JP5362797B2 - 凝集反応安定化方法 - Google Patents

Description

本発明は、ラテックス等の不溶性担体粒子を含む比濁免疫測定用試薬、不溶性担体粒子を用いた比濁免疫測定方法及び不溶性担体粒子を含む比濁免疫測定用キットに関し、より詳細には、吸光度を安定化し、かつ反応に関与して測定値に影響を与える血漿成分の働きを抑制することができる不溶性担体粒子を含む比濁免疫測定用試薬、不溶性担体粒子を用いた比濁免疫測定方法及び不溶性担体粒子を含む比濁免疫測定用キットに関する。

ラテックスは、臨床検査の分野において検体中の抗原又は抗体を測定する免疫測定法に盛んに使用されている。例えば、特開平１０−２５３６２９号公報には、ｐＨ４．２のリン酸クエン酸緩衝液等のｐＨ４．０〜６．０の緩衝液中で、抗原又は抗体をポリスチレン系ラテックス粒子に担持させた後、ｐＨ８．０のトリス緩衝液等のｐＨ６．５〜９．０の緩衝液に置換することからなる、高感度を維持しつつ、プロゾーンの発生を抑制し、バラツキが少なく、安定性に優れた免疫測定試薬の製造方法が記載されている。

また、特開平９−３１８６３２号公報には、検体と、抗原又は抗体を担持したラテックス懸濁液とを混合し、この混合液中に二価アルコールを添加し、抗原抗体反応によるラテックス粒子の凝集によって生じる吸光度の変化量を測定することからなる、測定すべき抗原又は抗体が検体中に高濃度に含まれる場合にあっても、検体を希釈することなく原液のままで測定可能なラテックス比濁免疫測定方法が記載されている。

また、特開平７−３０１６３２号公報には、表面にカルボキシレート基を有するラテックス粒子と該粒子に共有結合で結合した免疫反応体とを含む担持した微粒子であって、ラテックス粒子が０．１〜０．６μｍの直径及び８〜３５平方オングストロームの表面カルボキシレート占有領域を有する、担持した微粒子、及び該微粒子と緩衝液とを含むイムノアッセイ試薬が記載されている。

特開平１０−２５３６２９号公報 特開平９−３１８６３２号公報 特開平７−３０１６３２号公報

上記のように、ラテックスはラテックス比濁免疫測定法等免疫凝集反応を利用した測定系によく用いられているが、ラテックス懸濁液は、その中に微量に混入する重金属イオンなどによって反応液中に共存する血漿成分と反応し、抗原又は抗体のラテックス担体に対する吸着性を変化させたり、あるいは抗原又は抗体を結合させたラテックスから抗原又は抗体が解離して遊離の抗原又は抗体が発生し、反応時のラテックス凝集の度合いを変化させたりすることによって、感度が不安定化するという問題があった。また、抗原や抗体を結合させていないラテックスの場合では、表面の電荷を担っているカルボキシル基やスルホ基に重金属イオンが結合することによって表面電荷が変化し、感度が不安定化するという問題があった。

本発明の課題は、ラテックス等の不溶性担体粒子凝集反応に関与して測定値に影響を与える血漿成分の働きを抑制して凝集反応を安定化し、反応液の吸光度が安定化することにより精確な測定結果を与えることができる不溶性担体粒子比濁免疫測定用試薬や不溶性担体粒子比濁免疫測定用キット、及び該試薬やキットを用いる不溶性担体粒子比濁免疫測定法を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究し、ラテックス凝集反応を不安定化する血漿成分、すなわち血漿中に存在する微量の複数価の金属イオンに対して、分子式中に特定の基を有する化合物を含む緩衝剤を用いると、ラテックス表面の荷電状態を安定化し、ラテックスに結合した抗原又は抗体の遊離を防止し、ラテックス凝集反応を安定化して、精確な測定結果を得ることができることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）検体中のヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと記す）の不溶性担体粒子比濁免疫測定方法において、ビシン又はトリシン緩衝剤を含む緩衝液に、抗原及び抗体を担持していない不溶性担体粒子を懸濁させることを特徴とする、検体中のＨｂＡ１ｃの不溶性担体粒子比濁免疫測定方法における凝集反応安定化方法に関する。

また本発明は、（２）ビシン又はトリシン緩衝剤を、その使用濃度が５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌに調整し得るような形態で用いることを特徴とする前記（１）記載の安定化方法や、（３）抗原及び抗体を担持していない不溶性担体粒子を、その使用濃度が０．００５〜５重量％に調整し得るような形態で用いることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の安定化方法や、（４）不溶性担体粒子が、ラテックスであることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の安定化方法に関する。

本発明の検体中のＨｂＡ１ｃの不溶性担体粒子比濁免疫測定方法における凝集反応安定化方法としては、不溶性担体粒子と、以下の［化１］で表されるビシン又は以下の［化２］で表されるトリシンからなる緩衝剤とを用いる不溶性担体粒子比濁免疫測定方法における凝集反応安定化方法であれば特に制限されるものではない。ここで、不溶性担体粒子比濁免疫測定方法とは、不溶性担体粒子を用いる免疫凝集反応によって発生した濁度を測定して、検体中の抗原又は抗体を定量する方法をいう。

上記ビシン又はトリシン緩衝剤は、５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ濃度で使用することがラテックス等の不溶性担体粒子凝集反応をより安定化することができるので好ましい。不溶性担体粒子凝集反応における反応時のｐＨは、反応を安定化する上で非常に重要であり、緩衝成分の濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ以上では、一定のｐＨを維持することが容易となり、他方、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下では不溶性担体粒子同士が抗原抗体反応によらない非特異的な凝集を起こすことがない。また、緩衝成分を含有する緩衝液のｐＨを調節する酸類としては通常の塩酸や、硫酸、硝酸の他、酢酸等の有機酸等を使用することができ、アルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウムなどを使用することができる。また、本発明における緩衝剤には、上記緩衝成分の他、必要に応じて他の任意成分をも含ませることができる。かかる任意成分としては、検体中の脂質の可溶化に効果のある界面活性剤、特にポリオキシエチレングリコール基を持ったノニオン系界面活性剤やその他カチオン系、アニオン系界面活性剤を例示することができる。

本発明における不溶性担体粒子としては、上記本発明の緩衝剤と併用した場合に、測定値に影響を与える血漿成分の働きを抑制して凝集反応を安定化しうるものであればどのようなものでもよく、例えば、特公昭５８−１１５７５号公報等に記載された従来公知の有機高分子物質の微粒子や、無機酸化物の微粒子、あるいは核となるこれらの物質の表面を有機物等で表面処理した微粒子を例示することができ、具体的には、例えば、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、（メタ）アクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート等の合成樹脂（ラテックス）や、ニトロセルロース、セルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体や、金属、セラミック、ガラス、シリコンラバー等の無機物を挙げることができる。これらの中でも、特にポリスチレン系の合成高分子、電荷を与える為に成分としてアクリル酸系のモノマーやスルホン酸をもつモノマーなどを共重合したポリスチレン系の合成高分子が好ましい。

上記のように、本発明においては、上記不溶性担体として、ポリスチレンラテックス等のラテックス粒子が特に好ましく用いられる。ポリスチレンラテックス等の表面の疎水性が強いラテックスを用いると、タンパク質やペプチドの吸着をスムーズにすることができる。また、乳化剤として界面活性剤を用いないソープフリー重合によって得られるポリスチレンラテックス粒子は、表面の負電荷同士の反発に基づき、界面活性剤なしでも安定に存在できるので特に好ましく用いることができる。その他、種々の変性ラテックス（例えば、カルボン酸変性ラテックス）、磁性ラテックス（磁性粒子を内包させたラテックス）等を必要に応じて用いることもできる。

定量的にイムノアッセイを行う場合、通常は、不溶性担体粒子の大きさの均一性、表面状態の制御、内部構造の選択などが高度の次元で要求されるが、このような試薬向けの良好なラテックス等の不溶性担体粒子は、市販品の中から選択して用いることが可能である。また、不溶性担体粒子の形状としては、特に制限されるものではないが、例えば、球状等を挙げることができ、球状の場合の粒子径としては、例えば０．０３〜０．８μｍの平均粒径、特に０．０６〜０．２μｍの平均粒径が好ましい。そしてまた、本発明における不溶性担体粒子の反応液中の濃度としては、特に制限がないが、例えば、０．００１〜１０重量％、好ましくは０．００５〜５重量％、より好ましくは０．０１〜２重量％の濃度で使用することが不溶性担体粒子凝集反応をより安定化することができるので好ましい。

本発明の不溶性担体粒子比濁免疫測定用試薬としては、その使用濃度が５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌに調整し得るような形態で含まれているビシン、トリシン等の緩衝剤、その使用濃度が０．００５〜５重量％に調整し得るような形態で含まれているラテックス等の不溶性担体粒子、不溶性担体粒子担持用抗原又は抗体、及びその他の任意成分を含有する試薬を例示することができる。また、かかる試薬において、抗原又は抗体をあらかじめ担持させた不溶性担体粒子を使用することもできる。

本発明の不溶性担体粒子比濁免疫測定方法としては、抗原又は抗体をビシン、トリシン等の緩衝剤の存在下に不溶性担体粒子に、化学結合や物理吸着等により担持させ、次いで免疫凝集反応を行わせる方法や、抗原又は抗体を担持させた不溶性担体粒子に、緩衝剤の存在下に免疫凝集反応を行わせる方法を挙げることができ、その場合、緩衝剤は緩衝液として、不溶性担体粒子は不溶性担体粒子懸濁液として、使用することができるが、不溶性担体粒子は緩衝液に懸濁させた状態で使用してもよい。また、免疫凝集反応時や、抗原又は抗体の不溶性担体粒子担持時における、緩衝剤濃度を５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ、不溶性担体粒子を濃度０．００５〜２重量％とすることが好ましい。

また、不溶性担体粒子比濁免疫測定用キットとしては、ビシン、トリシン等の緩衝剤を５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する緩衝液、ラテックス等の不溶性担体粒子を０．００５〜５重量％の濃度で含有する懸濁液、不溶性担体粒子担持用抗原又は抗体、及びその他の任意成分を含有する試薬からなるキットを例示することができる。また、かかる測定用キットにおいて、抗原又は抗体をあらかじめ担持させた不溶性担体粒子を使用することもできる。

以下に、実施例を掲げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、実施例中の％表記は、特に断りがない場合は重量％を示す。

［試薬１（緩衝液）の調製］
緩衝剤としてのビシン（同仁化学社製）３．２６ｇを蒸留水に溶解し、０．１ｇのトリトンＸ−１００、１７．５ｇの塩化ナトリウム、０．０１ｇのアジ化ナトリウムをそれぞれ添加し、２０℃でｐＨを計測しながら１ｍｏｌ／Ｌの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨ８．０に調整し、蒸留水で全量を１，０００ｍＬとした。また、ビシンの代わりに、緩衝剤としてトリシン（同仁化学社製）３．５８ｇ、ＴＡＰＳＯ｛２−ヒドロキシ−３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸｝（同仁化学社製）５．１８ｇ、ＰＯＰＳＯ［ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）・２水和物］（同仁化学社製）７．９７ｇ、ＴＥＳ｛２−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］エタンスルホン酸｝（同仁化学社製）４．５９ｇをそれぞれ蒸留水に溶解し、同様にトリトンＸ−１００、塩化ナトリウム、アジ化ナトリウムを添加し、ｐＨ８．０に調整した後、蒸留水で全量を１，０００ｍＬとした。このようにして、本発明のビシン又はトリシンをそれぞれ２０ｍｍｏｌ／Ｌ含む緩衝液と、比較例としてＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＰＯ、ＴＥＳをそれぞれ２０ｍｍｏｌ／Ｌ含む緩衝液とからなる５種類の緩衝液を調製した。

［試薬２（抗体担持ラテックス懸濁液）の調製］
平均粒子径０．３１μｍの１０％ポリスチレンラテックス懸濁液（協和メデックス社製）１容に、１／６０ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４になるように１ｍｏｌ／Ｌの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液で調製したもの）９容を添加してラテックスを希釈し、１％ラテックス懸濁液とした。また、抗ヒトフェリチン抗体（協和メデックス社製）は、蛋白濃度が５０μｇ／ｍＬになるように１／６０ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ溶液で希釈し担持用の抗体液とした。１％ラテックス懸濁液６００μＬを２５℃のインキューベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、これに上記抗体液１２００μＬを素早く添加し、２５℃にて２時間攪拌した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌのグリシン緩衝液にＢＳＡ（和光純薬社製）が０．６％、トリトンＸ−１００（シグマ社製）が０．０１５％になるように調製したブロッキング液を３ｍＬ添加し、２５℃にて続けて２時間攪拌した。その後、４℃、１５０００ｒｐｍにて１時間遠心分離した。得られた沈殿にブロッキング液を４ｍＬ添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行った。この沈殿にブロッキング液６ｍＬを添加し、０．１％の抗体担持ラテックス懸濁液とした。

［検体の調製］
人血液を採血管（ベノジェクト真空採血管；テルモ社製）で採血後、２時間放置して得られた上澄み液（血清）を検体１とした。また、人血液をＥＤＴＡ採血管（ベノジェクト真空採血管；テルモ社製）で採血後、２時間放置して得られた上澄み液（血清）を検体２とし、人血液を採血管（ベノジェクト真空採血管；テルモ社製）で採血後、２時間放置して得られた上澄み液（血清）に、エチレンジアミン四酢酸二カリウム（同仁化学社製）を１ｍｇ／ｍＬになるように添加したものを検体３とした。

［試薬１と試薬２を用いた検量線の作成］
フェリチン（スクリプス社製）を生理食塩水に溶解して、１０．９、２１．９、４３．８、８７．５、１７５ｎｇ／ｍＬの各濃度のフェリチン溶液をそれぞれ調製し、これらを１０μＬずつ１４０μＬの試薬１に添加し、３７℃、６分間反応させた後、１５０μＬの試薬２を添加し、３７℃、１３分後に、日立自動分析装置７１７０型を使用して、２ポイントエンド法（測光ポイント２１−３９）、主波長７５０ｎｍ、副波長８００ｎｍで吸光度変化量を測定することにより検量線を作成した。

［試薬１と試薬２を用いたフェリチン濃度の測定］
上記検量線を作成したと同様に、前記検体１と検体２及び検体３の各１０μＬを、１４０μＬの試薬１にそれぞれ添加し、３７℃、６分間反応させた後、調製直後の１５０μＬの試薬２を添加し、３７℃１３分後に、日立自動分析装置７１７０型を使用して、２ポイントエンド法（測光ポイント２１−３９）、主波長７５０ｎｍ、副波長８００ｎｍで吸光度変化量を測定し、上記検量線を用いて各検体中のフェリチン濃度を測定した。結果を表１に示す。また、調製直後の試薬１に代えて、調製後１週間が経過した試薬１を用いる他は上記と同様にして測定した結果を表２に示す。表１及び表２から、緩衝剤としてビシンやトリシンを用いた場合、測定感度が安定することがわかる。

［試薬３（ラテックス懸濁液）の調製］
緩衝剤としてのビシン３．２６ｇを蒸留水に溶解させ、１０％ラテックス（粒径０．０８７μｍ；積水化学社製）３．３ｍＬ、及び０．１ｇのアジ化ナトリウムを添加し、２０℃でｐＨを計測しながら１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液又は塩酸を加え、ｐＨを７．８に調整し、蒸留水で全量を１，０００ｍＬとした。また、ビシンの代わりに、緩衝剤としてトリシン３．５８ｇ、ＴＡＰＳＯ５．１８ｇ、ＰＯＰＳＯ７．９７ｇ、ＴＥＳ４．５９ｇをそれぞれ蒸留水に溶解し、同様にラテックス、アジ化ナトリウムを添加し、ｐＨを７．８に合わせ、蒸留水で全量を１，０００ｍＬとした。このようにして、本発明のビシン又はトリシンをそれぞれ２０ｍｍｏｌ／Ｌ含む緩衝液と、比較例としてＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＰＯ、ＴＥＳをそれぞれ２０ｍｍｏｌ／Ｌ含む緩衝液とからなる５種類の緩衝液を調製した。

［試薬４（抗体溶液）の調製］
抗原として変性ヒトＨｂＡ１ｃを用いてマウスを免疫し、常法により得られる抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体を抗体溶液の調製に用いた。ビシン緩衝剤３．２６ｇを蒸留水に溶解し、塩化ナトリウムを１５ｇ添加し、２０℃でｐＨを計測しながら１ｍｏｌ／Ｌの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを７．０に調整し、Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製）を２ｇ添加し、アジ化ナトリウムを０．１ｇ添加し、次いで前記抗ヒト変性ＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体を０．０２５ｇ（ＩｇＧ換算）、抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬社製）を０．０４ｇ（ＩｇＧ換算）添加し、蒸留水で全量を１，０００ｍＬとした。また、ビシン緩衝剤の代わりにトリシン緩衝剤３．５８ｇ、ＴＡＰＳＯ緩衝剤５．１８ｇ、ＰＯＰＳＯ緩衝剤７．９７ｇ、ＴＥＳ緩衝剤４．５９ｇ、をそれぞれ蒸留水に溶解し、同様に塩化ナトリウムを添加し、ｐＨを７．０に合わせたものに、ビシンの場合と同様に、Ｔｗｅｅｎ２０、アジ化ナトリウムを添加し、次いで抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体、抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体を添加し、蒸留水で全量を１，０００ｍＬとした。

［検体の調製］
人血液をＥＤＴＡ採血管（ベノジェクト真空採血管；テルモ社製）で採血後、２時間放置して沈殿した血球層１０μＬをとり、蒸留水１ｍＬで希釈した検体４と、この検体４にＥＤＴＡ採血管の上澄み液である血漿を１０μＬ添加した血漿混入検体５を調製した。

［試薬３と試薬４を用いた検量線の作成］
東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶを用いて測定したＨｂＡ１ｃ値が、０．０％、４．２％、７．７％、１１．３％、１４．８％であった各検体を用いて、日立自動分析装置７１７０型を使用して吸光度変化量を測定することにより検量線を作成した。上記吸光度変化量の測定は、２４０μＬの試薬３に４μＬの検体を添加し、３７℃で５分間反応させた後、８０μＬの試薬４を添加し、３７℃で５分間反応させた後に主波長４５０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて、２ポイントエンド法（測光ポイント１６−３４）で吸光度変化量を測定することにより行った。

［試薬３と試薬４を用いたＨｂＡ１ｃ濃度の測定］
上記検量線を作成したと同様に、前記検体４と検体５の各４μＬを、調製直後の２４０μＬの試薬３にそれぞれ添加し、３７℃で５分間反応させた後、調製３日後の８０μＬの試薬４を添加し、３７℃で５分間反応させた後に、日立自動分析装置７１７０型を使用して、２ポイントエンド法（測光ポイント１６−３４）、主波長４５０ｎｍ、副波長８００ｎｍで吸光度変化量を測定し、上記検量線を用いて各検体中のＨｂＡ１ｃ濃度を測定した。結果を表３に示す。また、調製直後の試薬３に代えて、調製後１週間が経過した試薬３を用いる他は上記と同様にして測定した結果を表４に示す。表３及び表４から、緩衝剤としてビシンやトリシンを用いた場合、測定感度が安定していることがわかる。

本発明によると、不溶性担体粒子凝集反応に関与して測定値に影響を与える血漿成分の働きを抑制して凝集反応を安定化し、反応液の吸光度を安定化し、精確な測定結果を与えることができる。

Claims (4)

1. 検体中のヘモグロビンＡ１ｃの不溶性担体粒子比濁免疫測定方法において、ビシン又はトリシン緩衝剤を含む緩衝液に、抗原及び抗体を担持していない不溶性担体粒子を懸濁させることを特徴とする、検体中のヘモグロビンＡ１ｃの不溶性担体粒子比濁免疫測定方法における凝集反応安定化方法。
2. ビシン又はトリシン緩衝剤を、その使用濃度が５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌに調整し得るような形態で用いることを特徴とする請求項１記載の安定化方法。
3. 抗原及び抗体を担持していない不溶性担体粒子を、その使用濃度が０．００５〜５重量％に調整し得るような形態で用いることを特徴とする請求項１又は２記載の安定化方法。
4. 不溶性担体粒子が、ラテックスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の安定化方法。