CN113063763B - 一种孔雀石绿的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种孔雀石绿的检测方法，包括将含有配合物Eu(MAA)₃Phen的试纸，在20‑35℃环境下浸入待测样品的溶液中4‑5min，取出试纸在紫外灯的照射下与标准比色卡进行对比，所述标准比色卡在紫外灯下显示出所述配合物Eu(MAA)₃Phen的红色荧光，若试纸相对所述标准比色卡红色消褪，则说明样品中含有孔雀石绿，其中，所述配合物Eu(MAA)₃Phen中，MAA为甲基丙烯酸，Phen为邻菲罗啉。本发明根据试纸片颜色的变化对比，可实现对孔雀石绿的实时、可视化、半定量检测，这种荧光试纸片便于携带，使用方法简单，可实现溶液中孔雀石绿的快速检测，为孔雀石绿的现场筛查分析和半定量检测提供了可靠的方法。

Description

一种孔雀石绿的检测方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其是一种孔雀石绿的检测方法。

背景技术

孔雀石绿，分子式为C23H25ClN2，是人工合成的有机化合物，是一种有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀真菌、杀细菌、杀寄生虫的药物，长期超量使用可致癌，无公害水产养殖领域国家明令禁止添加。

水产品中孔雀石绿的常规检测方法较为复杂，其检测所使用的仪器设备较为高端，检测时间较为漫长，例如：中国专利申请CN101566574A公开了一种水体及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留的快速检测方法，其是将待测样品和提取剂I振荡混合均匀后，加入提取剂II振荡混合后静置，取上清液加入到富集柱中，观察富集柱中最下层的显色剂颜色变化，若形成绿色环带，则判断待测样品中含有孔雀石绿或无色孔雀石绿；提取剂I为乙腈、二氯甲烷、正己烷和对甲苯磺酸的混合液；提取剂II为二氧化铅和酸性氧化铝的混合物；待测样品为待检测水体样品或待检测水产品样品。上述方法采用柱层析的方式，提取静置都要花时间等待，这就导致许多企业或基层检测部门不能快速的对水产品中的孔雀石绿进行检测。

中国专利申请CN112067813A公开了一种孔雀石绿的检测试纸，包括PVC底板、样品垫、胶体金垫、NC膜和吸水垫，样品垫、胶体金垫、NC膜和吸水垫由左往右依次固定设置在PVC底板的上表面，且样品垫的一端覆盖在胶体金垫的顶侧，胶体金垫在远离与样品垫连接处的一端覆盖在NC膜的顶侧，NC膜在远离与胶体金垫连接处的一端设置在吸水垫的底侧。所述NC膜上喷有检测线(T)和质控线(C)，所述检测线和质控线成分分别为BSA偶联抗原和羊抗鼠IgG，且所述BSA偶联抗原的浓度0.1-0.15mg/m L，用量为0.6-0.7μL/cm，所述羊抗鼠IgG浓度为0.3-0.5mg/mL，用量为0.6-0.7μL/cm。所述胶体金垫内含有特异性单克隆抗体，且所述特异性单克隆抗体能与孔雀石绿结合。

具体的孔雀石绿的检测方法，包括以下步骤：S1：选取一定量的组织样本，并用均质器均质；S2：称取2～3gS1中均质后的组织样本，并均质于50ml的离心管中；S3：用微量移液器向离心管中加入1.5～3.0ml提取剂1，再加入8ml丁晴和提取剂2，震荡混匀3～5分钟后，室温下4000r/min离心5min；S4：取S3中上层待测液体3～4ml与5ml的离心管中，加入100uL氧化剂，颠倒混匀10～15s，并于60～65℃下，利用氮气或空气将溶剂吹干；S5：向吹干的离心管中用微量移液器加入0.3～0.5mlMG复溶液和500uL正己烷，并于室温下4000r/min离心1～3min或静止至明显分层，取下层液体150uL用于检测；S6：从原包装袋中取出试纸，并水平放置于观察者正面；S7：通过微量移液器吸取待检样品溶液70～90uL与试纸的样品垫上，并在加样后开始计时，待8～10min后判断测试结果。

上述检测方法是目前孔雀石绿检测的主要方法，是基于竞争抑制反应原理的胶体金免疫层析技术。主要制备步骤包括胶体金的制备、胶体金标记抗体的制备、样品垫的筛选、金标垫的选择，硝酸纤维膜的制备、吸水垫的选择，试纸条的组装等，步骤繁琐，需要特定的抗原抗体，某些抗原抗体的合成现在还较困难，技术不够成熟，且试纸条的好坏很大程度上取决于原材料的质量(如氯金酸)。在室温下胶体金易出现沉淀，需在2℃-8℃条件下保存，合成质量好的胶体金较困难，在实际样品的检测中，“基质效应”会大大降低试纸条的性能。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有的孔雀石绿的检测方法中的不足，提供一种新的检测方法，以实现能够对孔雀石绿进行快速检测，在没有大型高效的检测条件下仍可以快速检测孔雀石绿的含量，大幅度减少检测所需要的时间。该方法解决了以往免疫层析法可能会出现假阳性的问题，针对性的提高了检测的准确性。

发明人发现，孔雀石绿可以猝灭稀土配合物荧光的特性，但并不是所有的稀土配合物都可以用来检测孔雀石绿，只有发射波长为618nm处的稀土配合物才可以对孔雀石绿进行检测，同时还要避免其他的一些物质对稀土配合物进行反应影响最终的检测结果

Eu(MAA)₃Phen是一种稀土红光材料，通常作为发光材料运用在光学设备、分子印迹及传感器制作上。发明人发现Eu(MAA)₃Phen可运用于检测孔雀石绿的过程如下：

稀土Eu(III)离子的发射波长在618nm，刚好与孔雀石绿的吸收波长相等，两者相互靠近可以通过荧光共振能量转移使Eu(III)的荧光猝灭，但Eu(III)的荧光强度有限，查阅文献发现形成配合物后可以大大增强其荧光，因此发明人选择甲基丙烯酸MAA为配体，通过羧酸根与Eu(III)配位，选择甲基丙烯酸的目的是其与甲基丙烯酸的配位能力较强，其次分子大小适当，使配合物有一定的溶解性。邻菲罗林phen是螯合配体，加入的目的是使Eu(III)的配位达到饱和，因为Eu(III)是高配位的，只加入MAA则产物中有一部分Eu(III)与水配位，这会降低荧光强度。配合物Eu(MAA)₃Phen化学性质很稳定，比生物抗体好很多，可以制备周期短，成本低。

现有技术中也有其他稀土配合物与孔雀石绿的关联研究，例如YVO4：Eu，发明人认为：YVO4：Eu不能与试纸检测方式结合并进行准确的检测，原因如下：首先，虽然两者都是利用荧光猝灭效应来对孔雀石绿进行分析检测，但稀土配合物Eu(MAA)₃Phen的发射光谱的强度是稀土配合物YVO4：Eu的7～8倍，这就意味着在检测孔雀石绿时使用Eu(MAA)₃Phen比使用YVO4：Eu的检测结果更为明显，方便肉眼判断。其次，配合物Eu(MAA)₃Phen是分子形态，相对于YVO4：Eu的纳米团簇形态分散性更好，能更有效地分散在试纸上，这对分析的准确性非常重要。最后，在日常使用的水中可能会含有一些金属离子，如Cu²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺等会影响到稀土配合物YVO4：Eu的荧光强度，会对其最终的检测结果产生误差，即出现误判。综上所述使用稀土配合物Eu(MAA)₃Phen来检测孔雀石绿的效果是最好的。

本发明提供的孔雀石绿的检测方法，是将含有配合物Eu(MAA)₃Phen的试纸，在20-35℃环境下浸入待测样品的溶液中4-5min，取出试纸在紫外灯的照射下与标准比色卡进行对比，标准比色卡是空白试纸，为红色，若样品中孔雀石绿含量越高，则试纸褪色程度越明显，则说明样品中含有孔雀石绿，其中，所述配合物Eu(MAA)₃Phen中，MAA为甲基丙烯酸，Phen为邻菲罗啉。若样品中不含有孔雀石绿，则试纸在紫外灯下显示红色。

原理如下：不加入孔雀石绿，试纸(空白试纸)在紫外灯下显红色，这红色是配合物发射的荧光，加入孔雀石绿后，红色消退，即荧光减弱。在紫外灯下，显示出淡蓝色，蓝色是由于紫外灯的背景光为蓝色，试纸原有的红色减弱，因此显示出部分紫外灯本身的颜色。

如图1所示，为制作好的含稀土配合物荧光试纸片在紫外灯照射下的效果。试纸条的制备：用打孔机将微孔滤膜裁剪成直径为6mm的圆形纸片，在优化条件下，实验选择以微孔滤膜为材料，无水乙醇为溶剂，配合物浓度为0.04mg/mL，试纸片在配合物乙醇溶液中浸泡15min。图中从左到右分别为加入0,1,2,3,4,5,6μmol L^-1孔雀石绿MG，随着MG浓度的增加，试纸片的荧光强度不断减弱，说明此方法可以用于检测MG的快速检测。图中所示试纸条也可以作为比对标准，根据特定颜色对应的圆形纸片，判断未知样品大致的孔雀石绿含量范围。

其中，20-35℃环境为室温环境，以保证颜色反应的速度在预期范围。浸入待测样品的溶液中4-5min，以保证配合物与目标的结合度。在试纸浸泡在样品溶液5min后取出试纸除湿润以外无其他变化，在自然光下肉眼观察没有什么变化，而在紫外灯的照射下，试纸会随着样品中孔雀石绿的含量的增加红色逐渐褪去，含有孔雀石绿时试纸会由检测前的红色变为蓝色，其原理，在浸泡过程中孔雀石绿与稀土配合物Eu(MAA)₃Phen结合，在浸泡5min后达到吸附的最大值，在此时去利用紫外灯去照射就会发现与试纸条结合的孔雀石绿会抑制Eu(MAA)₃Phen荧光强度，导致荧光猝灭现象的发生。因此，据此变色现象可以判定样品中含有孔雀石绿。

本发明中，标准比色卡优选是通过定向试纸条定量的加入孔雀石绿，确定在不同浓度下的孔雀石绿造成试纸条的不同程度的荧光猝灭。通过对比已知浓度的标准比色卡来大致确定孔雀石绿的浓度范围，以便于现场做到对孔雀石绿的快速检测。

具体方案如下：

一种配合物Eu(MAA)₃Phen在检测孔雀石绿上的用途，所述配合物Eu(MAA)₃Phen中，MAA为甲基丙烯酸，Phen为邻菲罗啉。

进一步的，准备待测样品的溶液，在20-35℃环境下将含有所述配合物Eu(MAA)₃Phen的试纸浸入所述待测样品的溶液中4-5min，取出试纸在紫外灯的照射下与标准比色卡进行对比，所述标准比色卡在紫外灯下显示出所述配合物Eu(MAA)₃Phen的红色荧光，若试纸相对所述标准比色卡红色消褪，则说明样品中含有孔雀石绿。

本发明还保护一种孔雀石绿的检测方法，将含有配合物Eu(MAA)₃Phen的试纸，在20-35℃环境下浸入待测样品的溶液中4-5min，取出试纸在紫外灯的照射下与标准比色卡进行对比，所述标准比色卡在紫外灯下显示出所述配合物Eu(MAA)₃Phen的红色荧光，若试纸相对所述标准比色卡红色消褪，则说明样品中含有孔雀石绿，其中，所述配合物Eu(MAA)₃Phen中，MAA为甲基丙烯酸，Phen为邻菲罗啉。

进一步的，所述含有所述配合物Eu(MAA)₃Phen的试纸的制备方法是：将滤膜浸泡在配合物Eu(MAA)₃Phen的无水乙醇溶液中，Eu(MAA)₃Phen的浓度为0.03-0.05mg/mL，浸泡时间为10-20分钟，之后取出烘干，得到含有所述配合物Eu(MAA)₃Phen的试纸。

进一步的，将滤膜浸泡在配合物Eu(MAA)₃Phen的无水乙醇溶液中，Eu(MAA)₃Phen的浓度为0.04mg/mL，浸泡时间为15分钟，之后取出烘干，得到含有所述配合物Eu(MAA)₃Phen的试纸。

进一步的，所述标准比色卡通过定向试纸条定量的加入孔雀石绿，以确定在不同浓度下的孔雀石绿造成试纸条的不同程度的荧光猝灭，体现出相应的颜色，通过定向的颜色渐变实现快速比对，确定样品中孔雀石绿的含量范围。

进一步的，检出的孔雀石绿的检出限为0.5μmol/L。

本发明还保护一种孔雀石绿的检测试纸，所述孔雀石绿的检测试纸包括滤膜，所述滤膜上含有配合物Eu(MAA)₃Phen，其中MAA为甲基丙烯酸，Phen为邻菲罗啉。

有益效果：

本发明中试纸条的制作方法简单，制成成本较低，检测速度快，检测的方法简单，可在缺少大型试验设备的情况下进行对孔雀石绿的快速检测，为孔雀石绿的现场筛查分析和半定量检测提供了一个简单可靠的方法。

本发明根据试纸片颜色的变化对比，可实现对孔雀石绿的实时、可视化、半定量检测，这种荧光试纸片制备简单，便于携带，使用方法简单，可实现溶液中孔雀石绿的快速定性检测。

附图说明

图1是含稀土配合物荧光试纸片在紫外灯照射下的效果图。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。

实施例1

稀土配合物是以铕(Eu³⁺)为中心离子，甲基丙烯酸(MAA)和邻菲罗啉(Phen)为配体制作而成的Eu(MAA)₃Phen。

制备配合物Eu(MAA)₃Phen的方法如下：往0.35g Eu₂O₃中加入20mL浓盐酸，加热至出现晶膜，加入20mL无水乙醇溶解，得到EuCl₃无水乙醇溶液。在三口烧瓶中加入510μLMAA、0.36g Phen、20mL无水乙醇，并用浓氨水调节pH值为7±0.5。搅拌下将EuCl₃无水乙醇逐滴加入，升温至60℃持续搅拌反应4h，静置、抽滤并用乙醇洗涤沉淀数次，于50℃真空干燥8h，得到配合物Eu(MAA)₃Phen粉末。稀土配合物溶液是将稀土配合物粉末在75℃无水乙醇中水浴加热至完全溶解制得。

需要说明是，上述方法仅为示例，不构成对配合物Eu(MAA)₃Phen制备方法、来源的限制。

试纸条的制作方法是将微孔滤膜浸泡在浓度为0.04mg/mL的稀土配合物溶液中15分钟后取出烘干，备用。

检测时，将待测样品制成样品溶液，将试纸浸泡在样品溶液中5min，取出试纸条在紫外灯的照射下与标准比色卡进行肉眼对比，所述标准比色卡在紫外灯下显示出所述配合物Eu(MAA)₃Phen的红色荧光，若试纸相对所述标准比色卡红色消褪，则说明样品中含有孔雀石绿。该方法可检出的孔雀石绿检出限为0.5μmol/L。

需要说明的是，标准比色卡可以采用染色技术，获得与配合物Eu(MAA)₃Phen在紫外照射下发射的红色荧光对应的红色，不一定要在标准比色卡上负载配合物Eu(MAA)₃Phen。

另外，本发明中检测采用的样品可以是待检对象溶解获得的样品溶液，无需提取净化。因为本方法通过负载在试纸上配合物荧光的淬灭程度进行检测，由于孔雀石绿的吸收波长与配合物的发射波长相等，对其的猝灭程度很高，因此，基于快速筛查目的时可以不需要提取净化，直接用均质液做样品。

实施例2

取五份新鲜去鳞去骨的鱼肉各5g分别捣碎在50mL离心管中记为1-5号，分别加入含有0，0.25，0.5，1，2μmol/L的孔雀石绿-乙腈溶液11ml，超声波振荡提取2min后再用匀浆机8000r/min匀浆30s，将得到的匀浆分别放入1-5号离心管4000r/min离心5min，将得到的上清液分别倒入新的离心管①-⑤号中。再取11mL的乙腈加入匀浆机清洗匀浆刀头10s，将洗涤液分别倒入1-5号离心管中，用玻璃棒捣碎1-5号离心管中的沉淀物质，并将1-5号离心管用漩涡混匀器振荡30s超声波振荡5min，最后将1-5号管离心5min取上清液倒入①-⑤号管中得到8份含有不同浓度孔雀石绿的加标样品溶液。

取8张试纸条分别浸入这五份样品溶液中，在紫外灯的照射下可以直观观察到试纸条的变化，在0.25μmol/L时已经对比不出与加入0μmol/L的孔雀石绿的荧光强度的不同，而在对比0.25μmol/L与0.5μmol/L时能看出试纸条的变化，说明试纸条对孔雀石绿的检出限为0.5μmol/L。

图1显示了由左到右分别为添加0，0.25，0.5，1，2μmol/L的孔雀石绿的试纸条，可以看到，最左侧红色最深，最右侧红色最浅，过渡过程中，从左到右红色逐渐弱化。

上述已知浓度的试纸条也可以作为标准比色卡，用于快速判读未知样品中孔雀石绿的浓度范围。

对比例1

在实验初期的探索阶段，发明人尝试使用除Eu(III)以外的其他稀土离子配合物材料如Sm(III)、Tb(III)、Dy(III)的配合物，但是效果不太理想，甚至对孔雀石绿没有产生任何的荧光猝灭效应。只有Eu(III)的螯合物在618nm处有发射波长，并与孔雀石绿产生荧光猝灭效应，在检测了其他材料离子配合物的发射波长后发现：Sm(III)的螯合物只有600nm、Tb(III)的配合物只有543nm、Dy(III)的配合物只有573nm，与孔雀石绿的吸收波长相差较大，就无法对其进行下一步的实验，最终发明人才选的Eu(III)作为检测孔雀石绿的研究对象。

发明人还尝试了Eu(III)的其他配合物，如用噻吩甲酰三氟丙酮作为有机配体代替甲基丙烯酸，该配体因为荧光增强效果也很显著，经常被用来与Eu(III)配位。用该配体得到的配合物虽然也有很强的荧光，但由于该配体分子太大，配合物溶解性差，不能很好地分散在试纸上，试纸的发光性能不理想，而且该配体价格比甲基丙烯酸高很多，因此这些稀土配合物无法成功结合试纸检测方式。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (7)

1.一种孔雀石绿的检测方法，其特征在于：将含有配合物Eu(MAA)₃Phen的试纸，在20-35℃环境下浸入待测样品的溶液中4-5min，取出试纸在紫外灯的照射下与标准比色卡进行对比，所述标准比色卡在紫外灯下显示出所述配合物Eu(MAA)₃Phen的红色荧光，若试纸相对所述标准比色卡红色消褪，则说明样品中含有孔雀石绿，其中，所述配合物Eu(MAA)₃Phen中，MAA为甲基丙烯酸，Phen为邻菲罗啉。

2.根据权利要求1所述孔雀石绿的检测方法，其特征在于：所述配合物Eu(MAA)₃Phen用于检测孔雀石绿。

3.根据权利要求1所述孔雀石绿的检测方法，其特征在于：所述含有所述配合物Eu(MAA)₃Phen的试纸的制备方法是：将滤膜浸泡在配合物Eu(MAA)₃Phen的无水乙醇溶液中，Eu(MAA)₃Phen的浓度为0.03-0.05mg/mL，浸泡时间为10-20分钟，之后取出烘干，得到含有所述配合物Eu(MAA)₃Phen的试纸。

4.根据权利要求3所述孔雀石绿的检测方法，其特征在于：将滤膜浸泡在配合物Eu(MAA)₃Phen的无水乙醇溶液中，Eu(MAA)₃Phen的浓度为0.04mg/mL，浸泡时间为15分钟，之后取出烘干，得到含有所述配合物Eu(MAA)₃Phen的试纸。

5.根据权利要求1所述孔雀石绿的检测方法，其特征在于：所述标准比色卡通过定向试纸条定量的加入孔雀石绿，以确定在不同浓度下的孔雀石绿造成试纸条的不同程度的荧光猝灭，体现出相应的颜色，通过定向的颜色渐变实现快速比对，确定样品中孔雀石绿的含量范围。

6.根据权利要求3或4所述孔雀石绿的检测方法，其特征在于：检出的孔雀石绿的检出限为0.5μmol/L。

7.一种孔雀石绿的检测试纸，其特征在于：所述孔雀石绿的检测试纸包括滤膜，所述滤膜上含有配合物Eu(MAA)₃Phen，其中MAA为甲基丙烯酸，Phen为邻菲罗啉。