JPH0772155A

JPH0772155A - 抗原・抗体反応の測定方法

Info

Publication number: JPH0772155A
Application number: JP29073193A
Authority: JP
Inventors: Kozo Muramatsu; 興三村松; Takaaki Munebayashi; 孝明宗林; Chieko Namita; 千恵子波多
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1992-11-20
Filing date: 1993-11-19
Publication date: 1995-03-17

Abstract

(57)【要約】（修正有）【構成】測定しようとする抗原又は抗体に対する抗体
又は抗原を担持させた不溶性磁性粒子からなる第１試薬
と、測定しようとする抗原又は抗体とを反応容器の液体
媒体中で反応させる。不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去する。測定
しようとする抗原又は抗体に対する抗体又は抗原を担持
させた不溶性蛍光色素標識粒子からなる第２試薬と、反
応容器壁に付着した該不溶性磁性粒子とを液体媒体中で
反応させる。不溶性磁性粒子を磁場の作用により反応容
器壁に付着させ液体媒体及び未反応の不溶性蛍光色素標
識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応した不
溶性蛍光色素標識粒子の蛍光強度を測定する。【効果】迅速、簡便に反応結合物と未反応物を分離、
洗浄する操作が実施でき、かつ、通常のＦＩＡよりも測
定感度を上昇させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗原・抗体反応の測定方
法に関する。詳しくは、磁性粒子および蛍光標識粒子を
用いた抗原・抗体反応の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、抗原抗体反応を利用した免疫測定
法が種々の疾病の早期検出法や、極微量の物質の検出法
として知られている。高感度な免疫測定法には種々の方
法があり、抗体または抗原に標識物質として、放射性同
位体（ＲＩ）、酵素、蛍光物質、発光物質などを結合し
て用いるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノ
アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、
発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）などに分類される。ま
た、ラテックス等の不溶性担体粒子に担持された抗体ま
たは抗原と、それに対応する抗原または抗体とを反応さ
せ、その反応に伴う反応混合物の透過光の変化から抗原
抗体反応の速度を測定する方法（ＬＰＩＡ）が知られて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、かかる従来技
術は種々の問題を持つ。たとえば、ＲＩＡはＲＩの取扱
いおよび廃棄に対する制約がある。ＬＰＩＡは簡便性、
操作性などに優れた方法であるが、検出感度の改良が望
まれている。ＥＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡなどは取扱いの安
全性については有利であるが、検出感度はＲＩＡに若干
劣る。また、ＥＩＡは酵素反応を伴うため取扱いもＦＩ
Ａほど簡便ではない。ＬＩＡも、分離後、発光させるた
めに水酸化ナトリウムなどの試薬を加える必要があるた
めＦＩＡに比べると複雑であるいう欠点があった。

【０００４】ところで、ＥＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡなどの
方法は、通常、反応結合物と未反応物を分離、洗浄する
操作（Ｂ／Ｆ分離）を必要とするが、これらの方法にお
いて、測定操作を煩雑にし、時間のかかるものにしてい
る主な原因はこれらのＢ／Ｆ分離である。Ｂ／Ｆ分離と
しては、通常、チューブ、マイクロタイターウェルなど
の反応管から、未反応物を含む反応液を廃棄した後、洗
浄液の供給、インキュベーション、洗浄液の廃棄という
洗浄操作を数回繰り返すことが行われている。

【０００５】Ｂ／Ｆ分離を比較的迅速、簡便に行うため
にメンブレン、グラスファイバーなどのフィルターを利
用したものがある。これらは、液の流れる方向が一方向
であるため（液の廃棄時に吸い出す必要がない）、洗浄
工程に必要とする時間も短くてすみ、また、自動化など
装置化しやすい特徴がある。しかしながら、これらの方
法にも、種々の問題点がある。フィルターに一次抗体又
は抗原を直接結合させたものでは、フィルターと測定し
たい項目とが対応している必要があり、フィルターの保
管、供給などを考えると自動化装置とする場合に問題が
ある。

【０００６】また、ラテックス等の微粒子に一時抗体ま
たは抗原を結合し、反応後、フィルターに捕集するタイ
プのものでは、フィルター上に孔径より大きい粒子を捕
集するものと、フィルターへの粒子の吸着を利用するも
のがある。前者では、フィルターが目詰まりすることに
より二次抗体などの標識物が完全に洗浄しきれなくて、
バックグラウンドの上昇を生じる可能性がある。また、
後者では、フィルターへの吸着の原因が解明されていな
いため、粒子を完全に捕集しているかどうかの判断、ま
た、吸着しやすい素材を用いることによるバックグラウ
ンドの上昇などの問題が残る。また、フィルター内部へ
の吸着を利用するため、ＥＩＡには応用できるが、ＦＩ
Ａの場合、励起光がとどかない可能性もあり応用できな
い。

【０００７】一方、Ｂ／Ｆ分離の改良法として、磁性粒
子を用いたものも種々報告されている。この方法は、磁
力を利用して磁性粒子を集める操作を迅速、簡便にでき
る特徴がある。しかしながら、現在実用化されているも
のは、酵素、蛍光色素、発光色素、ＲＩなどを標識した
二次抗体を用いるため、測定感度が充分でないことがあ
る。特に、蛍光色素を標識したものは感度の点で問題が
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決すべく鋭意検討した結果、磁性粒子を用いること
により迅速、簡便にＢ／Ｆ分離が実施でき、かつ、蛍光
粒子を用いることにより通常のＦＩＡよりも測定感度を
上昇させた免疫分析方法を見出した。即ち本発明の要旨
は、下記の工程からなる抗原・抗体反応の測定方法、（ａ）測定しようとする抗原又は抗体に対する抗体又は
抗原を担持させた不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、
測定しようとする抗原又は抗体とを反応容器の液体媒体
中で反応させる。（ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。（ｃ）工程（ａ）と同一の測定しようとする抗原又は抗
体に対する抗体又は抗原を担持させた不溶性蛍光色素標
識粒子からなる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁に
付着した該不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応させ
る。（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性蛍光色素標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子
と反応した不溶性蛍光色素標識粒子の蛍光強度を測定す
る。および、下記の工程からなる抗原・抗体反応の測定方法
に存する。（ａ）測定しようとする抗体に対する抗原を担持させた
不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、測定しようとする
抗体とを反応容器の液体媒体中で反応させる。（ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。（ｃ）測定しようとする抗体の免疫グロブリンクラスと
特異的に反応する物質を担持させた不溶性蛍光色素標識
粒子からなる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁に付
着した該不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応させる。（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性蛍光色素標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子
と反応した不溶性蛍光色素標識粒子の蛍光強度を測定す
る。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
使用する不溶性磁性粒子は、たとえば、四三酸化鉄（Ｆ
ｅ₃Ｏ₄）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）、各種フェ
ライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムな
どの金属、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金か
らなる微粒子またはこれらの磁性粒子を内部に含んだポ
リスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニ
トリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポ
リエチレンテレフタレートなどの疎水性重合体、ポリア
クリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロ
リドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチ
ルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレ
ート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレー
ト）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレー
ト）、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架
橋した親水性重合体、またはそれぞれのモノマーの２−
４種程度の共重合体などのラテックス、ゼラチン、リポ
ソームまたは、上記磁性微粒子をラテックス、ゼラチ
ン、リポソームなどの表面に固定化した粒子などが用い
られる。

【００１０】不溶性磁性粒子の粒径は０．０５μｍ〜５
μｍのものが用いられ、０．１μｍ〜１μｍの範囲内の
粒径を有する不溶性磁性粒子が好ましい。不溶性磁性粒
子に抗体または抗原を担持させる方法としては、測定し
ようとする抗原又は抗体あるいは被検体中の抗原又は抗
体に対する抗体又は抗原を物理的に吸着させるか、ある
いは化学的に担持させることにより行われる。

【００１１】物理的に吸着させる方法としては、不溶性
磁性粒子に、抗体または抗原を直接固定化する方法、ア
ルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてか
ら吸着させて固定化する方法が挙げられる。化学的に担
持させる方法としては、磁性粒子の表面に存在するアミ
ノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル
基、アルデヒド基、エポキシ基などを化学的に修飾する
ことにより抗体または抗原分子と結合させることができ
る官能基を利用して、直接粒子上に固定化する方法、粒
子と抗体または抗原分子の間にスペーサー分子を化学結
合で導入して固定化する方法、アルブミンなどの他のタ
ンパク質に抗体または抗原を化学結合させた後、そのタ
ンパク質を粒子に化学結合させる方法が挙げられる。

【００１２】その他、固定化したい抗体または抗原と特
異的に結合する物質（たとえば抗体、プロテインＡ、な
ど）を粒子表面に物理的または化学的に結合させた後、
目的の抗体または抗原を結合させることにより粒子表面
に固定化する方法も挙げられる。不溶性磁性粒子に担持
させる抗体としては通常ＩｇＧが用いられるが、ペプシ
ン、パパインなどの消化酵素あるいはジチオスレイトー
ル、メルカプトエタノールなどの還元剤を用いて、Ｆ
（ａｂ′）₂、Ｆａｂ′、Ｆａｂなどの低分子化したも
のを用いても良い。また、ＩｇＧだけでなくＩｇＭある
いはこれをＩｇＧと同様の処理で低分子化したフラグメ
ントを用いても良い。また、モノクローナル抗体、ポリ
クローナル抗体のいずれも適用できる。モノクロール抗
体を用いる時は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のように繰
り返し構造をもつタンパク質や、ＣＡ１９−９抗原のよ
うに分子内にエピトープを複数持つ抗原に対してはモノ
クローナル抗体は１種類以上で使用できる。また、認識
エピトープの異なるものを２種類以上組み合わせても使
用できる。

【００１３】一方、抗原としては、たとえばタンパク
質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂質、花粉、
遺伝子工学的に産生された組換えタンパク質、薬物など
種々のものが挙げられる。即ち、本発明で言う「抗原」
とは、人、あるいは動物に対し抗体産生を惹起する能力
のあるすべての物質のうち、例えば診断等特別の目的の
下に選択された単一あるいは複数の物質、ないしはそれ
らを含有する混合物を指す。

【００１４】一般的に担持される抗体または抗原の量
は、用いる不溶性担体粒子の表面積、官能基量等により
異なるが、通常担体粒子１ｇあたり１ｍｇ〜５００ｍ
ｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇである。本発明で
使用される不溶性蛍光色素標識粒子において、標識色素
としては蛍光色素であればいずれも使用できる。例え
ば、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマ
リウム（Ｓｍ）などの希土類キレートや、フィコシアニ
ン、フィコエリスリンなどのフィコビリプロテイン、フ
ルオレッセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレ
ッド、４−メチルウンベリフェリン、７−アミノ−４−
メチルクマリンなどが用いられる。

【００１５】色素標識をおこなう不溶性担体粒子として
は、反応させる時に用いる液体媒体に実質的に不溶性
で、０．０５〜５μｍ、好ましくは０．１〜１μｍの平
均粒径を有するものが用いられる。担体粒子の材質は上
記不溶性磁性粒子で述べたものと同様に、ポリスチレ
ン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、
ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレ
ンテレフタレートなどの疎水性重合体、ポリアクリルア
ミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、
ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリ
レート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、
ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ
（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエ
チレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性
重合体、またはそれぞれのモノマーの２−４種程度の共
重合体などのラテックス、セラチン、リポソームに加え
て、赤血球のような生体成分、金コロイドのような金属
コロイド粒子等が用いられる。

【００１６】不溶性担体粒子に蛍光色素を担持させる方
法としては、粒子表面の官能基を利用して、蛍光色素を
化学的に結合させる方法、粒子を重合して合成する際
に、色素を加えて粒子内部に封じ込める方法、粒子内部
または表面に物理的に吸着、封入させる方法、あらかじ
め、タンパク質、ペプチドなどと物理的または化学的に
色素を結合させておいてからそのタンパク質、ぺプチド
を粒子に固定化する方法などがある。たとえば、特開昭
５４−１０１４３９号公報には希土類キレートをＴＯＰ
Ｏ（トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド）との協同
抽出法を利用して有機高分子のラテックスの内部に閉じ
込める方法が述べられている。これに従って作製した標
識粒子は標識強度、安定性共に良好である。

【００１７】蛍光微粒子には、抗体（ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体いずれも可）または抗原が前述
のとおり物理的または化学的に固定化される。さらに、
測定しようとする物質が抗体の場合、抗体の免疫グロブ
リンクラスと特異的に反応する物質も固定化される。免
疫グロブリンクラスと特異的に反応する物質とは、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはそれらの
抗体軽鎖部分に対する抗体、プロテインＡまたは補体成
分の一種であるＣ１ｑ等のように、ある種の抗体分子の
特徴を選択的に認識して結合する能力を有する物質を言
う。不溶性担体粒子に標識色素と上記抗体、抗原等を担
持する順序には特に制限はないが、標識色素を担持した
後、抗体、抗原等を担持するのが好ましい。一般的に担
持される抗体または抗原の量は、上記不溶性磁性粒子の
場合と同様、用いる不溶性担体粒子の表面積、官能基量
等により異なるが、通常担体粒子１ｇあたり１ｍｇ〜５
００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇである。不
溶性磁性粒子および不溶性蛍光色素標識粒子に担持させ
る物質の組合せの一例としては、測定しようとする物質
が抗原の場合、以下のものが挙げられる。

【００１８】

【表１】

【００１９】上記において、磁性粒子どうしの凝集反応
を避けることを考慮すると、不溶性磁性粒子に担持させ
る物質としては、ポリクローナル抗体よりもモノクロー
ナル抗体を用いる方が好ましい。不溶性蛍光色素標識粒
子に担持させる物質としては、より特異性の高い測定が
実施できるという点ではモノクローナル抗体を用いる方
が好ましい。しかし、抗体の力価はモノクローナル抗体
よりはポリクローナル抗体の方が高いことがあるため、
不溶性蛍光色素標識粒子には、ポリクローナル抗体を用
いた方が有利なこともある。一方、測定しようとする物
質が抗体の場合、以下の組合せが一例として挙げられ
る。

【００２０】

【表２】

【００２１】上記（ａ) の場合、不溶性磁性粒子に固定
化した抗原と検体中の抗体との抗原・抗体反応により磁
性粒子の凝集塊を生じる。検体中の抗体はＩｇＧ分子の
場合、２カ所ある結合部位で磁性粒子上の抗原と結合し
ていることが多いため、不溶性蛍光色素標識粒子に抗原
を担持させていても担体は結合できなくなり、反応性が
劣る場合がある。また、不溶性蛍光色素標識粒子にプロ
テインＡを用いた場合は、ＩｇＧ分子とのみ結合するの
で、例えばＢ型肝炎の感染とマーカーとして使用される
抗ＨＢｃ抗体のＩｇＭ型抗体を検出する場合には使用で
きない。また、（ｂ) 、（ｃ) の場合、不溶性蛍光色素
標識粒子に担持させる担体（モノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体) としては、抗ヒトＩｇＧ、抗ヒト
ＩｇＭ、抗ヒトＩｇＥ等の免疫グロブリンと特異的に反
応する物質が使用される。

【００２２】次に本発明の具体的な測定方法について説
明する。まず測定しようとする抗原又は抗体を含むと考
えられる試料溶液と、該抗原又は抗体に対する抗体又は
抗原を担持させた不溶性磁性粒子（第１試薬) とを反応
容器の液体媒体中で混合し反応させる（第一反応) 。反
応開始時の混合は十分に行う必要があるが、均一に混合
された後は混合を止め放置して反応させてもよい。反応
は一般の免疫化学反応と同様にｐＨ５〜１０、好ましく
はｐＨ７〜９にて行う。温度については、２〜５０℃の
範囲で実施可能であるが、望ましくは室温乃至は３７〜
４０℃で反応させる。反応時間は、反応直後から１昼夜
まで任意であるが、感度、操作性を考慮して、通常３〜
６０分の範囲で設定される。これらの反応条件は、以降
の工程についても同様である。

【００２３】目的のｐＨを維持するために、通常緩衝液
が用いられる。緩衝液としては、例えばリン酸、トリス
（ヒドロキシメチル) アミノメタン等が用いられるが、
中性から弱アルカリ性で常用される殆どの緩衝液が使用
可能である。多くの場合、非特異反応を避けるために、
塩化ナトリウム等の塩類及び牛血清アルブミン等のタン
パク質が添加される。この時、不溶性磁性粒子は反応液
に対して０．０００１〜１重量％、好ましくは０．００
１〜０．１重量％となるように使用される。不溶性磁性
粒子と試料とを混合すると、試料中に含まれる抗原また
は抗体が粒子表面上の抗体または抗原と結合する。

【００２４】次いで、磁場の作用により、不溶性磁性粒
子を反応液から分離し、反応容器壁に付着させる。残存
する反応液を除いた後、必要に応じて洗浄工程（適当な
洗浄液を加え、攪拌し、直ちに磁場を付与して分離後、
溶液を除く) を数回繰り返す。その後、分離した不溶性
磁性粒子と第一反応と同一の測定しようとする抗原又は
抗体に対する抗体又は抗原を担持させた不溶性蛍光色素
標識粒子（第２試薬)とを混合し第一反応と同様にして
液体媒体中で反応させる（第二反応) 。不溶性蛍光色素
標識粒子も、上記の不溶性磁性粒子と同様に緩衝液に懸
濁させて使用される。このとき不溶性蛍光色素標識粒子
は反応液中に０．００００１〜０．１重量％、好ましく
は０．０００１〜０．０１重量％で用いられる。

【００２５】不溶性磁性粒子と不溶性蛍光色素標識粒子
とを混合すると上記第一反応で不溶性磁性粒子と結合し
た抗原又は抗体が、蛍光粒子表面上の抗体又は抗原ある
いは抗体の免疫グロブリンと特異的に反応する物質と結
合する。次いで磁場の作用により不溶性磁性粒子を反応
液から分離し反応容器壁に付着させる。残存する反応液
を除いた後、必要に応じて洗浄工程を数回繰り返す。そ
の後、分離した不溶性磁性粒子に最終分散液を加え、懸
濁液として、該溶液に含まれる不溶性蛍光色素標識粒子
の量を、蛍光色素に固有の励起光を照射し、放出される
蛍光強度を計測することにより測定する。例えば、Ｅｕ
キレートを標識色素とした場合、励起光は３００〜３８
０ｎｍまたは２４０〜２７０ｍｍの紫外光であり、蛍光
は６００〜６３０ｎｍ（６１５ｎｍに極大値を有する)
である。

【００２６】第二反応後の分離により、試料中の抗原又
は抗体を介して不溶性磁性粒子と結合した不溶性蛍光色
素標識粒子も一緒に分離されているので、蛍光標識粒子
の量を測定することにより、不溶性磁性粒子および不溶
性蛍光標識粒子に担持された抗体または抗原と試料中の
抗原又は抗体との反応の度合いを容易に知ることができ
る。即ち、各粒子に担持された抗体又は抗原と特異的に
反応する物質と試料中の抗原又は抗体の反応が強い程、
蛍光強度は大きくなる。

【００２７】例えば、上記表−２中（ｂ），（ｃ）にお
いて、不溶性蛍光色素標識粒子に抗ヒトＩｇＧ、抗ヒト
ＩｇＭ、抗ヒトＩｇＥなどの抗体の免疫グロブリンクラ
スと特異的に反応する物質（モノクローナル抗体、ポリ
クローナル抗体いずれも可)を担持させた場合は、測定
しようとする抗体の濃度が増加すると蛍光強度が大きく
なる。抗原または抗体を定量する場合は、予め抗原又は
抗体濃度既知品を、或は抗原又は抗体基準品を試料とし
て測定を行い、得られた定量値を試料の抗原又は抗体濃
度に対して図示すれば該抗原又は抗体の検量線が得られ
るので、濃度未知試料の反応定量値から該抗原又は抗体
の濃度が求められる。

【００２８】磁場のかけ方に関しては、第一反応後の不
溶性磁性粒子を約１〜３分程度で、また、同様に第二反
応後の不溶性蛍光色素標識粒子と結合した不溶性磁性粒
子も約１〜３分程度で分離できるような磁場の強度及び
反応系の形状が好ましい。分離に要する時間が短すぎる
と、一般に感度、再現性の低下を招き、長すぎると操作
性を悪化させる。こうした理由から反応系の大きさは比
較的小さい方が扱い易い。９６穴マイクロプレートなど
は個々のウェルのサイズは小さく、ウェル間の隙間に小
磁石を置けば、マイクロプレートを利用したＥＩＡと同
様にマイクロプレートリーダを用いて容易に抗原又は抗
体を定量できるので本発明の実施に適した反応容器のた
めの材料である。また、ポリスチレン、アクリルなどの
プラスチックや、ガラスで作成したチューブ、キュベッ
トなども本発明に適した反応容器のための材料である。
磁石としては、永久磁石、電磁石等を使用する。

【００２９】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
なお、以下の実施例において使用した洗浄液および分散
液の組成はすべて同一で、２０ｍＭトリス、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５から
なる。

【００３０】実施例１ポリクローナル抗体／ポリクローナル抗体平均粒径１．０９μｍの磁性体含有ポリスチレンラテッ
クス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン
社) に、抗ＡＦＰ抗体（ウサギ) を物理吸着法により固
定化した後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ) で処理するこ
とにより粒子を安定化させ、緩衝液に０．０２５％の濃
度で懸濁させＭｇラテックス試薬を作製した。

【００３１】希土類キレートのＥｕ−ＴＴＡ（テノイル
トリフルオロアセトン) 化合物（イーストマンコダック
社) １×１０^-4モルとＴＯＰＯ（トリオクチルホスフィ
ンオキシド) （同仁化学) ２×１０^-4モルをアセトン４
０ｇに溶解した後、平均粒径０．２１２μｍのポリスチ
レンラテックス（Ｓｅｒａｄｙｎ社) ３ｇを水４０ｍｌ
に懸濁させたものを混合し、エバポレーターによりアセ
トンを除去することにより、ラテックス粒子にＥｕ−キ
レート化合物をＴＯＰＯと協同抽出し、Ｅｕキレート標
識ラテックス（以下、Ｅｕラテックスとする。) を作製
した。

【００３２】ＥｕラテックスにもＭｇラテックスと同様
に、抗ＡＦＰ抗体（ウサギ) を固定化し、ＢＳＡで処理
し、緩衝液に０．００２５％の濃度で懸濁させＥｕラテ
ックス試薬を作製した。ヒトＡＦＰ標準液をトリス緩衝
液で希釈して、０，０．１，１，１０，１００ｎｇ／ｍ
ｌ標準液を作製した。標準液３０μｌ、ＢＳＡ含有トリ
ス緩衝液２００μｌ、上記Ｍｇラテックス試薬４０μｌ
を加えた後攪拌し、８分間免疫反応を行わせた。

【００３３】次に、磁石を用いて反応セル中のＭｇラテ
ックスを反応液から分離し、上清を除いた後、緩衝液２
００μｌ、上記Ｅｕラテックス試薬４０μｌを加えて攪
拌し、８分間免疫反応を行わせた。磁石を用いて反応セ
ル中のＭｇラテックスを反応液から分離した。上清から
１００μｌ分取し、未結合サンプルとした。

【００３４】残りの反応液を除去し、洗浄液を２００μ
ｌ加え、攪拌し、直ちに磁石で分離する。上清を廃棄
し、洗浄液を２００μｌ加え攪拌する。この分離、洗浄
工程を３回繰り返した後分離したＭｇラテックスに最終
分散液２００μｌを加え、攪拌した後１００μｌを分取
して結合サンプルとした。未結合／結合サンプルに含ま
れるＥｕラテックスの量を、６１５ｎｍの蛍光を計測す
ることにより測定した。時間分解蛍光測定装置Ｃｙｂｅ
ｒＦｌｕｏｒ６１５（ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ社) を
用いて測定した結果を図１（未結合サンプル) および図
２（結合サンプル) に示した。標準液中のＡＦＰ濃度が
高くなるに従って、未結合サンプルでは蛍光強度の減
少、結合サンプルでは蛍光強度の増加が観測された。

【００３５】実施例２モノクローナル抗体／モノクローナル抗体実施例１で使用したＭｇラテックスに、抗ＴＳＨモノク
ローナル抗体（マウス) をカルボジイミドを用いて、化
学結合法により固定化した後、牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ) で処理することにより粒子を安定化させ、緩衝液に
０．０２％の濃度で懸濁させＭｇラテックス試薬を作製
した。希土類キレートのＥｕ−ＮＴＡ（ナフトイルトリ
フルオロアセトン) 化合物（自製) １×１０^-4モルとＴ
ＯＰＯ（トリオクチルホスフィンオキシド) （同仁化
学) ２×１０^-4モルをアセトン４０ｇに溶解した後、平
均粒径０．６５３μｍのポリスチレンラテックス（日本
合成ゴム社) ３ｇを水４０ｍｌに懸濁させたものを混合
し、エバポレーターによりアセトンを除去することによ
り、ラテックス粒子にＥｕ−キレート化合物をＴＯＰＯ
と協同抽出し、Ｅｕキレート標識ラテックス（以下、Ｅ
ｕラテックスとする。) を作製した。

【００３６】ＥｕラテックスにもＭｇラテックスと同様
の方法で、Ｍｇラテックス試薬に固定化した抗体とは、
異なるエピトープを認識する抗ＴＳＨモノクローナル抗
体（マウス) を固定化し、ＢＳＡで処理し、緩衝液に
０．００３％の濃度で懸濁させＥｕラテックス試薬を作
製した。ヒトＴＳＨ標準液（Ｚｙｍｅｄ社) をトリス緩
衝液で希釈して、０，１，３，９，２７ｍＩＵ／ｌ標準
液を作製した。標準液１００μｌ、ＢＳＡ含有トリス緩
衝液１５０μｌ、上記Ｍｇラテックス試薬４０μｌを加
えた後攪拌し、１０分間免疫反応を行わせた。次に、磁
石を用いて反応セル中のＭｇラテックスを反応液から分
離し、上清を除いた後、緩衝液２００μｌ、上記Ｅｕラ
テックス試薬４０μｌを加えて攪拌し、１０分間免疫反
応を行わせた。

【００３７】磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックス
を反応液から分離した。上清から１００μｌを分取し、
未結合サンプルとした。残りの反応液を除去し、洗浄液
を２００μｌ加え、攪拌し、直ちに磁石で分離する。上
清を廃棄し、洗浄液を２００μｌ加え攪拌する。この分
離、洗浄工程を３回繰り返した後分離したＭｇラテック
スに最終分散液２００μｌを加え、攪拌した後１００μ
ｌを分取して結合サンプルとした。未結合／結合サンプ
ルに含まれるＥｕラテックスの量を、６１５ｎｍの蛍光
を計測することにより測定した。時間分解蛍光測定装置
ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ６１５（ＣｙｂｅｒＦｌｕｏ
ｒ社) を用いて測定した結果を図３（未結合サンプル)
および図４（結合サンプル) に示した。標準液中のＴＳ
Ｈ濃度が高くなるに従って、未結合サンプルでは蛍光強
度の減少、結合サンプルでは蛍光強度の増加が観測され
た。

【００３８】実施例３抗原／ポリクローナル抗体実施例１で使用したＭｇラテックスに、遺伝子組換え法
により産生したＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ) をカル
ボジイミドを用いて、化学結合法により固定化した後、
牛血清アルブミン（ＢＳＡ) で処理することにより粒子
を安定化させ、緩衝液に０．０５％の濃度で懸濁させＭ
ｇラテックス試薬を作製した。実施例２で作製したＥｕ
ラテックスにＭｇラテックスと同様に化学結合法で、抗
ヒトＩｇＧ抗体（ウサギ，ＰｅｌＦｒｅｅｚ社) を固
定化し、ＢＳＡで処理し、緩衝液に０．００３％の濃度
で懸濁させＥｕラテックス試薬を作製した。抗ＨＢｓＡ
ｇ抗体標準液（ヒト、自製) をトリス緩衝液で希釈し
て、０．３７，１５０，６００ｍＩＵ／ｍｌ標準液を作
製した。

【００３９】標準液３０μｌ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液
２００μｌ、上記Ｍｇラテックス試薬４０μｌを加えた
後攪拌し、３０分間免疫反応を行わせた。次に、磁石を
用いて反応セル中のＭｇラテックスを反応液から分離
し、上清を除いた後、緩衝液２００μｌ、上記Ｅｕラテ
ックス試薬４０μｌを加えて攪拌し、３０分間免疫反応
を行わせた。磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックス
を反応液から分離した。残りの反応液を除去し、洗浄液
を２００μｌ加え、攪拌し、直ちに磁石で分離する。上
清を廃棄し、洗浄液を２００μｌ加え攪拌する。この分
離、洗浄工程を３回繰り返した後分離したＭｇラテック
スに最終分散液２００μｌを加え、攪拌した後１００μ
ｌを分取して結合サンプルとした。

【００４０】結合サンプルに含まれるＥｕラテックスの
量を、６１５ｎｍの蛍光を計測することにより測定し
た。時間分解蛍光測定装置ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ６１
５（ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ社) を用いて測定した結果
を図５に示した。標準液中の抗ＨＢｓＡｇ抗体濃度が高
くなるに従って、蛍光強度の増加が観測された。実施例４抗原／抗原平均粒径０．７μｍの磁性体含有ポリスチレンラテック
ス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社)
および実施例２で作製したＥｕラテックスに、遺伝子組
換え法により産生したＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢ
ｃＡｇ）（化学及血清療法研究所）をカルボジイミドを
用いて、化学結合法により固定化した後、ＢＳＡで処理
することにより粒子を安定化させ、緩衝液にそれぞれ、
０．０５％、０．００３％の濃度で懸濁させ、Ｍｇラテ
ックス試薬、Ｅｕラテックス試薬を作製した。ＲＩＡ法
で抗ＨＢｃＡｇ抗体を測定済の、陽性検体、陰性検体そ
れぞれ２検体を用いて、特異性を調べた。検体１０μ
ｌ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液２６０μｌ、上記Ｍｇラテ
ックス試薬４０μｌを加えた後撹拌し、５分間免疫反応
を行わせた。

【００４１】次に、磁石を用いて反応セル中のＭｇラテ
ックスを反応液から分離し、上清を除いた後、緩衝液２
５０μｌ、上記Ｅｕラテックス試薬４０μｌを加えて攪
拌し、１０分間免疫反応を行わせた。磁石を用いて反応
セル中のＭｇラテックスを反応液から分離し、残りの反
応液を除去し、洗浄液を３００μｌ加え、攪拌し、直ち
に磁石で分離する。この分離、洗浄工程を３回繰り返し
た後分離したＭｇラテックスに最終分散液２００μｌを
加え、攪拌した後１００μｌを分取して結合サンプルと
した。結合サンプルに含まれるＥｕラテックスの量を、
６１５ｎｍの蛍光を計測することにより測定した。時間
分解蛍光測定装置ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ６１５（Ｃｙ
ｂｅｒＦｌｕｏｒ社) を用いて測定した結果を図６に
示した。陰性検体では低い蛍光強度、陽性検体では高い
蛍光強度が測定された。

【００４２】

【発明の効果】本発明方法によれば、磁性粒子および蛍
光粒子を用いることにより、迅速、簡便にＢ／Ｆ分離が
実施でき、かつ、通常のＦＩＡよりも測定感度を上昇さ
せて抗原、抗体反応を測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で第二反応後、磁場の付与による分離
を行った後の残存する反応液（未結合サンプル) の蛍光
強度とＡＦＰ濃度との関係を示した図である。

【図２】実施例１で、第二反応後、磁場の付与により分
離された粒子（結合サンプル)の蛍光強度とＡＦＰ濃度
との関係を示した図である。

【図３】実施例２で、第二反応後、磁場の付与による分
離を行った後の残存する反応液（未結合サンプル) の蛍
光強度とＴＳＨ濃度との関係を示した図である。

【図４】実施例２で、第二反応後、磁場の付与により分
離された粒子（結合サンプル)の蛍光強度とＴＳＨ濃度
との関係を示した図である。

【図５】実施例３で、第二反応後、磁場の付与により分
離された粒子（結合サンプル)の蛍光強度と抗ＨＢｓＡ
ｇ抗体濃度との関係を示した図である。

【図６】実施例４で、抗ＨＢｃＡｇ抗体が陽性の検体お
よび陰性の検体における、第二反応後の磁場の付与によ
り分離された粒子（結合サンプル) の蛍光強度を表す図
である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の工程からなる抗原・抗体反応の測
定方法。（ａ）測定しようとする抗原又は抗体に対する抗体又は
抗原を担持させた不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、
測定しようとする抗原又は抗体とを反応容器の液体媒体
中で反応させる。（ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。（ｃ）工程（ａ）と同一の測定しようとする抗原又は抗
体に対する抗体又は抗原を担持させた不溶性蛍光色素標
識粒子からなる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁に
付着した該不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応させ
る。（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性蛍光色素標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子
と反応した不溶性蛍光色素標識粒子の蛍光強度を測定す
る。
【請求項２】ポリクローナル抗体を担持させた不溶性
磁性粒子およびポリクローナル抗体を担持させた不溶性
蛍光色素標識粒子を用いる請求項１記載の測定方法。
【請求項３】モノクローナル抗体を担持させた不溶性
磁性粒子およびモノクローナル抗体を担持させた不溶性
蛍光色素標識粒子を用いる請求項１記載の測定方法。
【請求項４】モノクローナル抗体を担持させた不溶性
磁性粒子およびポリクローナル抗体を担持させた不溶性
蛍光色素標識粒子を用いる請求項１記載の測定方法。
【請求項５】下記の工程からなる抗原・抗体反応の測
定方法。（ａ）測定しようとする抗体に対する抗原を担持させた
不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、測定しようとする
抗体とを反応容器の液体媒体中で反応させる。（ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。（ｃ）測定しようとする抗体の免疫グロブリンクラスと
特異的に反応する物質を担持させた不溶性蛍光色素標識
粒子からなる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁に付
着した該不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応させる。（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性蛍光色素標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子
と反応した不溶性蛍光色素標識粒子の蛍光強度を測定す
る。
【請求項６】抗体の免疫グロブリンクラスと特異的に
反応する物質がポリクロ−ナル抗体である請求項５に記
載の測定方法。