JP2003075438A - Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 精度が良く安定的で、かつ簡便なＰＩＶＫＡ
−IIの免疫学的測定法を提供すること。 【解決手段】 抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子
状担体を用いて試料中のＰＩＶＫＡ−IIを免疫学的に測
定する方法において、該担体の凝集を阻害する物質の存
在下において該担体と該試料とを接触させることを特徴
とするＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＰＩＶＫＡ−IIの
免疫学的測定法、ＰＩＶＫＡ−II測定用試薬、並びにＰ
ＩＶＫＡ−II測定用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＰＩＶＫＡ−II（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎ
ｄｕｃｅｄ ｂｙ ＶｉｔａｍｉｎＫ Ａｂｓｅｎｃｅ
ｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ II）は、ビタミンＫ依
存性血漿蛋白質の一つであるプロトロンビンの前駆物質
で、アミノ末端領域にある１０個のグルタミン酸残基に
ついてのγ−カルボキシル化の程度が不完全なものを指
して言う。一方、カルボキシル化の程度が完全なものを
正常プロトロンビンと言い、ＰＩＶＫＡ−IIは正常プロ
トロンビンのγ−カルボキシグルタミン酸残基について
の脱カルボキシル化体であるとも言えることから、ＰＩ
ＶＫＡ−IIという名称以外に異常プロトロンビン（Ａｂ
ｎｏｒｍａｌ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）と呼ばれるこ
ともある。通常、１０個のグルタミン酸残基中いくつが
γ−カルボキシル化を受けるかにより数種類のＰＩＶＫ
Ａ−IIが混在した状態で存在している。

【０００３】ＰＩＶＫＡ−II測定の臨床的な有用性とし
ては、ビタミンＫの不足状態あるいは抑制状態において
当該γ−カルボキシル化が不完全となり、その結果ＰＩ
ＶＫＡ−IIが血液中に出現するので、ビタミンＫの不足
状態あるいは抑制状態のマーカーとなることが知られて
いる。また最近では、肝細胞腫瘍にともなって血中にＰ
ＩＶＫＡ−IIが出現することが明らかにされ、従来肝細
胞腫瘍の良いマーカーとされてきたα−フェトプロテイ
ン（ＡＦＰ）が陰性を示す肝細胞腫瘍患者においてもＰ
ＩＶＫＡ−IIが高濃度に出現することがあることから、
ＡＦＰと並び肝細胞腫瘍を検出するマーカーとしても広
く用いられている。

【０００４】現在用いられているＰＩＶＫＡ−IIの測定
方法としては、特異的モノクローナル抗体もしくはポリ
クローナル抗体を吸着させたプラスチックプレート等の
固相担体と、血清や血漿等の生物学的試料との一次反応
を行った後に、反応結合物と未反応物の分離（以下、Ｂ
／Ｆ分離とも称する）を行い、蛍光物質、酵素、放射性
同位元素等で標識したヒトプロトロンビンに特異的なモ
ノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体との二次
反応を行って、反応により形成された免疫複合体の蛍
光、発光量、酵素活性、放射能等を測定する免疫学的測
定法が最も一般的である。

【０００５】一般に、このような免疫学的測定法におい
て、Ｂ／Ｆ分離の操作は、測定を煩雑にし、時間のかか
るものにしている主な原因の一つとなっている。Ｂ／Ｆ
分離は、通常、チューブ、マイクロタイターウェル等の
反応管から未反応物を含む反応液を廃棄した後、洗浄液
の供給、インキュベーション、洗浄液の廃棄という洗浄
操作を数回繰り返すことにより行われるが、これらの煩
雑な操作を迅速簡便に行うために様々な技術が開発され
ている。例えば、一次抗体を担持させた担体（一次担
体）としてラテックス等の不溶性粒子を利用した測定法
は、フィルターにより迅速簡便にＢ／Ｆ分離が実施でき
ることから自動化しやすいという特徴があり、広く用い
られている。また、担体として磁性粒子を用いた測定法
は、磁力を利用して更に簡便にＢ／Ｆ分離を行うことが
できる方法として知られている。

【０００６】従って、臨床的に有用なＰＩＶＫＡ−IIに
ついても、このような技術を応用して迅速簡便に測定を
行う方法の開発が望まれていた。また、特にこのような
粒子を担体として利用した測定法においては、測定条件
によって溶液中の粒子が不安定になり凝集しやすくなっ
たり、または、用いる試料や測定対象によっては担体に
担持された抗体と非特異的に反応する因子が存在し、該
因子が担体を凝集させることにより二次反応が阻害され
て負の測定誤差を生じるという問題点があることが解っ
てきた。このような問題点はＰＩＶＫＡ−IIの測定にお
いても生じることが明らかになり、測定の精度や安定性
が損なわれ、全自動化を困難にしていた。従って、これ
らの問題点を解決し、臨床的に非常に有用なＰＩＶＫＡ
−IIの測定を、精度良く簡便に行う方法の開発が望まれ
ていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、精度が良く
安定的で、かつ簡便なＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法
を提供することを解決すべき課題とする。本発明はま
た、精度が良く安定的で、かつ簡便なＰＩＶＫＡ−IIの
免疫学的測定を可能にするＰＩＶＫＡ−II測定用試薬お
よびＰＩＶＫＡ−II測定用キットを提供することを解決
すべき課題とする。

【０００８】

【課題を解決する手段】本発明者らは、上記課題を解決
するために鋭意検討した結果、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を
担持させた粒子状担体を用いるＰＩＶＫＡ−IIの免疫学
的測定法において、該担体の凝集を阻害する物質の存在
下において該担体と該試料とを接触させることにより、
該担体の凝集を阻害することができ、その結果、測定誤
差を回避できることを見出した。本発明は、これらの知
見に基づいて成し遂げられたものである。

【０００９】すなわち、本発明によれば、抗ＰＩＶＫＡ
−II抗体を担持させた粒子状担体を用いて試料中のＰＩ
ＶＫＡ−IIを免疫学的に測定する方法において、該担体
の凝集を阻害する物質の存在下において該担体と該試料
とを接触させることを特徴とするＰＩＶＫＡ−IIの免疫
学的測定法が提供される。

【００１０】本発明の好ましい態様によれば、担体の凝
集を阻害する物質が、試料中に存在する担体を凝集させ
る因子に対する抗体であることを特徴とする測定法；担
体の凝集を阻害する物質が、ヒトのＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＧもしくはＩｇＭの部分鎖、または、ＩｇＧもしくは
ＩｇＭの部分ペプチドに対する抗体であることを特徴と
する測定法；担体の凝集を阻害する物質が、ヒトＩｇＭ
のＨ鎖に対する抗体であることを特徴とする測定法；担
体の凝集を阻害する物質と試料とを反応させた後、これ
と抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を接触
させることを特徴とする測定法；粒子状担体の粒径が
０．０５〜１０μｍであることを特徴とする測定法；担
体が磁性担体であることを特徴とする測定法；担体が高
分子担体であることを特徴とする測定法；抗ＰＩＶＫＡ
−II抗体が標識されていることを特徴とする測定法；免
疫学的測定法が、第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体、及び該
抗体とは異なる抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫ
Ａ−II抗体を用いるサンドイッチ法であることを特徴と
する測定法；第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体および／又は
第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体が標識されていることを特
徴とする測定法；第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体が状担体
に担持されていることを特徴とする測定法；担体が標識
されていることを特徴とする測定法；並びに、（１）抗
ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体と試料とを
接触させて抗ＰＩＶＫＡ−II抗体と試料中のＰＩＶＫＡ
−IIとを反応させる工程、及び（２）粒子状担体の凝集
の度合いを測定することにより、該試料中に存在するＰ
ＩＶＫＡ−IIの量を測定する工程を含むことを特徴とす
る測定法：が提供される。

【００１１】本発明の別の側面によれば、抗ＰＩＶＫＡ
−II抗体を担持させた粒子状担体の凝集を阻害する物質
を含有することを特徴とする、ＰＩＶＫＡ−II測定用試
薬が提供される。

【００１２】本発明のさらに別の側面によれば、少なく
とも、（１）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状
担体を含む試薬、及び（２）該担体の凝集を阻害する物
質を含む試薬を含むことを特徴とするＰＩＶＫＡ−II測
定用キットが提供される。本発明の好ましい態様によれ
ば、前記抗ＰＩＶＫＡ−II抗体とは異なる抗原決定基を
認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を含有する試薬を
さらに含むことを特徴とするキット；並びに、（１）抗
ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を含む試
薬、及び（２）該担体の凝集を阻害する物質を含む試薬
が、同一の懸濁液に含有されていることを特徴とする、
キットが提供される。

【００１３】本発明のさらに別の側面によれば、抗ＰＩ
ＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体および該抗体と
は異なる抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II
抗体を用いてＰＩＶＫＡ−IIを免疫学的に測定する方法
において、該担体の粒径が０．０５〜４μｍであること
を特徴とするＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法が提供さ
れる。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。本発明においてＰＩＶＫＡ−II（Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｖｉｔａｍｉｎ
Ｋ Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ
II）とは、ビタミンＫ依存性血漿蛋白質の一つであるプ
ロトロンビンの前駆物質で、アミノ末端領域にある１０
個のグルタミン酸残基についてのγ−カルボキシル化の
程度が不完全なものを指して言う。この蛋白質には、通
常、１０個のグルタミン酸残基が存在しており、その中
のいくつかがγ−カルボキシル化を受けているかにより
数種類のＰＩＶＫＡ−IIが混在した状態で存在してい
る。

【００１５】本発明の免疫学的測定法は、試料中のＰＩ
ＶＫＡ−IIの測定を目的としており、本発明においてＰ
ＩＶＫＡ−IIとは、特に断らない限り、数種類のＰＩＶ
ＫＡ−IIが混在しているものを意味する。本発明で用い
る試料の種類は特に限定されないが、好ましくは生物学
的試料であり、例えば、被験者の血液、血清、血漿、
尿、唾液等の体液、種々の細胞、組織やそれらの抽出液
等が挙げられる。

【００１６】本発明のＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法
は、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を用
いて試料中のＰＩＶＫＡ−IIを免疫学的に測定する方法
である。

【００１７】本発明において粒子状担体に担持される抗
ＰＩＶＫＡ−II抗体は、抗原抗体反応によりＰＩＶＫＡ
−IIと特異的に結合する抗体であればいかなるものでも
よいが、ＰＩＶＫＡ−IIがプロトロンビンの前駆物質
で、アミノ末端領域にある１０個のグルタミン酸残基の
γ−カルボキシル化の程度が不完全なものであることか
ら、ＰＩＶＫＡ−IIと反応するがプロトロンビンとは反
応しない抗体を用いることが好ましい。このような抗体
としては、例えば、１０個のグルタミン酸残基を含むア
ミノ末端領域に対する抗体が挙げられる。

【００１８】本発明で用いる抗ＰＩＶＫＡ−II抗体とし
てはポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよ
いが、好ましくはモノクローナル抗体である。なお、抗
ＰＩＶＫＡ−II抗体は公知であり、例えば、特開昭６０
−６０５５７号公報、特開平５−２４９１０８号公報、
及び特開平７−３１３１８６号公報（これら公開特許公
報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明
細書中に引用するものとする）に記載の方法、又は当業
者に公知の通常の抗体取得方法により取得することがで
きる。

【００１９】抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体の作
成方法の一例を以下に示す。先ず、ワーファリン服用者
血漿よりＢａＳＯ₄ 、ＢａＣＯ₃処理してヒトプロトロ
ンビンを吸着除去し、次にＤＥ−５２ Ｃｅｌｌｕｌｏ
ｓｅによるイオン交換をおこない、最後にＰＩＶＫＡ−
IIおよび正常プロトロンビンと反応する抗プロトロンビ
ン抗体を用いたアフィニティーカラムに吸着せしめ、４
Ｍ塩酸グアニジンで溶出し、透析し、濃縮して精製ＰＩ
ＶＫＡ−IIを得る。次にこの精製ＰＩＶＫＡ−IIをマウ
スに免疫してその脾臓細胞を採取し、Ｋｏｅｈｌｅｒ
Ｇ．等の方法（ＫｏｅｈｌｅｒＧ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
Ｃ．Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔ
ｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ａ
ｎｄ ｔｕｍｏｒ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉ
ｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６；６：５
１１−９）によりミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と細胞融合
し、限界希釈法により３回クローニングを行うことによ
り、正常プロトロンビンとは反応せずにＰＩＶＫＡ−II
とのみ反応する抗体産生セルラインとして確立される細
胞が分泌するモノクローナル抗体を抗ＰＩＶＫＡ−IIモ
ノクローナル抗体として取得することができる。

【００２０】抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させる粒子状
担体としては、測定に用いられる種々の溶液に実質的に
不溶性のものであれば特に限定されないが、磁性粒子、
ポリスチレン等の高分子またはそのラテックス、ゼラチ
ン、リポソーム、赤血球などの生体成分等を用いるのが
好ましい。中でも、迅速簡便なＢ／Ｆ分離を実現する観
点においては磁性粒子が特に好ましく、具体的には、例
えば、四酸化三鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）、三酸化二鉄（Ｆｅ
₂Ｏ₃）、種々のフェライト、鉄、マンガン、ニッケル、
コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マ
ンガンなどの合金からなる微粒子等の磁性粒子が好まし
く用いられる。また、これらの磁性粒子を、ポリスチレ
ン等の高分子のラテックスや、ゼラチン、リポソーム、
赤血球などの生体成分等の内部に含まれる形で調製した
り、表面に固定化したものを好ましく用いることができ
る。

【００２１】このような粒子状担体を用いた免疫学的測
定におけるＢ／Ｆ分離は、フィルター法、二抗体法、沈
降法等により行うことができるが、磁性粒子の場合には
磁力を利用して迅速簡便に行うことができる。これらの
担体の粒径は、精度良くＢ／Ｆ分離を行うことができれ
ばいかなる大きさでもよいが、粒径が小さすぎると分離
の効率が悪く、凝集し易くなり、大きすぎると沈殿し易
くなる。従って、粒径の下限は、０．０５μｍ、好まし
くは０．１μｍ、上限は１０μｍ、好ましくは４μｍ、
より好ましくは２μｍが適当であり、粒径の範囲はこれ
ら上限と下限の組み合わせから選ばれる。担体の粒径の
具体的範囲としては、通常、０．０５〜１０μｍ、好ま
しくは０．０５〜４μｍ、より好ましくは０．１〜２μ
ｍが適当である。

【００２２】上記したような担体に抗ＰＩＶＫＡ−II抗
体を担持させる方法としては、それ自体既知の通常用い
られる方法により行うことができる。具体的には、例え
ば、化学結合法、物理吸着法等が挙げられ、中でも化学
結合法が好ましく用いられる。物理的に吸着させる方法
としては、不溶性磁性粒子に、抗体または抗原を直接固
定化する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に化学
的に結合させてから吸着させて固定化する方法が挙げら
れる。化学的に担持させる方法としては、磁性粒子の表
面に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト
基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを
化学的に修飾することにより抗体または抗原分子と結合
させることができる官能基を利用して、直接粒子上に固
定化する方法、粒子と抗体または抗原分子の間にスペー
サー分子を化学結合で導入して固定化する方法、アルブ
ミンなどの他のタンパク質に抗体または抗原を化学結合
させた後、そのタンパク質を粒子に化学結合させる方法
が挙げられる。その他、固定化したい抗体または抗原と
特異的に結合する物質（たとえば抗体、プロテインＡな
ど）を粒子表面に物理的または化学的に結合させた後、
目的の抗体または抗原を結合させることにより粒子表面
に固定化する方法も挙げられる。これらの方法の詳細に
ついては、特開平６−１６０３８７号公報等にも開示さ
れている。

【００２３】本発明の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させ
た担体を用いるＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法の一例
としては、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体と試料中のＰＩＶＫＡ
−IIとを反応させた後に、担体の凝集の度合いを測定す
ることにより、該試料中に存在するＰＩＶＫＡ−IIの量
を測定する方法が挙げられる。

【００２４】具体的には、例えば、ラテックス凝集反
応、赤血球凝集反応、ゼラチン凝集反応、金属コロイド
凝集反応等の、担体の凝集の度合いがすなわち反応の強
度として得られる測定法が挙げられる。これらの凝集反
応は、比濁法、沈降法、粒子を直接計数する方法等によ
ってその凝集度合いを測定することができる。例えば、
ラテックス凝集反応を用いた測定法の場合は、抗ＰＩＶ
ＫＡ−II抗体を担持させたポリスチレン等のラテックス
を試料と接触させた後、試料中に存在するＰＩＶＫＡ−
IIによって生じた担体の凝集度合いを吸光度や散乱光測
定法等の光学的方法により測定すればよい。

【００２５】しかしここで、試料中に上記担体を凝集さ
せる因子が存在すると、ＰＩＶＫＡ−IIに由来しない非
特異的な凝集が生じるために測定値に誤差を生じる可能
性がある。試料中に上記担体を凝集させる因子が存在す
る可能性がある場合は、該因子の活性を阻害する物質の
存在下で試料と担体とを接触させることによって、精度
良く安定的な測定を行うことができる。また、溶液中に
おける担体の分散状態が不安定になるために凝集が生じ
る場合には、溶液中での担体の安定性を増すことによっ
て該担体の凝集を阻害する物質を添加することにより、
安定的な測定を行うことができる。すなわち、本発明の
好ましい態様によれば、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持さ
せた粒子状担体を用いて試料中のＰＩＶＫＡ−IIを免疫
学的に測定する方法において、該担体の凝集を阻害する
物質の存在下において該担体と該試料とを接触させるこ
とを特徴とするＰＩＶＫＡ−IIの測定方法が提供され
る。

【００２６】上記発明における免疫学的測定法として、
例えば、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光
法、電気化学発光法、放射免疫測定法等の標識化免疫測
定法を好ましく用いることができる。

【００２７】これらの方法を用いる場合、より精度の高
い測定のためには、担体に担持された抗ＰＩＶＫＡ−II
抗体（第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体）と、該抗体とは異
なる抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体
とを用いるサンドイッチ法による測定が特に好ましい。
ここで第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体としては、第１の抗
ＰＩＶＫＡ−II抗体とは異なる抗原決定基を認識してＰ
ＩＶＫＡ−IIと特異的に結合する抗体であればいかなる
ものでもよいが、例えば、抗プロトロンビン抗体（ＰＩ
ＶＫＡ−IIとプロトロンビンの共通抗原に対する抗体）
や、１０個のグルタミン酸残基を含むアミノ末端領域中
に存在する、第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体とは異なる抗
原決定基を認識する抗体等が挙げられる。これらの中
で、抗プロトロンビン抗体が好ましく用いられる。

【００２８】本発明で用いることができる抗プロトロン
ビン抗体は、好ましくは、トロンビンと反応しない抗プ
ロトロンビン抗体である。このような抗プロトロンビン
抗体は例えば以下の方法により作製することができる。
まず、新鮮ヒト血漿よりＳｈａｐｉｒｏ等（Ｓｈａｐｉ
ｒｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｔｈｒ
ｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｐｈ．，１９６６；
１６：４６９−９０）の方法により精製ヒトプロトロン
ビンを得る。次にこのヒトプロトロンビンでウサギを免
疫し、採血して抗血清を得る。抗血清に硫酸アンモニウ
ムを加えて塩析し、透析後、ＤＥ−５２Ｃｅｌｌｕｌｏ
ｓｅでイオン交換する。これを、ヒトプロトロンビンア
フィニティ カラムにかけ、４Ｍ塩酸グアニジンで溶出
して抗ヒトプロトロンビンウサギＩｇＧ抗体を得る。透
析して塩酸グアニジンを除去後トロンビンアフィニティ
カラムにかけて、素通り分画を採取し、トロンビンと反
応しない抗プロトロンビン抗体とする。また上記のポリ
クローナル抗体の他に、精製ヒトプロトロンビンをマウ
スに免疫してその脾臓細胞を採取し、上記したＫｏｅｈ
ｌｅｒ Ｇ．等の方法によりミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１
と細胞融合し、限界希釈法により３回クローニングをお
こない、トロンビンと反応せずにＰＩＶＫＡ−IIおよび
正常プロトロンビンと反応する抗プロトロンビン抗体産
生セルラインとして確立される細胞が分泌するモノクロ
ーナル抗体をトロンビンと反応しない抗プロトロンビン
抗体として使用することもできる。

【００２９】第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体は、抗ＰＩＶ
ＫＡ−II抗体と同様に担体に担持させてもよい。該担体
としては、前記の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体の担持に用いる
ものと同様に適宜選択して用いればよい。この場合、第
１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を磁性粒子に担持させた場合
は、簡便にＢ／Ｆ分離を行うために、磁性を有さない粒
子が好ましく用いられる。このような担体としては、前
記したポリスチレン等の高分子またはそのラテックス、
ゼラチン、リポソーム、赤血球のような生体成分等が挙
げられる。

【００３０】サンドイッチ法を用いて測定を行う場合に
は、第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体または第２の抗ＰＩＶ
ＫＡ−II抗体を、用いる測定法に応じて標識する。標識
物質としては、例えば、酵素免疫測定法ではＨＲＰ（Ｈ
ｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ア
ルカリフォスファターゼ等の酵素が挙げられ、蛍光免疫
測定法ではＥｕ（ユーロピウム）等の蛍光物質が、放射
免疫測定法では¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹⁴Ｃ等の放射性同位元素
が挙げられる。また、第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体また
は第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を標識するのではなく、
いずれかの担体を標識する方法が、本発明において好ま
しく用いられる。該担体を標識する物質も、用いる測定
法に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光免疫
測定法により測定を行う場合には蛍光物質であればいず
れも使用できるが、Ｅｕ（ユーロピウム）、Ｔｂ（テル
ビウム）、Ｓｍ（サマリウム）等の希土類キレートが特
に好ましく用いられる。

【００３１】具体的には、例えば、抗ＰＩＶＫＡ−II抗
体（一次抗体）を担持させた担体と試料とを接触（一次
反応）させた後、Ｂ／Ｆ分離を行い、標識化担体に担持
された抗プロトロンビン抗体（二次抗体）または標識化
抗プロトロンビン抗体との二次反応を行って、反応によ
り形成された免疫複合体の蛍光、発光、酵素活性、放射
能等の標識物質のシグナルを測定する。この場合、試料
中に該担体を凝集させる因子が存在すると非特異的な凝
集が生じてしまい、二次抗体の反応を妨げたり、蛍光や
化学発光の検出を妨害する等により測定値に誤差を生じ
る。しかし、本発明の方法を用いて、該因子の活性を阻
害する物質の存在下で接触させることによって、このよ
うな測定誤差を回避し、精度良く安定的な測定を簡便に
行うことができる。また、溶液中において担体の分散状
態が不安定になるために凝集が生じてしまう場合には、
溶液中での担体の安定性を増すことによって該担体の凝
集を阻害する物質を添加することにより、安定的な測定
を行うことができる。本発明の方法は、一次抗体および
二次抗体の両方が担体に担持されている場合に、特に好
適である。

【００３２】本発明で用いることができる担体の凝集を
阻害する物質としては、試料中に存在する担体を凝集さ
せる因子を認識してこの活性（即ち、担体を凝集させる
活性）を阻害するものであれば特に限定されないが、具
体的には、例えば、該因子に対する抗体が挙げられる。
このような抗体としては、例えば、ヒトのＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＧもしくはＩｇＭの部分鎖、または、ＩｇＧも
しくはＩｇＭの部分ペプチドに対する抗体が挙げられ
る。ＩｇＧもしくはＩｇＭの部分鎖に対する抗体として
は、例えば、Ｈ鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）、Ｌ鎖
（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）、Ｊ鎖（ｊｏｉｎｉｎｇ
ｃｈａｉｎ）等に対する抗体が挙げられ、ＩｇＧもしく
はＩｇＭの部分ペプチドに対する抗体としては、例え
ば、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント、Ｆｃフラグメント、
ｐＦｃ’フラグメント等に対する抗体が挙げられる。中
でも、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法においては、Ｉ
ｇＭのＨ鎖に対する抗体である抗μ抗体が特に好ましく
用いられる。これらの抗体はポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体のいずれを用いても良いし、取得に用い
る動物種も限定されるものではない。また、これらの抗
体はそれ自体既知の通常用いられる方法により取得して
用いてもよいし、市販のものを任意に選択して用いるこ
ともできるが、目的の抗体以外の抗体や他の物質をでき
るだけ排除するために、アフィニティカラム等を用いて
十分に精製してから用いることが好ましい。また、溶液
中において粒子状担体の分散状態が不安定になるために
凝集が生じてしまう場合には、溶液中において該担体の
分散状態の安定性を増す効果を有する物質を、本発明の
担体の凝集を阻害する物質として添加してもよい。その
ような物質としては、例えば、種々の界面活性剤、蛋白
質等が挙げられる。

【００３３】免疫測定系中の担体を凝集させる因子の活
性を阻害する物質の添加濃度としては、ＰＩＶＫＡ−II
の測定精度に問題がない程度に該因子の活性を阻害しう
る濃度であれば特に限定されず、用いる該物質の種類・
力価等によって最適な濃度を決めることができる。具体
的な添加濃度は、後記する方法によりその効果を測定し
て決めればよい。具体的には、抗体の添加濃度として
は、例えば、抗μ抗体の場合には、下限が０．１ｍｇ／
ｍｌ、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ、上限が２０ｍｇ／ｍ
ｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ、濃度範囲としては、
０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍ
ｌ程度が適当である。

【００３４】また、上記したような担体を凝集させる因
子の活性を阻害する物質の添加方法としては、試料にあ
らかじめ添加することにより該試料中に存在する担体を
凝集させる因子の活性を阻害し、その後に上記担体と接
触させてもよいし、該担体を含む溶液等にあらかじめ添
加して調製し、この溶液を試料に接触させることによっ
て該因子の活性を阻害してもよい。

【００３５】このような担体の凝集を阻害する物質の添
加の効果は、抗原の添加回収率を測定する方法、担体の
凝集度合いを測定する方法等によって判定することがで
きる。ここで、抗原の添加回収率とは、測定された抗原
の量を添加した抗原の量で除して１００を乗じた値
（％）である。すなわち、実験的に目的の抗原を添加す
ることにより存在する抗原量が既知である測定系を用い
て、上記した物質を添加した場合と添加しない場合の測
定値を得て、抗原の添加回収率を求めることにより、該
物質の添加効果を判定することができる。

【００３６】一方、担体の凝集度合いを測定することに
より該物質の添加効果を判定する方法としては、例え
ば、該物質を添加した場合と添加しない場合の担体の凝
集度合いを比較してもよいし、サンドイッチ法を用いた
場合には、一次反応時と二次反応時の凝集の度合いを比
較してもよい。具体的には、例えば、蛍光免疫測定法を
用いてサンドイッチ法によりＰＩＶＫＡ−IIの測定を行
う場合には、測定と平行して任意の波長における反応液
の吸光度(Ａ)の測定を行い、得られた値を用いて、以下
の式から凝集度合いを求めることができる。

【００３７】凝集度合い（％）＝（（一次反応時の反応
液のＡ−二次反応時の反応液のＡ）／一次反応時の反応
液のＡ）×１００

【００３８】測定を行う吸光度の波長としては、吸収曲
線が最大値を示す波長において測定を行うのが好ましい
が、担体の粒径によって吸収曲線が変化するので、用い
た担体の粒径に基づいて任意に決定すればよい。

【００３９】定量を行う場合は、予め既知の濃度のＰＩ
ＶＫＡ−IIを試料として測定を行い、得られた定量値を
試料のＰＩＶＫＡ−II濃度に対して図示することにより
検量線が得られるので、濃度未知の試料の反応定量値か
らＰＩＶＫＡ−IIの濃度を求めることができる。

【００４０】本発明の試薬は、少なくとも、抗ＰＩＶＫ
Ａ−II抗体を担持させた粒子状担体の凝集を阻害する物
質を含有し、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定に用いられ
るものである。例えば、該物質として抗μ抗体を用いる
場合には、該抗体を０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ程度含有す
る溶液等の形態で調製することができる。このような試
薬を用いれば、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定を精度良
く安定的に、かつ簡便に行うことができる。

【００４１】本発明のキットは、少なくとも、（１）抗
ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子状担体を含む試
薬、及び（２）該担体の凝集を阻害する物質を含む試薬
を含み、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定に用いられるも
のである。また、前記抗ＰＩＶＫＡ−II抗体とは異なる
抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を含
有する試薬をさらに含んでいてもよい。抗ＰＩＶＫＡ−
II抗体を担持させた粒子状担体を含む試薬、及び該担体
の凝集を阻害する物質を含む試薬は、同一の懸濁液に含
有されていてもよい。上記試薬の形態は特に限定され
ず、液体でも固体でもよく、液体の形態も懸濁液又は溶
液など任意の形態とすることができる。

【００４２】本発明のキットは、本発明の免疫学的測定
法を行うことができるものであればいかなる構成のもの
でもよく、例えば、前記した懸濁液の他に、反応希釈
液、基質溶液、基質溶解液、洗浄液、反応停止液等を含
んでいてもよい。このようなキットを用いることによ
り、ＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定を迅速簡便に、か
つ、精度良く安定的に行うことができる。以下に、実施
例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は
以下の実施例により限定されるものではない。

【００４３】

【実施例】なお、本実施例において用いた抗ＰＩＶＫＡ
−IIモノクローナル抗体、抗プロトロンビン抗体、ＰＩ
ＶＫＡ−II抗原はいずれも特開昭６０−６０５５７号公
報、特開平５−２４９１０８号公報に記載の方法により
調製したものである。

【００４４】実施例１：試薬類の調製 標識物質としてＥｕ（ユーロピウム）を用いた蛍光免疫
測定法により、ＰＩＶＫＡ−IIの測定を行うこととし
た。まず、試薬類の調製を行った。（１）溶液の調製 （ａ）反応溶液：０．１５Ｍトリス緩衝液(ｐＨ８．
０)、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２
０、０．１％ ＮａＮ₃、０．１％ Ｂｅｎｚａｍｉｄ
ｉｎｅ、０．５％ ＥＤＴＡ、０．５％ ＢＳＡ （ｂ）洗浄液：ＬＰＩＡ−Ａ７００用ＢＦ液（三菱化学
社製） （ｃ）アルカリ液：ＬＰＩＡ−Ａ７００用アルカリ液
（三菱化学社製）

【００４５】（２）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた
Ｍｇラテックス試薬の調製 平均粒径１．０９μｍの磁性体含有ポリスチレンラテッ
クス（ローヌプーラン社製；以下、これを「Ｍｇラテッ
クス」と称する）に、抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル
抗体（特開昭６０−６０５５７号公報、特開平５−２４
９１０８号公報に記載の方法により調製）を、カルボジ
イミドを用いて化学結合法により固定化した。その後、
ＢＳＡで処理することにより粒子を安定化させ、緩衝液
に０．１％の濃度で懸濁させて、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体
を担持させたＭｇラテックス試薬とした。

【００４６】（３）抗プロトロンビン抗体を担持させた
Ｅｕラテックス試薬の調製 Ｅｕキレート化合物であるＥｕＮＴＡ（ユーロピウム−
ナフトイルトリフルオロアセトン）化合物１×１０^-4モ
ルと、ＴＯＰＯ（トリオクチルホスホスフィンオキシ
ド）２×１０^-4モルをアセトン４０ｇに溶解した後、平
均粒径０．２１μｌのポリスチレンラテックス（セラダ
イン社製）３ｇを水４０ｍｌに懸濁させたものと混合し
た。混合物中のアセトンをエバポレーターにより除去し
て、ラテックス粒子にＥｕＮＴＡをＴＯＰＯと協同抽出
させ、Ｅｕキレートで標識されたラテックス（以下、Ｅ
ｕラテックスと称する。）を調製した。ＴＯＰＯとの協
同抽出によりＥｕキレート化合物をラテックス内部に閉
じこめる方法は、特開昭５４−１０１４３９号公報等に
記載の方法に従って行った。

【００４７】ＥｕラテックスにもＭｇラテックスと同様
に化学結合法で抗プロトロンビン抗体（特開昭６０−６
０５５７号公報、特開平５−２４９１０８号公報に記載
の方法により調製）を固定化し、ＢＳＡで処理した後、
０．００３％の濃度で緩衝液に懸濁して抗プロトロンビ
ン抗体を担持させたＥｕラテックス試薬を調製した。

【００４８】実施例２：ＬＰＩＡ−Ａ７００による蛍光
免疫測定 後述する（１）〜（５）については、すべて以下に示す
方法に従い、全自動分析装置ＬＰＩＡ−Ａ７００（三菱
化学社製）を用いて測定を行った。標識物質として用い
たＥｕ（ユーロピウム）は励起されてから蛍光を発する
までにタイムラグを有するので、ＬＰＩＡ−Ａ７００を
用いた時間分解蛍光免疫測定を行った。

【００４９】まず、反応溶液１００μｌ、脱イオン水１
２４μｌ、サンプル２６μｌ、Ｍｇラテックス試薬５０
μｌをキュベット中にて混合し、３７℃で４分３０秒間
反応（一次反応）させたのち、Ｍｇラテックスを磁石で
トラップしながらＢＦ液で洗浄することにより、Ｂ／Ｆ
分離を行った。キュベット中のＭｇラテックスに反応溶
液１００μｌ、脱イオン水１００μｌ、Ｅｕラテックス
試薬１００μｌを加えて混合し、３７℃で１２分反応
（二次反応）させた。反応後、一次反応と同様にＭｇラ
テックスを磁石でトラップしながらＢＦ液で洗浄した。
キュベット中のＭｇラテックスにアルカリ液４００μｌ
を添加して処理し、ＥｕラテックスとＭｇラテックスと
の結合をはずした。処理後、磁石によりＭｇラテックス
をトラップしてアルカリ液を分取し、ＬＰＩＡ−Ａ７０
０を用いてアルカリ液中に残存したＥｕラテックスに由
来する遅延蛍光の量を測定して、検体中のＰＩＶＫＡ−
II量を求めた。

【００５０】また、反応と平行してＬＰＩＡ−Ａ７００
により波長５４０ｎｍにおける反応液の吸光度(Ａ₅₄₀)
を測定し、得られた値を用いて、以下の式からＭｇラテ
ックスの凝集度合いを求めた。

【００５１】凝集度合い（％）＝（（一次反応時の反応
液のＡ₅₄₀−二次反応時の反応液のＡ₅₄₀）／一次反応時
の反応液のＡ₅₄₀）×１００

【００５２】（１）担体を凝集させる因子の活性を阻害
する物質の添加効果 ９例の正常人ヒト血清にＰＩＶＫＡ−II抗原（エーザイ
社製）を４００ｍＡＵ／ｍｌとなるように添加して、測
定用サンプルとした。反応溶液には、担体を凝集させる
因子の活性を阻害する物質としてヤギ抗μ抗体（ＩＩＣ
社製）を３ｍｇ／ｍｌを加え、ヤギ抗μ抗体無添加の対
象と抗原の添加回収率を比較した。抗原の添加回収率
は、測定された抗原の量を、添加した抗原の量で除して
１００を乗じた値（％）である。その結果、ヤギ抗μ抗
体を添加した系ではＭｇラテックスの凝集が抑制されて
おり、添加回収率が安定していることが解った。ヤギ抗
μ抗体無添加の場合の結果を図１に、ヤギ抗μ抗体を添
加した場合の結果を図２に示した。

【００５３】（２）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体と他の抗体に
おける、担体を凝集させる因子の活性を阻害する物質の
添加効果の比較 担体を凝集させる因子を含むことをあらかじめ確認した
ヒト血清をサンプルとして用いた。反応溶液にヤギ抗μ
抗体を３ｍｇ／ｍｌ加え、ヤギ抗μ抗体無添加の対象と
Ｍｇラテックスの凝集度合いを比較した。Ｍｇラテック
スとしては、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させたＭｇラ
テックス試薬の他に、抗ＰＩＶＫＡ−II抗体と同様の方
法で抗ＨＢｓＡｇ抗体（３Ａ１０Ｆ３、１５Ａ３、８Ｈ
５の３クローン）または抗Ｔ３抗体（Ｅ２０４２５の１
クローン）を担持させたＭｇラテックス、及び、抗体を
担持していないＭｇラテックス（抗体なし）を使用し
た。抗ＨＢｓＡｇ抗体は、公知の方法に従って組換えＨ
ＢｓＡｇ蛋白質およびモノクローナル抗体の調製を行
い、得られたクローンの中から特異性や感度等に優れた
クローンとして上記３クローンを選択して用いた。抗Ｔ
３抗体は、バイオデザイン社製のものを用いた。

【００５４】その結果、上記サンプルを用いると抗ＰＩ
ＶＫＡ−IIを担持させたＭｇラテックスは強く凝集する
が、反応溶液にヤギ抗μ抗体を３ｍｇ／ｍｌ添加するこ
とにより凝集を顕著に抑制できることが示された。ま
た、他の４種の抗体では凝集は起こらず、ヤギ抗μ抗体
の添加による影響もないことが確認できた。これによ
り、本発明がＰＩＶＫＡ−IIの測定に非常に有効である
ことが示された。結果を図３に示した。

【００５５】（３）試作キットを用いた測定１（検量線
の作成） 担体を凝集させる因子の活性を阻害する物質として１５
ｍｇ／ｍｌの抗μ抗体を含むキットの試作品を作製し、
これを用いてＬＰＩＡ−Ａ７００による全自動測定を行
った。ＰＩＶＫＡ−II抗原をそれぞれ０、２０、４０、
１００、１０００、１００００、３００００、５０００
０ｍＡＵ／ｍｌとなるように調製した緩衝液をサンプル
とした。その結果、３００００ｍＡＵ／ｍｌまでは十分
に定量的な測定濃度領域が得られることが確認された。
結果を図４に示す。

【００５６】（４）試作キットを用いた測定２（感度の
検討） 上記（３）と同じ試作キットを用いて、ＬＰＩＡ−Ａ７
００による測定を行った。ＰＩＶＫＡ−II抗原をそれぞ
れ０、１０、２０、３０、４０ｍＡＵ／ｍｌとなるよう
に調製した緩衝液をサンプルとし、Ｎ＝１０で測定した
（Ｎはサンプル数）。得られた値を±２ＳＤ法により解
析した結果、感度、すなわち定量的測定が可能な抗原の
最低濃度は１０ｍＡＵ／ｍｌと求められた。これは、全
自動の蛍光免疫測定法においては十分に高い感度であっ
た。結果を図５に示す。

【００５７】（５）試作キットを用いた測定３（従来技
術との比較） 上記（３）および（４）と同じ試作キットを用いて、Ｌ
ＰＩＡ−Ａ７００による測定を行った。サンプルとして
は、３００人より採取した血清検体を用いることとし、
対照として、電気化学発光免疫測定法を用いた分析装置
であるピコルミ８２２０（エーザイ社製）による測定を
行った。測定後、ＬＰＩＡ−Ａ７００による測定値と、
ピコルミ８２２０による測定値との相関性をプロットし
て解析したところ、図６に示したように相関計数は０．
９９と高い値を示した。

【００５８】一般にピコルミ８２２０で用いられている
電気化学発光免疫測定法は、ＬＰＩＡ−Ａ７００で用い
られている蛍光免疫測定法に比して感度が高く、高い精
度を得られることが知られている。しかし、上記の結果
より、本発明の方法および該方法を行うキットを用いれ
ば、蛍光免疫測定法を用いた全自動分析装置であるＬＰ
ＩＡ−Ａ７００を用いても、ピコルミ８２２０と同等の
精度で安定的にＰＩＶＫＡ−IIの測定が行えることが示
された。

【００５９】

【発明の効果】本発明の方法を用いれば、抗ＰＩＶＫＡ
−II抗体を担持させた担体の凝集を回避し、精度良く安
定的にＰＩＶＫＡ−IIの測定を行うことができる。ま
た、本発明の方法を行うキットを用いれば、蛍光免疫測
定法を用いる全自動測定においても、高い感度で精度良
く測定を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２の（１）において、各サンプルに対し
てヤギ抗μ抗体を添加しなかった場合の凝集率および添
加回収率を示した図である。

【図２】実施例２の（１）において、各サンプルに対し
てヤギ抗μ抗体を添加した場合の凝集率および添加回収
率を示した図である。

【図３】本発明の方法が、他の抗原の測定に比べて、Ｐ
ＩＶＫＡ−IIの測定において特に有効であることを示し
た図である。

【図４】本発明のキットの試作品を用いて、ＬＰＩＡ−
Ａ７００による測定を行った場合の検量線の図である。

【図５】本発明のキットの試作品を用いて、ＬＰＩＡ−
Ａ７００による測定を行った場合の感度の図である。

【図６】本発明のキットの試作品を用いてＬＰＩＡ−Ａ
７００による測定を行った場合の測定値と、エーザイ社
製ピコルミ８２２０による測定値の相関を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/553 Ｇ０１Ｎ 33/553 (72)発明者 渡辺 啓祐 茨城県つくば市吉沼3495−７

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒子
   状担体を用いて試料中のＰＩＶＫＡ−IIを免疫学的に測
   定する方法において、該担体の凝集を阻害する物質の存
   在下において該担体と該試料とを接触させることを特徴
   とするＰＩＶＫＡ−IIの免疫学的測定法。
2. 【請求項２】 担体の凝集を阻害する物質が、試料中に
   存在する担体を凝集させる因子に対する抗体であること
   を特徴とする、請求項１に記載の測定法。
3. 【請求項３】 担体の凝集を阻害する物質が、ヒトのＩ
   ｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＧもしくはＩｇＭの部分鎖、また
   は、ＩｇＧもしくはＩｇＭの部分ペプチドに対する抗体
   であることを特徴とする請求項１又は２に記載の測定
   法。
4. 【請求項４】 担体の凝集を阻害する物質が、ヒトＩｇ
   ＭのＨ鎖に対する抗体であることを特徴とする請求項１
   から３の何れかに記載の測定法。
5. 【請求項５】 担体の凝集を阻害する物質と試料とを反
   応させた後、これと抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた
   粒子状担体を接触させることを特徴とする請求項１から
   ４の何れかに記載の測定法。
6. 【請求項６】 粒子状担体の粒径が０．０５〜１０μｍ
   であることを特徴とする、請求項１から５の何れかに記
   載の測定法。
7. 【請求項７】 担体が磁性担体であることを特徴とする
   請求項１から６の何れかに記載の測定法。
8. 【請求項８】 担体が高分子担体であることを特徴とす
   る請求項１から７の何れかに記載の測定法。
9. 【請求項９】 抗ＰＩＶＫＡ−II抗体が標識されている
   ことを特徴とする請求項１から８の何れかに記載の測定
   法。
10. 【請求項１０】 免疫学的測定法が、第１の抗ＰＩＶＫ
    Ａ−II抗体、及び該抗体とは異なる抗原決定基を認識す
    る第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を用いるサンドイッチ法
    であることを特徴とする請求項１から９の何れかに記載
    の測定法。
11. 【請求項１１】 第１の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体および／
    又は第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体が標識されていること
    を特徴とする、請求項１０に記載の測定法。
12. 【請求項１２】 第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体が担体に
    担持されていることを特徴とする請求項１０又は１１に
    記載の測定法。
13. 【請求項１３】 担体が標識されていることを特徴とす
    る請求項１２に記載の測定法。
14. 【請求項１４】 （１）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持さ
    せた粒子状担体と試料とを接触させて抗ＰＩＶＫＡ−II
    抗体と試料中のＰＩＶＫＡ−IIとを反応させる工程；及
    び （２）粒子状担体の凝集の度合いを測定することによ
    り、該試料中に存在するＰＩＶＫＡ−IIの量を測定する
    工程を含むことを特徴とする、請求項１から１３の何れ
    かに記載の測定法。
15. 【請求項１５】 抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒
    子状担体の凝集を阻害する物質を含有することを特徴と
    する、ＰＩＶＫＡ−II測定用試薬。
16. 【請求項１６】 少なくとも、（１）抗ＰＩＶＫＡ−II
    抗体を担持させた粒子状担体を含む試薬、及び（２）該
    担体の凝集を阻害する物質を含む試薬を含むことを特徴
    とするＰＩＶＫＡ−II測定用キット。
17. 【請求項１７】 前記抗ＰＩＶＫＡ−II抗体とは異なる
    抗原決定基を認識する第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を含
    有する試薬をさらに含むことを特徴とする請求項１６に
    記載のキット。
18. 【請求項１８】 （１）抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持さ
    せた粒子状担体を含む試薬、及び（２）該担体の凝集を
    阻害する物質を含む試薬が、同一の懸濁液に含有されて
    いることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載のキ
    ット。
19. 【請求項１９】 抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を担持させた粒
    子状担体および該抗体とは異なる抗原決定基を認識する
    第２の抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を用いてＰＩＶＫＡ−IIを
    免疫学的に測定する方法において、該担体の粒径が０．
    ０５〜４μｍであることを特徴とするＰＩＶＫＡ−IIの
    免疫学的測定法。