし、その凝集を目視的に観察するか、あるいは、より迅速に定量をするために、分光学的にその凝集反応速度を計測し、その速度より定量的に抗体濃度を知ることができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
（１）スチレン−アクリルアミドコポリマーラテックスの作製
重合開始剤に過硫酸カリウム（和光純薬工業株式会社）及びチオ硫酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）を用いてスチレンモノマーを重合することによりポリスチレンの核を形成し、アクリルアミドモノマーを後添加して、表面にポリアクリルアミドの層を形成させるシード重合法で合成した。
具体的には、脱気超純水８００ｍＬの入った３０００ｍＬの４つ口フラスコに、スチレンモノマー１ｍｏｌを溶解した。スチレン・アクリルアミド共重合ラテックス粒子合成装置を組み立て、窒素（株式会社ザ・トーカイ）置換下において、温度４０℃にて撹拌速度３５０〜３６０ｒｐｍで撹拌した。次に、重合開始剤であるチオ硫酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）０．０５ｍｏｌと過硫酸カリウム（和光純薬株式会社）０．０５ｍｏｌをそれぞれ脱気超純水で１００ｍＬに溶解したものを混合した。４０℃に昇温し、１時間放置した。その後、１℃／１分で４０〜５０℃に昇温し、１℃／５分で５０〜６０℃に昇温し、１℃／４０分で６０〜６５℃に昇温した。続いて、１℃／１０分で６５〜７０℃に昇温しながらアクリルアミドモノマー０．１ｍｏｌを脱気超純水に溶解し加温したものを２ｍＬ／分で滴下した。そして、１℃／１０分で７０〜８０℃に昇温し、８０℃で１４時間保温した。保温後、常温まで冷却して撹拌を止めた。その後、ラテックスの透析を行った。
作製したスチレンアクリルアミド共重合ラテックス粒子の物性は、Ｓサイズ（２００ｎｍ未満）のζ電位は−２６．８ｍＶであり、Ｍサイズのζ電位は−３６．７ｍＶであり、平均粒子径は２８６ｎｍであった。

（２）カルジオリピン感作ラテックスの作製
０．５％アジ化ナトリム溶液（和光純薬工業株式会社）にスチレン／アクリルアミドラテックス［前記（１）で作製したスチレンアクリルアミド共重合ラテックスの内、Ｍサイズのもの］が１０％となるように懸濁しておいた。カルジオリピンエタノール溶液とラテックス懸濁液を、混合時にカルジオリピン（SIGMA-ALDRICH. CO）０．５ｍｇ／ｍＬ、エタノール（和光純薬工業株式会社）４０〜６０％、及びラテックス０．５％となるように調整し、それぞれを３７℃で３０〜１２０分間程度インキュベートした。その後、すぐに混合し、再び２４時間程度インキュベートした。この懸濁液を１６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してラテックスを回収した。ラテックスを純水で均一に懸濁し、再び遠心分離を行い、洗浄した。洗浄操作は２回行った。洗浄後、０．０５％アジ化ナトリウム溶液で懸濁し、０．５％ラテックス試薬とした。

（３）ラテックス近赤外線免疫比濁法による凝集反応の測定
全自動免疫血清検査システム（三菱化学株式会社製ＬＰＩＡ−２００）により反応速度の平均値を以下の方法によって測定した。
キュベットに、サンプルとして標準ウサギ血清の希釈列（３０μＬ）、バッファーＡ（５０μＬ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のバッファーＢ（１８０μＬ）、及びラテックス（４０μＬ）の順序で添加した。そして、この混合溶液を１回／１２秒で１０分間測定し、５０プロット記録した。結果を表１及び図１に示す。表１に示す「Ｖ」は、これらの反応速度の平均値である。
表１に示すように、充分な反応速度が観察され、ラテックス粒子へのカルジオリピンの感作が充分に達成されていることが確認された。

［緩衝液の組成］
ＢＳＡ共通バッファーＢ［０．１％ＮａＮ₃及び０．５％ＢＳＡを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）］：
０．１ｍｏｌ／Ｌ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（和光純薬工業株式会社）、塩酸（ｐＨ調整のため適量；和光純薬工業株式会社）、０．１％アジ化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）、０．５％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ．ＣＯ）、０．１％ＥＤＴＡ（和光純薬工業株式会社）、０．９％塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）
共通バッファーＡ［０．１％ＮａＮ₃を含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）］：
０．１ｍｏｌ／Ｌ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（和光純薬工業株式会社）、塩酸（ｐＨ調整のため適量；和光純薬工業株式会社）、０．１％アジ化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）、０．９％塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）、０．１％ＥＤＴＡ（和光純薬工業株式会社）

実施例２
感作反応時の温度を、３０℃、３７℃、４１℃、４５℃、又は５０℃としたこと以外は、実施例１の操作を繰り返した。結果を図２に示す。図２に示すように、いずれの温度でも充分な感作が達成されたが、３７℃が至適感作温度であった。

比較例１
本比較例では、スチレン−アクリルアミドコポリマーラテックスの代わりに、スチレンラテックスを使用した。
（１）スチレンラテックスの作製
重合開始剤に過硫酸カリウム（和光純薬工業株式会社）及びチオ硫酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）を用いてスチレンモノマーを重合し、ポリスチレンの核を形成した。
具体的には、脱気超純水８００ｍＬの入った３０００ｍＬの４つ口フラスコに、スチレンモノマー１ｍｏｌを溶解した。スチレンラテックス粒子合成装置を組み立て、窒素（株式会社ザ・トーカイ）置換下において、温度４０℃にて撹拌速度３５０〜３６０ｒｐｍで撹拌した。次に、重合開始剤であるチオ硫酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）０．０５ｍｏｌと過硫酸カリウム（和光純薬株式会社）０．０５ｍｏｌをそれぞれ脱気超純水で１００ｍＬに溶解したものを混合した。４０℃に昇温し、１時間放置した。このとき、溶液が飛び散らないように攪拌速度を調節した。その後、１℃／１分で４０〜５０℃に昇温し、１℃／５分で５０〜６０℃に昇温し、１℃／１０分で６０〜８０℃に昇温し、８０℃で５時間保温した。保温後、常温まで冷却して撹拌を止めた。その後、ラテックスの透析を行った。

（２）カルジオリピン感作ラテックスの作製
前記（１）で作製したスチレンラテックスを使用したこと以外は、実施例１（２）の操作を繰り返した。

（３）ラテックス近赤外線免疫比濁法による凝集反応の測定
実施例１（３）と同様にして、免疫比濁法により反応速度の平均値を測定した。結果を表２に示す。表２に示すように、スチレンラテックスを使用した場合には、充分な反応速度が観察されず、ラテックス粒子へのカルジオリピンの感作が充分でないことが確認された。

比較例２
本比較例では、カルジオリピンのスチレン−アクリルアミドコポリマーラテックスへの吸着反応を５℃で実施した。
（１）スチレン−アクリルアミドコポリマーラテックスの作製
実施例１（１）の操作を繰り返すことにより、スチレン−アクリルアミドコポリマーラテックスを作製した。作製したスチレンアクリルアミド共重合ラテックス粒子の物性は、Ｓサイズ（２００ｎｍ未満）のζ電位は−２６．８ｍＶであり、Ｍサイズのζ電位は−３６．７ｍＶであり、平均粒子径は２８６ｎｍであった。

（２）カルジオリピン感作ラテックスの作製
カルジオリピンのスチレン−アクリルアミドコポリマーラテックスへの吸着反応を０℃で実施したこと以外は、実施例１（２）の操作を繰り返した。

（３）ラテックス近赤外線免疫比濁法による凝集反応の測定
実施例１（３）と同様にＬＰＩＡ−２００により反応速度の平均値を以下の方法によって測定した。
キュベットに、サンプルとして標準ウサギ抗血清の希釈列（３０μＬ）、共通バッファーＡ（５０μＬ）、ＢＳＡの共通バッファーＢ（１８０μＬ）、及びラテックス（４０μＬ）の順序で添加した。そして、この混合溶液を１回／１２秒で１０分間測定し、５０プロット記録した。結果を表３に示す。表３に示す「Ｖ」は、これらの反応速度の平均値である。
表３に示すように、感作温度が０℃の場合には、充分な反応速度が観察されず、ラテックス粒子へのカルジオリピンの感作が充分でないことが確認された。

比較例３
本比較例では、小粒径のスチレン−アクリルアミドコポリマーラテックスを使用した。
（１）スチレン−アクリルアミドコポリマーラテックスの作製
実施例１（１）の操作を繰り返すことにより、スチレン−アクリルアミドコポリマーラテックスを作製した。作製したスチレンアクリルアミド共重合ラテックス粒子の物性は、Ｓサイズ（２００ｎｍ未満）のζ電位は−２６．８ｍＶであり、Ｍサイズのζ電位は−３６．７ｍＶであり、平均粒子径は２８６ｎｍであった。

（２）カルジオリピン感作ラテックスの作製
前記（１）で作製したスチレンラテックスの内、Ｓサイズを使用したこと以外は、実施例１（２）の操作を繰り返した。

（３）ラテックス近赤外線免疫比濁法による凝集反応の測定
実施例１（３）と同様にして、免疫比濁法により反応速度の平均値を測定した。結果を表４に示す。表４に示すように、小粒径のラテックス粒子を使用した場合には、充分な反応速度が観察されず、ラテックス粒子へのカルジオリピンの感作が充分でないことが確認された。

本発明の製造方法は、カルジオリピン感作ラテックス試薬の製造の用途に適用することができる。

本発明の製造方法により作製したカルジオリピン感作ラテックス試薬を用いて実施したラテックス凝集法の結果を示すグラフである。本発明の製造方法において、感作反応時の温度の影響を示すグラフである。

Claims

平均粒径が２００〜５００ｎｍで且つζ電位が−２０〜−４５ｍＶであるスチレン−アクリルアミドコポリマーラテックス粒子に、感作抗原としてカルジオリピンのみを吸着させた、カルジオリピン感作ラテックス試薬。
平均粒径が２００〜５００ｎｍで且つζ電位が−２０〜−４５ｍＶであるスチレン−アクリルアミドコポリマーラテックス粒子に、２７℃〜５７℃でカルジオリピンを吸着させることを特徴とする、請求項１に記載のカルジオリピン感作ラテックス試薬の製造方法。